成年斑马鱼的游泳耐力和游泳行为评估

摘要

成年斑马鱼能够在脊髓损伤后恢复功能，是阐明神经再生先天机制的首要模型系统。在这里，我们将游泳耐力和游泳行为测定描述为脊髓再生的功能读数。

摘要

由于其著名的再生能力，成年斑马鱼是询问先天脊髓再生机制的首要脊椎动物模型。在完全横切脊髓后，斑马鱼将神经胶质桥和轴突延伸到切断的组织上，再生病变近端的神经元，并在受伤后8周内恢复游泳能力。因此，游泳功能的恢复是功能性脊髓修复的中心读数。在这里，我们描述了一组行为测定，以量化封闭游泳隧道内的斑马鱼运动能力。这些方法的目标是提供成年斑马鱼游泳耐力和游泳行为的可量化测量。为了保持游泳耐力，斑马鱼要承受不断增加的水流速度，直到筋疲力尽，并报告疲惫的时间。对于游泳行为评估，斑马鱼受到低流速的影响，并使用鱼的背视图捕获游泳视频。活动百分比、爆发频率和逆流而上的时间提供了游泳行为的可量化读数。我们量化了野生型斑马鱼在受伤前和脊髓切除后的游泳耐力和游泳行为。我们发现斑马鱼在脊髓横断后失去游泳功能，并在受伤后2至6周内逐渐恢复游泳能力。本研究中描述的方法可以应用于成年斑马鱼的神经行为，肌肉骨骼，骨骼肌再生和神经再生研究。

引言

成年斑马鱼主要用于研究神经肌肉和肌肉骨骼发育的机制以及疾病建模^1，2，3。斑马鱼能够有效、自发地修复多种组织，包括大脑、脊髓和骨骼肌^{4，5，6，7}。再生神经肌肉组织和模拟疾病的非凡能力正在吸引越来越多的科学界参与成年斑马鱼研究^1，2，3。然而，虽然斑马鱼幼虫的运动和游泳行为测定是可用的和标准化的，但越来越需要在成鱼中开发类似的方案^{8，9，10，11}。本研究的目的是描述量化成年斑马鱼的游泳耐力和游泳行为的方案。我们在脊髓再生研究的背景下提出了这些方案。然而，这里描述的行为方案同样适用于神经和肌肉再生，神经肌肉和肌肉骨骼发育的研究，以及神经肌肉和肌肉骨骼疾病建模。

斑马鱼在脊髓切除术完全后8周内逆转瘫痪。与再生能力差的哺乳动物不同，斑马鱼表现出功能性脊髓修复所需的促再生免疫，神经元和神经胶质损伤反应^12，13，14。功能性脊髓修复的最终读数是病变组织在受伤后恢复其功能的能力。评估啮齿动物功能再生的一套标准化方法包括运动，运动，感觉和感觉运动测试^15，16，17。在小鼠脊髓损伤中广泛使用的测试包括运动巴索小鼠量表（BMS），前肢运动测试，触觉感觉测试和网格行走感觉运动测试^15，17。与哺乳动物或幼虫斑马鱼系统相比，成年斑马鱼的行为测试不太发达，但非常需要适应组织再生和疾病建模群落不断增长的需求。

完全脊髓横断导致损伤部位尾部完全瘫痪。受伤后不久，瘫痪的动物活动较少，并尽可能避免游泳。为了补偿游泳能力的损失，瘫痪的动物通过过度使用胸鳍（位于病变的喙）来表现出短暂而频繁的爆发。这种补偿性游泳策略会导致快速疲惫和游泳能力下降。随着斑马鱼脊髓的再生，动物在病变尾部恢复了平滑的振荡游泳功能，从而增加了游泳耐力并改善了游泳行为参数。在这里，我们描述了量化斑马鱼在增加水流速度下的游泳耐力和在低水流速度下的游泳行为的方法。

研究方案

Ekkwill和AB品系的成年斑马鱼在华盛顿大学斑马鱼核心设施中饲养。所有动物实验均按照IACUC机构动物协议进行。

注:实验设置示例如图 1A所示。校准盖（定制）、游泳耐力盖（定制）和游泳行为盖（标准封闭式隧道盖）如图 1B所示。实验工作流程如图 2所示。

1. 游泳道准备和校准

1. 用斑马鱼系统水填充游泳隧道和周围的缓冲水（10升过滤水;碱度:50-150毫克/升_CaCO3;pH:6.8-7.5;温度:26-28.5°C;硝酸盐<50毫克/升;亚硝酸盐<0.1毫克/升;盐度<0.5-1克/升）。
2. 用斑马鱼系统水（≈7.5升）填充额外的流通池。定位游泳道和流通池，以允许多余的斑马鱼系统水通过固定在缓冲罐侧面的流出管从缓冲池流入流通池。
3. 隧道和缓冲罐装满后，请执行以下操作。
   1. 将冲洗泵放在缓冲罐内，并用PVC管将其连接到相邻的游泳道。将流通泵放在流通罐内，并将其连接到缓冲罐的壁上。
   2. 打开位于缓冲罐内的冲洗泵和位于流通罐中的流通泵，开始水循环。
      注意:双泵系统将确保连续的水流入游泳道（从冲洗泵）和进入缓冲水箱（从流通泵）。
   3. 清除游道内的任何气泡，以10厘米/秒的间隔逐渐将水流速度从10厘米/秒增加到100厘米/秒。以 10 cm/s 的间隔将速度减小到 0 cm/s。要控制流速，请单击流速控制软件" 速度 "部分中的向上和向下箭头（请参见 材料表）。
      注:电机和转子已连接到随附的计算机。流速控制软件与电机通信以创建所需的流速。使用流速控制软件是可选的。另一种方法是手动控制水流电机。
4. 校准
   注意:每次实验前都需要校准。
   1. 使用校准盖关闭游泳道。
      注:校准盖采用加固的中央开口定制，适合用于校准的流量计探头（图1B）。八个翼形螺母用于将所有盖子固定在隧道上。
   2. 打开数字流量计并将其连接到流量计探头。 通过 校准盖将流量计探头放置在游泳道内。将流量计探头的叶片垂直于流动方向放置。
   3. 使用数字流量计校准游泳隧道电机（由流速控制软件控制）的输出。为此，请执行以下步骤。
   4. 打开流速控制软件，然后单击 校准。
   5. 将左上角的选项更改为 RPM 与电压。通过在流速控制软件的" 速度 "部分中键入值，以 5 cm/s 为增量将流速从 0 cm/s 增加到 100 cm/s。在每一步中，单击"+"按钮并记录数字流量计指示的当前速度。
      注意:生成的线性关系应具有接近 1 的 ^R2 值。
   6. 要确认校准，请使用流速控制软件 的 Uwater [cm /s] 部分中的向上和向下箭头将水流速度从 0 增加到 10、25、50、75 和 100 cm/s，然后将速度降低到 75、50、25、10 cm/s。在每个速度（来自软件）下，测量并记录数字流量计指示的相应速度。
   7. 如果测得的水流速度在±2 cm/s的偏差范围内，请考虑隧道的校准和精度。如果偏差超过±2 cm/s，请重复步骤1.4.4至1.4.6以确保正确校准。

2. 游泳耐力评估

注意:实验组分为10只或更少的动物组，以保持游泳耐力。

1. 设置流速控制软件。
   注:本节中流速控制软件的使用是可选的。另一种方法是手动控制水流电机。对于手动水流控制，请继续执行步骤 2.3，并在步骤 2.5 和 2.6 中以指定的增量手动增加水流速度。
   1. 打开流速控制软件。点击标有 实验的框。取消选中 Uswim 和 Uwater。
   2. 在左下角的 Uwater [cm/s] 框中更改流速，以调整水流速度。
   3. 若要开始自动协议，请单击" 启动日志记录 "框。在打开的对话窗口中，从下拉列表中选择 "自动 "。
   4. 要选择以前保存的协议文件，请单击" 协议文件 "旁边的文件图标以打开所需的协议。
   5. 通过单击"日志文件"旁边的文件图标来设置输出 文件。在打开的文件资源管理器窗口中，命名输出文件并将其保存在所需位置。
2. 设置拆分单圈计时器窗口。确保同时访问计算机屏幕上的流速控制软件和计时器窗口。
3. 设置一个鱼收集池，以便在将耗尽的鱼从游泳隧道中移除后容纳它们。用斑马鱼系统水（0.75升）填充收集池。用斑马鱼系统水填充长PVC管。
   1. 将预填充PVC管的一端（端1）放在收集罐中，另一端（端2）放在缓冲罐中。确保水可以自由地从缓冲罐流入收集罐。
   2. 用粘合剂夹夹住PVC管的上端（末端2），以防止水流。根据需要使用粘合剂夹来控制水的流出。
4. 使用游泳耐力盖关闭游泳隧道。
   注意:游泳耐力盖定制了游泳隧道窗口，以从游泳隧道中去除排出的鱼，而不会中断其余的测定（图1B）。
5. 将一组鱼放入游泳隧道内。启动分圈计时器，同时通过在流速控制软件的 Uwater [cm/s] 部分中键入这些值，将电流速度调整为 0 cm/s 持续 5 分钟、9 cm/s 持续 5 分钟和 10 cm/s 持续 5 分钟。
   注意:此步骤将使动物适应游泳隧道和流动方向。
6. 在鱼适应后，启动自动流速控制程序，该程序将使水流速度每分钟增加2厘米/秒。
   注意:鱼会游到筋疲力尽。精疲力竭的鱼被推向游泳隧道的后端。
7. 当鱼筋疲力尽时，松开鱼收集管，打开游泳隧道窗口，将鱼收集在收集池中。使用分圈计时器记录耗尽时的时间。
   注意:鱼偶尔会漂流到游泳隧道的后端而不会筋疲力尽。为了确保鱼筋疲力尽，请轻轻敲击隧道的后端或在该区域上空形成阴影以刺激鱼游泳。精疲力竭的鱼对惊吓的刺激没有反应，平躺在隧道的后端。
8. 重复步骤2.7，直到所有的鱼都用完并收集在收集池中。单击流速控制软件上的 紧急停止 按钮并停止计时器。
   注意:在整个游泳过程中仔细检查从游泳隧道室中取出的鱼的数量是否与记录的时间相匹配。
9. 对每组鱼重复步骤 2.5 到 2.8。
   注意:该协议可以在此处暂停，但为了准确到受伤后的时间点，建议在同一天进行电影和耐力游泳。在实验暂停时，隧道可以继续循环。

3. 捕获游泳行为分析视频

注意:一次最多只能跟踪五只动物。如果实验组大于五只动物，则可以为每个组拍摄多个视频，其中第一个视频跟踪五个或更少的动物，第二个视频跟踪其他五个或更少的动物。对于旨在随时间跟踪单个动物的纵向研究，可以在多个时间点单独饲养和跟踪鱼类。所有用于跟踪和分析的脚本都 可以通过 GitHub获得（参见 材料表）。

1. 打开位于游泳道下方的红外灯面板。将摄像机固定在游泳道顶部的天花板支架上。调整对焦和光圈环。
   注:对焦和光圈设置取决于相机与游泳道之间的距离以及光线环境。
2. 打开相机录制软件（请参见 材料表）。按如下方式设置软件设置。
   1. 单击 1:4 宽高比显示。确保视野覆盖整个游泳隧道。关闭自动对比度和自动白平衡以在组之间对背景和对比度进行标准化。
   2. 通过单击扳手图标打开 相机属性 窗口。设置参数如下: 像素时钟:344 MHz， 帧速率:70 fps，单击 保持 旁边的框进行检查， 曝光时间:0.290毫秒。不要关闭此窗口。
   3. 裁剪 录制窗口 ，通过根据需要倾斜/转动摄像机来仅覆盖隧道的游泳室。
3. 通过单击胶卷轴图标打开 录制窗口 。按如下方式设置录制设置:
   1. 选中该框以获取 最大帧数。
   2. 手动输入 63，000 帧数。
   3. 选中" 计算帧速率"框。这允许程序拉取步骤3.2.2（70 fps）中定义的帧速率。
   4. 将 "JPEG 质量" 更改为 30。
4. 记录测试运行。
   1. 单击" 创建" 并将新文件命名为" 测试 "并将其保存在桌面上。
   2. 返回录制窗口，然后单击 录制。让测试影片在整个协议持续时间（15 分钟）内运行。
   3. 测试完成后，请确保没有丢弃的帧，并记录了 63，000 帧。
5. 将一组鱼放入游泳隧道中，并使用标准的全封闭盖子关闭隧道（图1B）。
   注意:在完全拧紧盖子之前，请确保所有鱼都在隧道中。确保盖子下没有气泡。否则，这将影响结果。
6. 打开新的录制文件窗口并为文件命名。示例:2_A_1_00001_WildtypeGroupA.avi
   注意:请确保设置符合步骤 3.2 和 3.3 中的参数。 JPEG 质量 将始终恢复为默认值，并且需要为每个新影片重置。
   警告:请勿单击"录制"。
7. 使用流速控制软件开始新的实验。
   注意:若要开始自动协议，请单击" 启动日志记录 "框。在打开的对话窗口中，从下拉列表中选择 "自动 "。要选择以前保存的协议文件，请单击" 协议文件 "旁边的文件图标以打开所需的协议。
   1. 要开始手动实验方案，请使用流速控制软件中的 Uwater [cm/s] 框将流速设置为 0 cm/s 持续 5 分钟，将 10 cm/s 设置为 5 分钟，然后设置为 20 cm/s 持续 5 分钟。
   2. 将新的数据输出文件（将另存为.csv文件）保存在与电影文件相同的名称下并保存在同一文件夹中。
      警告:请勿单击"开始"。
8. 在游泳隧道的侧面放置纸巾或布料，以确保所有行为都是由于鱼的游泳，而不是由于环境中的运动引起的惊吓反应。
9. 快速连续地，确保水是平静的，没有涟漪在框架中移动。单击照相机软件窗口中的 录制 以开始录制动画文件。单击流速控制软件中的 "启动 "以启动协议，该协议将不间断地继续。
10. 观看影片以确保没有帧掉落，视野中没有气泡，并且记录了所有鱼类。
11. 动画录制完成后，单击紧急停止以结束流速控制协议。检查自动保存的数据输出文件。单击录制窗口中的关闭以保存动画文件。
12. 取下盖子。小心地取回鱼并将它们放回水箱。
13. 对所有鱼组重复步骤 3.5 至 3.12。
14. 完成所有组的动画录制后，使用 MovieProcessing_v5.bat 脚本将动画从70 fps视频转换为20 fps视频。为此，请将脚本文件移动到包含原始视频的文件夹中。右键单击该文件，然后选择 "运行"。
    注意:该脚本会自动运行。将出现一个命令提示符窗口，显示脚本的进度。上述步骤是可选的。它将 15 分钟视频中的帧数从 63，000 帧减少到 18，000 帧，并使 SwimBehavior_v7。R 脚本运行速度更快。
15. 清空隧道并收起所有设备。

4. 分析电影以进行游泳行为评估

注:短片记录和分析可以在不同的日子完成。

1. 在斐济中打开 Tracking_v2.ijm 脚本，然后单击"运行"开始程序。在弹出的窗口中，选择要跟踪的包含游泳行为电影的文件夹，然后单击"打开"。查找第一部电影的第 1 帧、一个对话框以及将出现的感兴趣区域 （ROI） 管理器。
2. 按照对话框中给出的说明进行操作。创建游泳隧道室底部的 ROI，然后单击"确定"。确保看不到黑色角落。
   注意:阈值窗口将与编辑的、带阈值的第 1 帧一起打开。
3. 将配色方案从 B&W 更改为 红色。调整 "最大值"， 直到第 1 帧显示红色的鱼，没有显示其他任何内容。记录阈值。在对话框中单击"确定 "。
   注意:程序将自动运行。为第 1 帧创建的 ROI 将连续选择，并为后续帧取消选择。进度条将监视 斐济 窗口右下角的进程。每部电影的跟踪大约需要40分钟。当跟踪所有电影时， 斐济 程序将停止。投资回报率将停止被选中。包含电影的文件夹现在将具有每部电影 的_raw.csv 文件。斐济此时可以关闭。
4. 对齐、组合和获取描述性统计量
   1. 打开 游泳Behavior_v7。R Studio 中的 R 脚本。
   2. 单击脚本部分右上角的"源"。在打开的新窗口中，选择包含斐济生成的_raw.csv文件的文件夹。单击"打开"。
      注意:程序将自动运行。
   3. 在弹出的对话框中，要求确认每部电影中的鱼的数量 ，如果给出 的数字正确，请单击"是";如果数字不正确，请单击" 否 "。
      注意:如果单击" 否 "，将弹出一条消息，要求使用新的ROI和阈值重新跟踪电影。 如果单击 "是"，程序将继续。
   4. 在打开询问是否应删除非游泳鱼的新窗口中 ，单击" 是"或" 否"。
      注意:非游泳鱼被定义为在10厘米/秒时活性低于50%的鱼。不建议去除不会游泳的鱼。
   5. 在新的弹出窗口中，询问组是否为非盲组，以及用户是否要合并任何组、非盲组或组合组（如果有多个对照组）。
   6. 对上一个问题给出响应后，请确保程序给出一条消息 "对齐文件 X of Y"，其中 X 是要对齐的当前文件，Y 是要对齐的文件总数。对齐每个文件大约需要 30 秒。
5. 对齐文件后，检查是否生成了同名（_aligned.csv）的新.csv文件。确保程序合并数据、运行统计信息并绘制输出图形。检查在父文件夹中标记为 "结果" 的新文件夹中生成的分析文件，该文件夹包含 _raw.csv 和 _aligned.csv 文件。
6. 在"结果"文件夹中，检查两个名为"诊断和图形"的文件夹以及四个名为"BulkData_Avg"、"BulkData_Full"、"SummaryData_Avg"和"SummaryData_Full"的.csv文件。
   注: SummaryData_Full.csv 包含每个时间点每组中每条鱼的单独数据。此数据会自动绘制，但可以提取并绘制到其他位置。
   1. 确保 "图形" 文件夹包含程序生成的图形，并.csv包含每个图形的数据点的文件。
   2. 确保" 诊断" 文件夹包含单个.csv文件，其中包含对齐文件的诊断数据。
      注意: 诊断.csv文件中的 列包括以下内容:a） 包含额外对象的帧数，应小于 100。包含额外对象的帧过多表明跟踪存在问题。b）缺少或合并对象的帧数。此指标为高是正常的。再生不良的鱼将经常被扫到隧道的后面，并被算作失踪。c） 跳转超过 240 像素的帧。这个数字随着单个电影中的对象（鱼）的数量而增加。有关如何计算行为指标的详细说明，请参阅 补充文件 1。

结果

我们按照该协议的第1节（图1）中所述设置了游泳隧道。我们评估了成年斑马鱼在基线和脊髓损伤后的游泳耐力（本方案第2节）以及游泳行为（本方案的第3节和第4节）（图2）。

为了建立基线运动功能，我们检查了野生型斑马鱼在水流速度增加下的游泳耐力（图3A）。在该测定中，野生型斑马鱼游了41分钟才?...

讨论

成年斑马鱼是一种流行的脊椎动物系统，用于模拟人类疾病和研究组织再生机制。CRISPR / Cas9基因组编辑彻底改变了用于斑马鱼疾病建模的反向遗传研究;然而，成年斑马鱼的大规模遗传学受到生物学和技术挑战的阻碍，包括成年斑马鱼组织无法获得高通量表型。鉴于成年斑马鱼的复杂解剖结构，需要长时间的组织学处理来获得和分析组织结构。本研究中描述的游泳耐力和游泳行为测定可用于在组?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoSwim software	Loligo Systems	MI10000	Optional - for Automatic control of current velocity
Customized lid	Loligo Systems	MI10001	This customized lid is used for swim endurance
DAQ-BT	Loligo Systems	SW10600	Optional - for Automatic control of current velocity
Eheim pump	Loligo Systems	PU10160	20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank.
Fiji	Fiji	Freely available through Image J (Fiji)	Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Flowtherm	Loligo Systems	AC10000	Handheld digital flow meter - for calibration
High Speed Camera	Loligo Systems	VE10380	USB 3.0 color video camera (4MP)
IR light panel	Loligo Systems	VE10775	450 x 210 mm, placed under the swim tunnel  chamber
Monofocal lens	Loligo Systems	VE10388	25mm manual lens
PVC Tubing	VWR	60985-534	5/16 x 7/16"  Wall thickness: 1/16"
R Studio	R Studio	Freely available. Version 3.6 with extra packages.	Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior
Swim tunnel respirometer	Loligo Systems	SW10060	5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration
uEye Cockpit	IDS	Freely available software to control camera parameters	Alternative cameras and accompanying softwares could be used
Vane wheel flow probe	Loligo Systems	AC10002	Digital flow probe - for calibration