Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم تقديم بروتوكول قوي هنا لعزل حبيبات الميلانين العصبية من الأنسجة البشرية بعد الوفاة المادة السوداء pars compacta عن طريق التشريح المجهري بالليزر. يقلل هذا البروتوكول المنقح والمحسن بشكل كبير من الوقت المطلوب لجمع العينات ، ويقلل من كمية العينة المطلوبة ، ويعزز تحديد البروتينات وقياسها عن طريق تحليل LC-MS / MS.

Abstract

Neuromelanin هو صبغة سوداء بنية اللون ، موجودة في ما يسمى حبيبات الميلانين العصبية (NMGs) في الخلايا العصبية الدوبامينية من المادة السوداء pars compacta. إلى جانب الميلانين العصبي ، تحتوي NMGs على مجموعة متنوعة من البروتينات والدهون والمعادن. على الرغم من أن الخلايا العصبية الدوبامينية المحتوية على NMGs تضيع بشكل تفضيلي في الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض باركنسون والخرف مع أجسام ليوي ، إلا أنه لا يعرف سوى القليل عن آلية تكوين NMG ودور NMGs في الصحة والمرض. وبالتالي ، من الضروري إجراء مزيد من البحوث حول التوصيف الجزيئي ل NMGs. لسوء الحظ ، تعتمد البروتوكولات القياسية لعزل البروتينات على الطرد المركزي الفائق المتدرج الكثافة وبالتالي تتطلب كميات كبيرة من الأنسجة البشرية. وبالتالي ، يتم إنشاء بروتوكول آلي قائم على التشريح المجهري بالليزر (LMD) هنا والذي يسمح بجمع NMGs والأنسجة المحيطة بالمادة السوداء (SN) باستخدام كميات قليلة من الأنسجة بطريقة غير متحيزة وآلية. يتم تحليل العينات المستأصلة لاحقا عن طريق قياس الطيف الكتلي لفك رموز تركيبها البروتيني. مع سير العمل هذا ، تم تحديد 2079 بروتينا منها 514 بروتينا تم تحديدها حصريا في NMGs و 181 في SN. تمت مقارنة النتائج الحالية مع دراسة سابقة باستخدام نهج مماثل قائم على LMD حيث وصل التداخل بنسبة 87.6٪ لكل من البروتينات ، مما يتحقق من قابلية تطبيق البروتوكول المنقح والمحسن المقدم هنا. للتحقق من صحة النتائج الحالية ، تم تحليل البروتينات ذات الأهمية بواسطة قياس الطيف الكتلي المستهدف ، على سبيل المثال ، تجارب مراقبة التفاعل المتوازي (PRM).

Introduction

يتكون كل نسيج من خليط غير متجانس من أنواع مختلفة من الخلايا ، ولكن العزلة المحددة لنوع واحد من الخلايا غالبا ما تكون لا غنى عنها لتوصيف أكثر دقة. يعد التشريح المجهري بالليزر (LMD) ، الذي يقترن المجهر بتطبيق الليزر ، أداة قوية للعزل المحدد لمناطق الأنسجة أو الخلايا المفردة أو الهياكل الفرعية الخلوية من مركب معقد. تم بالفعل تنفيذ تطبيق LMD بالاشتراك مع قياس الطيف الكتلي (LMD-MS) بنجاح للعديد من الأسئلة البحثية ، بما في ذلك عزل الحمض النووي1 والحمض النووي الريبي2 والبروتينات3،4،5. في هذا البروتوكول ، تم وصف بروتوكول LMD-MS المنقح والمحسن للتحليل البروتيني لأنسجة المخ البشرية بعد الوفاة والمكونات الخلوية الفرعية لفك رموز الآليات المرضية الجديدة لمرض باركنسون.

Neuromelanin هو صبغة سوداء غير قابلة للذوبان تقريبا موجودة في الخلايا العصبية الكاتيكولامينية المنتجة للدوبامين في المادة السوداء pars compacta6. جنبا إلى جنب مع البروتينات والدهون ، يتراكم في حبيبات تشبه العضيات محاطة بغشاء مزدوج ، يسمى حبيبات الميلانين العصبية (NMGs)7،8،9. يمكن ملاحظة NMGs من سن ثلاث سنوات في البشر زيادة في الكمية والكثافة أثناء عملية الشيخوخة10,11. حتى الآن ، لا توجد فرضية محددة حول تكوين الميلانين العصبي ، ولكن أحد الافتراضات هو أن الميلانين العصبي يتشكل من خلال أكسدة الدوبامين12. تستند الفرضيات الأخرى إلى الإنتاج الأنزيمي للميلانين العصبي (على سبيل المثال ، التيروزيناز)13. تم العثور على الميلانين العصبي نفسه لديه تقارب ارتباط كبير بالدهون والسموم وأيونات المعادن والمبيدات الحشرية. بناء على هذه النتائج ، يفترض أن تكوين NMGs يحمي الخلية من تراكم المواد السامة والأكسدة ومن السموم البيئية14,15. إلى جانب هذه الوظيفة العصبية ، هناك أدلة على أن الميلانين العصبي قد يسبب تأثيرات تنكسية عصبية ، على سبيل المثال ، عن طريق تشبع الحديد والتحفيز اللاحق للجذور الحرة16،17. علاوة على ذلك ، يمكن أن يتحلل الميلانين العصبي الذي يتم إطلاقه أثناء العمليات التنكسية العصبية بواسطة بيروكسيد الهيدروجين ، مما قد يسرع النخر بواسطة المعادن التفاعلية والمركبات السامة الأخرى المرتبطة سابقا بالميلانين العصبي وقد يساهم في التهاب الأعصاب وتلف الخلايا18. ومع ذلك ، حتى الآن ، فإن الدور الدقيق ل NMGs في العمليات التنكسية العصبية كما هو الحال في سياق مرض باركنسون غير مفهوم بوضوح. ومع ذلك ، يبدو أن NMGs متورطة في التسبب في مرض باركنسون وتحليلها المحدد له أهمية قصوى لكشف دورها في التنكس العصبي. لسوء الحظ ، تفتقر المختبر الشائعة (مثل الفئران والجرذان) وخطوط الخلايا إلى NMGs19. لذلك ، يعتمد الباحثون بشكل خاص على أنسجة المخ بعد الوفاة لتحليلهم. في الماضي ، اعتمدت عزلة NMG بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة على توافر كميات كبيرة من الأنسجة السوداء 20,21. اليوم ، يقدم LMD أداة متعددة الاستخدامات لعزل NMGs على وجه التحديد من عينات الدماغ البشري ثم تحليلها بواسطة LC-MS / MS.

في هذا البروتوكول ، يتم تقديم نسخة محسنة وآلية من البروتوكولالسابق 22 لعزل NMGs والأنسجة المحيطة (SN) ، مما يتيح توليد عينات أسرع ، وأعداد أكبر من البروتينات المحددة والكمية ، وانخفاض حاد في كميات الأنسجة المطلوبة.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام أنسجة المخ البشري من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة الرور في بوخوم بألمانيا (رقم الملف 4760-13) ، وفقا للوائح والمبادئ التوجيهية الألمانية. تم تطبيق هذا البروتوكول على شرائح الأنسجة المضغوطة التي تم الحصول عليها تجاريا. يتم عرض نظرة عامة رسومية للبروتوكول المقدم في الشكل 1.

1. تقسيم الأنسجة

  1. قم بتبريد غرفة التبريد.
    ملاحظة: يتطلب كل نسيج درجات حرارة مختلفة للتبريد ، والتي يمكن العثور عليها في بروتوكول البائع المعني.
  2. نظف سكين الفولاذ المقاوم للصدأ بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بتثبيته في حامل الشفرة.
  3. انقل المنديل من الفريزر -80 درجة مئوية إلى المبردة باستخدام صندوق ثلج واتركه يتكيف مع درجة حرارة غرفة التبريد لمدة 15 دقيقة.
  4. قم بتسمية شرائح الغشاء بشكل لا لبس فيه باستخدام قلم رصاص.
    ملاحظة: شرائح غشاء PET / PEN مطلوبة لجمع العينات القائمة على LMD. تعامل مع شرائح غشاء PET / PEN بعناية لأنها هشة للغاية.
  5. ضع قطرة من وسط المقطع التجاري المجمد على حامل الأنسجة. قبل أن يتم تجميده تماما ، ضع المنديل على وسط القسم المجمد واتركه يتصلب ، بحيث يتم توصيل الأنسجة بحامل الأنسجة.
  6. قم بتثبيت حامل الأنسجة في غرفة cryostat واضبط اتجاهه قبل البدء في التقسيم. يعتمد اتجاه الحامل الأمثل على اتجاه الأنسجة.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري تقليم الأنسجة حتى يتم الوصول إلى مستوى المقطع المطلوب للشرائح.
  7. قبل الوصول إلى منطقة الأنسجة محل الاهتمام ، اضبط إعداد القطع على سمك الأنسجة المطلوب.
    ملاحظة: 5 أو 10 ميكرومتر هي السماكة المقترحة لهذا البروتوكول حيث وجد أن المقاطع التي يبلغ سمكها 20 ميكرومتر غير متوافقة مع مجموعة العينات القائمة على LMD22.
  8. قطع قسمين وتجاهلها.
  9. اخماد لوحة مانعة للانقلاب.
  10. قم بقص جزء من الأنسجة ، وافتح اللوحة المضادة للتدحرج بعناية ، وخذ شريحة غشائية ، وامنع طي الأنسجة أثناء وضع قسم الأنسجة على شريحة الغشاء.
    ملاحظة: يتيح تخزين شرائح الغشاء في درجة حرارة الغرفة قبل الالتصاق إمكانية توصيل العينة بدقة. يمكن وضع عدة أقسام على نفس شريحة الغشاء ولكن يجب منع تداخل الأنسجة.
  11. قم بتخزين أقسام الأنسجة الموضوعة على شرائح غشائية في cryostat حتى يتم الانتهاء من التقسيم.
  12. قم بتخزين الأنسجة المقسمة بالتبريد عند -20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة أو تابع الإجراء أدناه مباشرة. قم بتخزين شرائح الأنسجة المجزأة عند -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامها مرة أخرى.

2. التشريح المجهري بالليزر والضغط المنجنيق

ملاحظة: نظرا لأن حبيبات الميلانين العصبية مرئية دون أي تلطيخ بسبب لونها الأسود والبني ، فلا يلزم تلطيخ هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يمكن الجمع بين إجراءات تلطيخ مختلفة مع هذا البروتوكول إذا لزم الأمر. ضع في اعتبارك أن استخدام محاليل الحجب أو الأجسام المضادة سيؤثر على تحليلات LC-MS / MS.

  1. قم بتشغيل نظام MicroBeam وافتح البرنامج المرتبط على الكمبيوتر (انظر جدول المواد).
  2. ضع شريحة غشاء الأنسجة في SlideHolder على RoboStage بحيث يكون النسيج متجها لأعلى.
    ملاحظة: اعتمادا على جهاز LMD ، قد يكون من الضروري وضع شريحة الغشاء بحيث يكون النسيج متجها لأسفل. بشكل عام ، يتم إجراء جمع العينات في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها لضمان الظروف المثلى والقابلة للتكرار.
  3. اضبط المجهر على التكبير المطلوب (يتم استخدام 50 ضعفا هنا) لإجراء عمليات مسح عامة.
  4. استخدم وظيفة المسح الضوئي ، والتي يمكن العثور عليها في نافذة Navigator لواجهة البرنامج ، للحصول على مسح عام لقسم الأنسجة. ابحث عن الزاوية العلوية اليسرى والركن الأيمن السفلي من منطقة الاهتمام وحددها في واجهة البرنامج. ثم حدد فحص جميع عائد الاستثمار لإجراء عمليات الفحص.
    ملاحظة: عمليات الفحص الشاملة ليست إلزامية، ولكنها تتيح توجيها أفضل في الشريحة ويمكن حفظها لاستخدامها لاحقا.
  5. اضبط تكبير المجهر للأنسجة المناسبة ، وهو 400 ضعف في الحالة الحالية لحبيبات الميلانين العصبية.
  6. ابحث عن منطقة بها حبيبات الميلانين العصبية. حدد تحليل مجال الرؤية في واجهة البرنامج، وحدد عكس النتيجة، واضبط عتبة قنوات RGB بحيث يتم تمييز حبيبات الميلانين العصبية فقط باللون الأحمر في نافذة المعاينة. انقر فوق "موافق " لاستخدام الإعدادات المعدلة لمجال الرؤية.
    ملاحظة: قد يحدث أن الكائنات الأصغر ذات اللون الداكن يتم تحديدها أيضا. لحساب ذلك ، تخلص من جميع الأشياء التي تغطي مساحة أصغر من 100 ميكرومتر2 قبل عزل حبيبات الميلانين العصبية. للقيام بذلك ، افتح قائمة العناصر بالنقر فوق الرمز الموجود في شريط الأدوات ، وحدد الشريحة قيد النظر وترتيب العناصر حسب المنطقة. حدد تلك التي تحتوي على مساحات أصغر من 100 ميكرومتر2 واحذفها.
  7. اضبط إعدادات الليزر باستخدام منطقة من الشريحة يغطيها الغشاء فقط.
    ملاحظة: يقترح استخدام معالج ضبط Cut Laser واتباع إرشادات البرنامج. قد تختلف إعدادات الليزر المطلوبة بين الشرائح المختلفة. بالنسبة لأقسام 5 ميكرومتر مع تكبير 400 ضعف ، فإن الإعدادات النموذجية هي 32 طاقة و 51 تركيزا للقطع ، و 28 طاقة و -1 تركيز لقذف نبض الليزر (LPC).
  8. اضبط إعدادات السرعة لتحديد المواقع والقطع لضمان العزل المناسب.
    ملاحظة: تم العثور على سرعة 30٪ لتكون مثالية لعزل NMG.
  9. املأ غطاء أنبوب جمع العينات بماء فائق النقاء 50 ميكرولتر وأدخل الغطاء في مجمع RoboMover.
    ملاحظة: يمكن لمجمع الأنبوب المستخدم في التجارب الحالية أن يحمل أنبوبا واحدا لجمع العينات في كل مرة.
  10. ضع RoboMover فوق RoboStage II باستخدام واجهة البرنامج لبدء جمع العينات.
    ملاحظة: للقيام بذلك، افتح إطار RoboMover، الذي يعرض المجمع. انقر فوق غطاء أنبوب جمع العينات المعروض في نافذة RoboMover لنقل الغطاء إلى منطقة العمل. اضبط الارتفاع الأمثل للحركة والعمل في نافذة RoboMover. خلاف ذلك ، قد يسقط الماء الموجود في الغطاء على الشريحة أو لن تصل الأجسام المنجنيقة إلى الغطاء.
  11. ابدأ تشغيل الليزر. تحكم في إعدادات الطاقة والتركيز أثناء عملية الليزر واضبط الإعدادات إذا لزم الأمر. تأكد من العزل المناسب والقذف للأجسام المعزولة في غطاء أنبوب جمع العينات للكائنات العشرة الأولى على الأقل.
    ملاحظة: يجب فحص العزل المناسب والمنجنيق بصريا. يجب أن ينتج عن كلاهما منطقة خالية من الأنسجة بحجم الكائن المحدد مسبقا في شريحة الأنسجة (انظر الشكل 2C ، D). اضبط إعدادات الليزر إذا ظل الكائن ملتصقا بشريحة الأنسجة بعد القطع والمنجنيق. بالنسبة للمنجنيق ، تم العثور على خيار CenterRoboLPC ليكون مناسبا تماما لعزل NMG. يمكن ضبط إعدادات المنجنيق لكل كائن محدد في قائمة العناصر.
  12. عند اكتمال أخذ العينات ، انتقل إلى RoboMover إلى موضع البداية. قم بإزالة أنبوب جمع العينات.
    ملاحظة: عندما يكون عدد الأشياء التي تم جمعها منخفضا إلى حد ما وتكون الأشياء كبيرة بما يكفي ، يمكن ضمان جمع العينات بالنقر فوق Cap Check ، والذي سيضع غطاء أنبوب جمع العينات تحت المجهر بحيث يمكن حساب عدد الأشياء الموجودة داخل الماء في الغطاء (انظر الشكل 2H).
  13. قم بتدوير العينة باستخدام جهاز طرد مركزي. تم العثور على دورات قصيرة من 5 ثوان مع زيادة قوة الطرد المركزي بسبب تسارع أجهزة الطرد المركزي لتكون كافية. في هذه المرحلة ، قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية ، حيث يجب معالجة جميع العينات معا.
    ملاحظة: لمقارنة المظهر البروتيني ، تم أيضا عزل الأنسجة المحيطة ب NMGs بعد استئصالها. تم إجراء عزل الأنسجة المحيطة عند تكبير 50 ضعفا.
  14. تجفيف العينات في مكثف فراغ. تم العثور على 1.5 ساعة لتكون كافية ل 50 ميكرولتر من الماء.
  15. إذابة وتحليل الأنسجة في 40 ميكرولتر حمض الفورميك لمدة 20 دقيقة (درجة حرارة الغرفة).
  16. تعزيز تحلل الأنسجة عن طريق صوتنة في 45 كيلو هرتز (كيلو هرتز) لمدة 5 دقائق في حمام صوتنة. املأ حمام صوتنة بالثلج لمنع الأنابيب من الذوبان. قم بتخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى تتم المعالجة الإضافية.

3. الهضم التربتيك

  1. قم بتجميد العينات على الجليد.
  2. جفف العينات تماما في مكثف الفراغ.
  3. املأ العينة ب 50 ميكرولتر من محلول هضم مناسب ، على سبيل المثال ، 50 ملي مول بيكربونات الأمونيوم.
  4. بعد إضافة 1.25 ميكرولتر من 200 mM 1,4-dithiothreitol ، احتضن العينات لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة باستخدام خلاط حراري وقم بتبريدها إلى درجة حرارة الغرفة (RT) بعد ذلك.
  5. بعد ذلك ، احتضان العينات في RT لمدة 30 دقيقة في الظلام بعد إضافة 1.36 ميكرولتر 0.55 M iodoacetamide.
  6. أضف كمية مناسبة من التربسين إلى العينات واحتضان العينات طوال الليل (~ 16 ساعة) عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة ل 1,000,000 ميكرومتر2 ، وجد أن 0.1 ميكروغرام من التربسين كافية.
  7. أضف 2.6 ميكرولتر من 10٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) إلى العينات لوقف الهضم (التركيز النهائي 0.5٪ TFA).
  8. جفف العينات تماما باستخدام مكثف فراغ. بعد ذلك ، املأ العينات حتى حجم نهائي محدد بنسبة 0.1٪ TFA. تم ملء عينات NMG حتى 20 ميكرولتر منها 5 ميكرولتر تم استخدامها لتجربة واحدة لقياس الطيف الكتلي (MS).
  9. قم بتخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى. تحديد تركيز الببتيد عن طريق تحليل الأحماض الأمينية أو طريقة أخرى مناسبة للقياس الكمي (على سبيل المثال ، الكشف المباشر).
    ملاحظة: قد لا تكون كميات العينات المنخفضة قابلة للقياس الكمي باستخدام التقنيات المذكورة. لضمان تحميل عينة متطابقة ، يجب أن تحتوي كل عينة على نفس الكمية من الأنسجة المعزولة ويجب معالجة كل عينة على قدم المساواة.

4. كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء وقياس الطيف الكتلي

ملاحظة: تم تحسين تحليل مطياف الكتلة (MS) التالي عالي الأداء للكروماتوغرافيا السائلة (HPLC) لنظام LC المحدد باستخدام جهاز عمود الملاءمة ومطياف الكتلة المستخدم هنا (انظر جدول المواد). بالنسبة لأنظمة LC و MS الأخرى ، يوصى بتكييف المعلمات.

  1. باستخدام برنامج Xcalibur ، اضبط إعدادات HPLC على النحو التالي.
    1. عمود المصيدة: اضبط درجة الحرارة على 60 درجة مئوية ، ومعدل التدفق على 30 ميكرولتر / دقيقة ، وتشغيل المخزن المؤقت إلى 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك.
    2. عمود المرحلة المعكوسة C18 التحليلي: اضبط درجة الحرارة على 60 درجة مئوية ، ومعدل التدفق على 30 ميكرولتر / دقيقة ، وتشغيل المخزن المؤقت A إلى 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، وتشغيل المخزن المؤقت B إلى 84٪ أسيتونيتريل ، والتدرج إلى 5٪ -30٪ تشغيل المخزن المؤقت B على مدار 98 دقيقة.
      ملاحظة: قد يكون تكيف التدرج أمرا لا مفر منه ويوصى به بشدة عند استخدام أنسجة أو خلايا مختلفة. قد يختلف إجمالي وقت التدرج بسبب تحميل العينة في بداية التدرج وغسل العينات في نهاية التدرج. يتكون التدرج الكلي في هذا البروتوكول من تحميل عينة لمدة 7 دقائق وغسل عمود إضافي لمدة 15 دقيقة مما ينتج عنه وقت تدرج إجمالي يبلغ 120 دقيقة.
  2. قم بإنشاء طريقة اكتساب تعتمد على البيانات (DDA) باستخدام إعداد أداة XCalibur ، والتي يمكن العثور عليها في قائمة خارطة طريق برنامج HPLC.
  3. في علامة التبويب المعلمات العامة ، حدد وضع التسريب كروماتوغرافيا سائلة، وعرض ذروة LC المتوقع (30 ثانية)، وحالة الشحن الافتراضية (2).
  4. انتقل إلى علامة التبويب معلمات الفحص وأضف عمليات الفحص والفلاتر التالية بالترتيب المذكور: MS OT و MIPS والكثافة وحالة الشحن والاستبعاد الديناميكي و DDMS2 OT HCD.
    ملاحظة: يمكن العثور على إعدادات المعلمات التفصيلية لكل مسح ضوئي ومرشح في الجدول التكميلي 1. قد تختلف إعدادات MS و DDA المثلى بالنسبة لمطياف الكتلة المحدد المستخدم بالإضافة إلى نوع العينة ، وبالتالي يجب تكييفها.
  5. تحضير العينات عن طريق إذابة 200-400 نانوغرام من عينة الببتيدات في حجم محدد من 0.1٪ TFA في مداخل قارورة زجاجية مطياف الكتلة الخاملة. إذا كان تحديد التركيز غير قابل للتطبيق بسبب انخفاض كمية العينة ، فتحقق من تحميل العينة المتطابقة من خلال مقارنة إجمالي التيار الأيوني (TIC).
    ملاحظة: للقيام بذلك ، افتح الملف الناتج لقياس مطياف الكتلة في برنامج مناسب ، على سبيل المثال ، FreeStyle ، وتحقق من مخطط الألوان. يجب أن تكون الشدة قابلة للمقارنة لجميع العينات. يظهر TIC التمثيلي في الشكل 3.
  6. تحليل البيانات الأولية التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج مناسب للبروتين ، على سبيل المثال ، MaxQuant23 ، Progenesis QI للبروتينات ، أو Proteome Discoverer ، وإجراء تحليل للبيانات الإحصائية بناء على سؤال البحث.

5. تحليل البيانات الخام البروتينية باستخدام MaxQuant

ملاحظة: ترد معلومات مفصلة عن معلمات MaxQuant في الجدول التكميلي 2. يتم وصفها بإيجاز أدناه.

  1. قم بتحميل الملفات الأولية في برنامج MaxQuant في رأس البيانات الأولية بالنقر فوق تحميل.
  2. قم بتعيين أسماء العينات بالنقر فوق تعيين التجربة.
  3. تحديد المعلمات الخاصة بالمجموعة. أولا ، أضف تعديلات. نظرا لمعالجة العينات ، اختر Deamidation (NQ) والأكسدة (M) و Carbamidomethylation (N-term) كتعديلات متغيرة ، وأضف Carbamidomethylation (C) كتعديل ثابت.
  4. اختر التربسين كإنزيم هضم في علامة التبويب الهضم .
  5. أضف خيار القياس الكمي الخالي من التسمية LFQ في علامة التبويب القياس الكمي الخالي من التسمية . إذا كان سيتم معالجة أكثر من 10 ملفات ، فاختر خيار Fast LFQ لتقصير وقت المعالجة. أضف خيار iBAQ كمقياس لقياس كمية البروتين24.
  6. تأكد من بقاء جميع المعلمات الأخرى الخاصة بالمجموعة في إعدادات المصنع.
  7. انتقل إلى علامة التبويب المعلمات العامة وأضف ملف FASTA المشتق من uniprot.org في علامة التبويب التسلسلات . قم بتعديل قاعدة المعرف وفقا لذلك وأضف معرف التصنيف ، في هذه الحالة ، 9606 للإنسان العاقل.
  8. لتحديد كمية البروتين ، اختر الببتيدات الفريدة والحلاقة .
  9. تأكد من بقاء جميع المعلمات العامة الأخرى في إعدادات المصنع.
  10. انقر فوق ابدأ واسترجاع مجموعات البروتين .txt الإخراج بعد تحليل MaxQuant لمزيد من التحليل في Perseus.

6. التحليل الإحصائي باستخدام فرساوس

  1. قم بتحميل ملف proteingroups .txt في Perseus ، وأضف قيم iBAQ كأعمدة رئيسية ، وقم بفرز جميع الأعمدة الأخرى وفقا لنوعها.
  2. قم بتصفية الأفخاخ والملوثات عن طريق تصفية الصفوف بناء على العمود الفئوي.
  3. تصفية النتائج استنادا إلى قيم صالحة. في الحالة الحالية ، مع تضمين عينتين فقط في التحليل ، تم اختيار عدد أدنى من قيمة صالحة واحدة.
  4. قم بتصدير إخراج Perseus بتنسيق .txt لمزيد من المعالجة ، على سبيل المثال ، في Excel ، وتقييم النتائج المتعلقة بسؤال البحث.

7. التحقق من صحة البروتينات المختارة

ملاحظة: الطرق الشائعة الاستخدام للتحقق من صحة بيانات مرض التصلب العصبي المتعدد هي ، على سبيل المثال ، التلوين المناعي أو اللطخة الغربية. بسبب اللون الداكن والتألق الذاتي للميلانين العصبي ، لا ينطبق التلوين المناعي للبروتينات داخل حبيبات الميلانين العصبية إما مع الأجسام المضادة المترافقة من بيروكسيديز الفجل أو الفلوروفور. لتحليل اللطخة الغربية ، سيكون من الضروري وجود كميات كبيرة جدا من أنسجة ما بعد الوفاة . لذلك ، يتم التحقق من صحة البروتينات المختارة من خلال قياس الطيف الكتلي المستهدف ، وفي الحالة الحالية ، تم إنشاء تجارب مراقبة التفاعل المتوازي (PRM).

  1. حدد البروتينات للتحقق من صحتها. اختر الببتيدات من هذه البروتينات المكتشفة بالفعل في تجارب DDA. يجب ألا تحتوي الببتيدات على أي انشقاقات أو تعديلات مفقودة لضمان تقدير كمي موثوق.
    ملاحظة: يمكن أن يكون هناك عدة أسباب للتحقق من صحة بروتين واحد محدد ، على سبيل المثال ، الوفرة التفاضلية في الظروف التي تم فحصها. بالنسبة للنتائج التمثيلية ، تم اختيار السلسلة الثقيلة 1 من الداينين السيتوبلازمي 1 ، والتي وجد أنها وفيرة بشكل مكافئ في عينات NMG و SN وبالتالي يمكن استخدامها كمرجع لضمان تحميل متساو للعينة.
  2. استخدم الببتيدات المحددة لإعداد الإصدار الأول من طريقة PRM باستخدام برنامج HPLC. احتفظ بجميع إعدادات الكروماتوغرافيا والمعلمات العامة من طريقة DDA.
  3. أضف MS OT و tMS2 OT HCD كأنواع الفحص. تأكد من أن إعدادات MS OT هي نفسها الخاصة بطريقة DDA. يمكن العثور على الإعدادات التفصيلية لطريقة PRM في الجدول التكميلي 1.
  4. بالنسبة إلى tMS2 OT HCD ، أضف الببتيدات المحددة كقائمة تضمين. لذلك ، أضف تسلسل الأحماض الأمينية وقيمة m / z التي لوحظت في قياسات DDA. بالنسبة لتجربة PRM الأولى، لا تقم بإضافة نوافذ وقت الاستبقاء أو تعيين t start إلى 0 وt stop إلى 120 (لتدرج 120 دقيقة).
  5. قم بتقييم طريقة PRM بعد القياس باستخدام برنامج مناسب ، على سبيل المثال ، Skyline ، واحصل على وقت الاحتفاظ بالببتيدات المضافة إلى قائمة التضمين. بالنسبة للببتيدات المضمنة ، تحقق من أن القمم المماثلة يمكن ملاحظتها لثلاثة أيونات سلائف على الأقل في عمليات مسح MS1 وخمسة أيونات شظايا في عمليات مسح MS2 مع خطأ كتلة منخفض (±5 جزء في المليون).
  6. قم بتحسين طريقة PRM ، على سبيل المثال ، عن طريق زيادة دقة فحص tMS2 OT HCD وإضافة نوافذ وقت الاستبقاء إلى قائمة التضمين.
    ملاحظة: تم العثور على نوافذ وقت الاستبقاء لمدة 3 دقائق لتكون مناسبة تماما في التجارب الحالية (وقت الاستبقاء المرصود في تجربة PRM الأولى ± 1.5 دقيقة).
  7. باستخدام طريقة PRM المكررة ، قم بإجراء تقدير كمي للببتيدات والبروتينات ذات الأهمية بناء على منطقة الذروة على مستويات MS1 و MS2 باستخدام برنامج مناسب.

النتائج

يعد العزل المحدد لأنسجة NMGs و SN أهم خطوة للتطبيق الناجح لهذا البروتوكول. باستخدام وظيفة تحليل مجال الرؤية في البرنامج المقدم من البائع ل LMD ، يمكن تحديد NMGs تلقائيا بطريقة تعتمد على اللون. لذلك ، يجب تحديد مناطق الأنسجة التي تحتوي على NMGs (الشكل 2 أ) ويجب إجراء تحليل مج?...

Discussion

LMD هي تقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لعزل مناطق أنسجة معينة أو خلايا مفردة أو هياكل تحت خلوية. في البروتوكول المنقح والآلي المقدم هنا ، يتم تطبيق هذه التقنية للعزل المحدد لحبيبات الميلانين العصبية (NMGs) والأنسجة المحيطة ب NMG (SN). حتى الآن ، تم نشر نهجين مختلفين لعزل NMGs من أنسجة المخ البشرية ...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل de. NBI ، وهو مشروع تابع للوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحث (BMBF) (رقم المنحة FKZ 031 A 534A) و P.U.R.E. (وحدة أبحاث البروتين الرور داخل أوروبا) ومركز تشخيص البروتين (ProDi) ، كلاهما من وزارة الابتكار والعلوم والبحوث في شمال الراين وستفاليا ، ألمانيا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-dithiothreitolAppliChemA1101
AcetonitrileMerck1.00029.2500
Ammonium bicarbonateSigma-AldrichA6141
Formic acidSigma-Aldrich56302
IodoacetamideAppliChemA1666,0100
Micro Tube 500Carl Zeiss415190-9221-000
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometerThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeamZeiss494800-0014-000
PEN Membrane slideCarl Zeiss415190-9041-000
substantia nigra pars compacta tissue slicesNavarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain)
Trifluoroacetic acidMerck91707
Trypsin sequencing gradeServa37283.01
Ultimate 3000 RSLC nano LC systemThermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANO
Name of SoftwareWeblink/CompanyVersion
FreeStyleThermo Fisher Scientific1.6
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/1.6.17.0
PALMRoboZeiss4.6 pro
Perseushttps://www.maxquant.org/perseus/1.6.15.0
Skylinehttps://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view20.2.0.343
XCaliburThermo Fisher Scientific4.3

References

  1. Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
  2. Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
  3. Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
  4. Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
  5. Güttsches, A. -. K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
  6. Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
  7. Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
  8. Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
  9. Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
  10. Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
  11. Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), 721-728 (2006).
  12. Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
  13. Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
  14. Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
  15. Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
  16. Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
  17. Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
  18. Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), 1623-1630 (2013).
  19. Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
  20. Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
  21. Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease. NPJ Parkinson's Disease. 4, 17 (2018).
  22. Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
  23. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  24. Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
  25. . Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007)
  26. Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

178 pars compacta

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved