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* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Hier wird ein robustes Protokoll zur Isolierung von Neuromelanin-Granulaten aus humanem postmortalem Substantia nigra pars compacta-Gewebe mittels Lasermikrodissektion vorgestellt. Dieses überarbeitete und optimierte Protokoll minimiert massiv die benötigte Zeit für die Probenentnahme, reduziert die erforderliche Probenmenge und verbessert die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen durch LC-MS/MS-Analyse.
Neuromelanin ist ein schwarz-bräunliches Pigment, das in sogenannten Neuromelanin-Granula (NMGs) in dopaminergen Neuronen der Substantia nigra pars compacta vorkommt. Neben Neuromelanin enthalten NMGs eine Vielzahl von Proteinen, Lipiden und Metallen. Obwohl NMGs-haltige dopaminerge Neuronen bevorzugt bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson und Demenz mit Lewy-Körpern verloren gehen, ist nur wenig über den Mechanismus der NMG-Bildung und die Rolle von NMGs bei Gesundheit und Krankheit bekannt. Daher sind weitere Forschungen zur molekularen Charakterisierung von NMGs unerlässlich. Leider basieren Standardprotokolle für die Isolierung von Proteinen auf der Ultrazentrifugation mit Dichtegradienten und erfordern daher hohe Mengen an menschlichem Gewebe. So wird hier ein automatisiertes Lasermikrodissektionsprotokoll (LMD) etabliert, das die Entnahme von NMGs und umgebendem Substantia nigra (SN)-Gewebe mit minimalen Gewebemengen unvoreingenommen und automatisiert ermöglicht. Ausgeschnittene Proben werden anschließend mittels Massenspektrometrie analysiert, um ihre proteomische Zusammensetzung zu entschlüsseln. Mit diesem Workflow wurden 2.079 Proteine identifiziert, von denen 514 Proteine ausschließlich in NMGs und 181 in SN identifiziert wurden. Die vorliegenden Ergebnisse wurden mit einer früheren Studie verglichen, die einen ähnlichen LMD-basierten Ansatz verwendete, der eine Überlappung von 87,6% für beide Proteome erreichte, was die Anwendbarkeit des hier vorgestellten überarbeiteten und optimierten Protokolls bestätigt. Um aktuelle Ergebnisse zu validieren, wurden interessante Proteine mittels gezielter Massenspektrometrie analysiert, z.B. Parallel Reaction Monitoring (PRM)-Experimente.
Jedes Gewebe besteht aus einer heterogenen Mischung verschiedener Zelltypen, aber die spezifische Isolierung eines Zelltyps ist für eine genauere Charakterisierung oft unerlässlich. Die Lasermikrodissektion (LMD), die ein Mikroskop mit einer Laseranwendung koppelt, ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur spezifischen Isolierung von Gewebebereichen, einzelnen Zellen oder zellulären Substrukturen aus einem komplexen Verbund. Die Anwendung von LMD in Kombination mit Massenspektrometrie (LMD-MS) wurde bereits erfolgreich für mehrere Forschungsfragen umgesetzt, darunter die Isolierung von DNA1, RNA2 und Proteinen 3,4,5. In diesem Protokoll wird ein überarbeitetes und optimiertes LMD-MS-Protokoll für die proteomische Analyse von humanem postmortalem Hirngewebe und subzellulären Komponenten beschrieben, um neuartige Pathomechanismen der Parkinson-Krankheit zu entschlüsseln.
Neuromelanin ist ein schwarzes, fast unlösliches Pigment, das in den katecholaminergen, Dopamin produzierenden Neuronen der Substantia nigra pars compacta6 vorkommt. Zusammen mit Proteinen und Lipiden reichert es sich in organellenartigen Granula an, die von einer Doppelmembran umgeben sind, die Neuromelanin-Granula (NMGs)7,8,9 genannt wird. NMGs können ab dem Alter von drei Jahren beim Menschen beobachtet werden, der während des Alterungsprozesses an Menge und Dichte zunimmt10,11. Bis heute gibt es keine eindeutige Hypothese zur Bildung von Neuromelanin, aber eine Annahme ist, dass Neuromelanin durch die Oxidation von Dopamin12 gebildet wird. Andere Hypothesen basieren auf der enzymatischen Produktion von Neuromelanin (z.B. Tyrosinase)13. Es wurde festgestellt, dass Neuromelanin selbst eine hohe Bindungsaffinität zu Lipiden, Toxinen, Metallionen und Pestiziden aufweist. Basierend auf diesen Erkenntnissen wird angenommen, dass die Bildung von NMGs die Zelle vor der Ansammlung toxischer und oxidativer Substanzen und vor Umweltgiften schützt14,15. Neben dieser neuroprotektiven Funktion gibt es Hinweise darauf, dass Neuromelanin neurodegenerative Effekte hervorrufen kann, z.B. durch Eisensättigung und die anschließende Katalyse freier Radikale16,17. Darüber hinaus kann Neuromelanin, das während neurodegenerativer Prozesse freigesetzt wird, durch Wasserstoffperoxid abgebaut werden, was die Nekrose durch reaktive Metalle und andere toxische Verbindungen, die zuvor an Neuromelanin gebunden waren, beschleunigen und zu Neuroinflammation und Zellschäden beitragen kann18. Die genaue Rolle von NMGs bei neurodegenerativen Prozessen wie im Verlauf der Parkinson-Krankheit ist bisher jedoch nicht klar geklärt. Dennoch scheinen NMGs an der Pathogenese der Parkinson-Krankheit beteiligt zu sein, und ihre spezifische Analyse ist von größter Bedeutung, um ihre Rolle bei der Neurodegeneration zu entschlüsseln. Leider fehlen gewöhnlichen Labortieren (z.B. Mäusen und Ratten) und ZelllinienNMGs 19. Daher verlassen sich Forscher für ihre Analyse vor allem auf postmortales Hirngewebe. In der Vergangenheit beruhte die NMG-Isolierung durch Dichtegradientenzentrifugation auf der Verfügbarkeit hoher Mengen an Substantia nigra-Gewebe 20,21. Heute stellt LMD ein vielseitiges Werkzeug dar, um NMGs gezielt aus menschlichen Gehirnproben zu isolieren, um sie dann mittels LC-MS/MS zu analysieren.
In diesem Protokoll wird eine verbesserte und automatisierte Version eines früheren Protokolls22 für die Isolierung von NMGs und umgebendem Gewebe (SN) vorgestellt, was eine schnellere Probengenerierung, eine höhere Anzahl identifizierter und quantifizierter Proteine und eine starke Reduzierung der erforderlichen Gewebemengen ermöglicht.
Die Verwendung von menschlichem Hirngewebe wurde von der Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum (Aktenzeichen 4760-13) nach deutschen Vorschriften und Richtlinien genehmigt. Dieses Protokoll wurde auf kommerziell gewonnene Gewebeschnitte von Substantia nigra pars compacta angewendet. Eine grafische Übersicht über das vorgestellte Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Gewebeschnitt
2. Lasermikrodissektion und Druckkatapultierung
HINWEIS: Da Neuromelanin-Granulate aufgrund ihrer schwarz-bräunlichen Farbe ohne Färbung sichtbar sind, ist für dieses Protokoll keine Färbung erforderlich. Dennoch können bei Bedarf verschiedene Färbeverfahren mit diesem Protokoll kombiniert werden. Beachten Sie, dass die Verwendung von Blockierungslösungen oder Antikörpern die LC-MS/MS-Analysen beeinflusst.
3. Tryptische Verdauung
4. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie
HINWEIS: Die folgenden Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrien (MS) sind für das spezifische LC-System mit einer hier verwendeten Fangsäulenvorrichtung und einem Massenspektrometer optimiert (siehe Materialtabelle). Für andere LC- und MS-Systeme wird eine Anpassung der Parameter empfohlen.
5. Analyse proteomischer Rohdaten mit MaxQuant
ANMERKUNG: Detaillierte Informationen zu den MaxQuant-Parametern finden Sie in der Zusatztabelle 2. Sie werden im Folgenden kurz beschrieben.
6. Statistische Auswertung mit Perseus
7. Validierung ausgewählter Proteine
HINWEIS: Häufig verwendete Methoden zur Validierung von MS-Daten sind beispielsweise die immunologische Färbung oder Western Blot. Aufgrund der dunklen Farbe und der Autofluoreszenz von Neuromelanin ist eine immunologische Färbung von Proteinen innerhalb von Neuromelaningranulaten entweder mit Meerrettichperoxidase- oder fluorophorkonjugierten Antikörpern nicht anwendbar. Für die Western-Blot-Analyse wären sehr große Mengen an postmortalem Gewebe erforderlich. Daher werden ausgewählte Proteine durch gezielte Massenspektrometrie validiert und im vorliegenden Fall wurden parallele Reaktionsüberwachungsexperimente (PRM) aufgebaut.
Die spezifische Isolierung von NMGs und SN-Gewebe ist der wichtigste Schritt für die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls. Über die Funktion Field of View Analysis in der vom Hersteller bereitgestellten Software des LMD können NMGs automatisch farbabhängig ausgewählt werden. Daher müssen Gewebebereiche, die NMGs enthalten (Abbildung 2A), identifiziert und eine Sichtfeldanalyse mit angepassten Farbschwellen durchgeführt werden, was zur Markierung von NMGs führt (<...
LMD ist eine weit verbreitete Technik zur Isolierung bestimmter Gewebebereiche, einzelner Zellen oder subzellulärer Strukturen. In dem hier vorgestellten überarbeiteten und automatisierten Protokoll wird diese Technik zur spezifischen Isolierung von Neuromelaningranula (NMGs) und NMG-umgebendem Gewebe (SN) angewendet. Bisher wurden zwei verschiedene Ansätze zur Isolierung von NMGs aus menschlichem postmortalem Hirngewebe veröffentlicht und weit verbreitet:
a) Ein diskontinuierlich...
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Diese Arbeit wurde unterstützt von de. NBI, ein Projekt des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) (Förderkennzeichen FKZ 031 A 534A) und P.U.R.E. (Protein Research Unit Ruhr within Europe) und Center for Protein Diagnostics (ProDi) Grants, beide vom Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen, Deutschland.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
Name of Software | Weblink/Company | Version | |
FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
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