Laser-Mikrodissektions-basiertes Protokoll für die LC-MS/MS-Analyse des proteomischen Profils von Neuromelanin-Granulaten

Zusammenfassung

Hier wird ein robustes Protokoll zur Isolierung von Neuromelanin-Granulaten aus humanem postmortalem Substantia nigra pars compacta-Gewebe mittels Lasermikrodissektion vorgestellt. Dieses überarbeitete und optimierte Protokoll minimiert massiv die benötigte Zeit für die Probenentnahme, reduziert die erforderliche Probenmenge und verbessert die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen durch LC-MS/MS-Analyse.

Zusammenfassung

Neuromelanin ist ein schwarz-bräunliches Pigment, das in sogenannten Neuromelanin-Granula (NMGs) in dopaminergen Neuronen der Substantia nigra pars compacta vorkommt. Neben Neuromelanin enthalten NMGs eine Vielzahl von Proteinen, Lipiden und Metallen. Obwohl NMGs-haltige dopaminerge Neuronen bevorzugt bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson und Demenz mit Lewy-Körpern verloren gehen, ist nur wenig über den Mechanismus der NMG-Bildung und die Rolle von NMGs bei Gesundheit und Krankheit bekannt. Daher sind weitere Forschungen zur molekularen Charakterisierung von NMGs unerlässlich. Leider basieren Standardprotokolle für die Isolierung von Proteinen auf der Ultrazentrifugation mit Dichtegradienten und erfordern daher hohe Mengen an menschlichem Gewebe. So wird hier ein automatisiertes Lasermikrodissektionsprotokoll (LMD) etabliert, das die Entnahme von NMGs und umgebendem Substantia nigra (SN)-Gewebe mit minimalen Gewebemengen unvoreingenommen und automatisiert ermöglicht. Ausgeschnittene Proben werden anschließend mittels Massenspektrometrie analysiert, um ihre proteomische Zusammensetzung zu entschlüsseln. Mit diesem Workflow wurden 2.079 Proteine identifiziert, von denen 514 Proteine ausschließlich in NMGs und 181 in SN identifiziert wurden. Die vorliegenden Ergebnisse wurden mit einer früheren Studie verglichen, die einen ähnlichen LMD-basierten Ansatz verwendete, der eine Überlappung von 87,6% für beide Proteome erreichte, was die Anwendbarkeit des hier vorgestellten überarbeiteten und optimierten Protokolls bestätigt. Um aktuelle Ergebnisse zu validieren, wurden interessante Proteine mittels gezielter Massenspektrometrie analysiert, z.B. Parallel Reaction Monitoring (PRM)-Experimente.

Einleitung

Jedes Gewebe besteht aus einer heterogenen Mischung verschiedener Zelltypen, aber die spezifische Isolierung eines Zelltyps ist für eine genauere Charakterisierung oft unerlässlich. Die Lasermikrodissektion (LMD), die ein Mikroskop mit einer Laseranwendung koppelt, ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur spezifischen Isolierung von Gewebebereichen, einzelnen Zellen oder zellulären Substrukturen aus einem komplexen Verbund. Die Anwendung von LMD in Kombination mit Massenspektrometrie (LMD-MS) wurde bereits erfolgreich für mehrere Forschungsfragen umgesetzt, darunter die Isolierung von DNA¹, RNA² und Proteinen

Protokoll

Die Verwendung von menschlichem Hirngewebe wurde von der Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum (Aktenzeichen 4760-13) nach deutschen Vorschriften und Richtlinien genehmigt. Dieses Protokoll wurde auf kommerziell gewonnene Gewebeschnitte von Substantia nigra pars compacta angewendet. Eine grafische Übersicht über das vorgestellte Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Gewebeschnitt

1. Die Kryostatkammer vorkühlen.
   HINWEIS: Jedes Gewebe benötigt unterschiedliche Kryostattemperaturen, die im jeweiligen Herstellerprotokoll zu finden sind.
2. Reinigen Sie das Ed....

Ergebnisse

Die spezifische Isolierung von NMGs und SN-Gewebe ist der wichtigste Schritt für die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls. Über die Funktion Field of View Analysis in der vom Hersteller bereitgestellten Software des LMD können NMGs automatisch farbabhängig ausgewählt werden. Daher müssen Gewebebereiche, die NMGs enthalten (Abbildung 2A), identifiziert und eine Sichtfeldanalyse mit angepassten Farbschwellen durchgeführt werden, was zur Markierung von NMGs führt (<.......

Diskussion

LMD ist eine weit verbreitete Technik zur Isolierung bestimmter Gewebebereiche, einzelner Zellen oder subzellulärer Strukturen. In dem hier vorgestellten überarbeiteten und automatisierten Protokoll wird diese Technik zur spezifischen Isolierung von Neuromelaningranula (NMGs) und NMG-umgebendem Gewebe (SN) angewendet. Bisher wurden zwei verschiedene Ansätze zur Isolierung von NMGs aus menschlichem postmortalem Hirngewebe veröffentlicht und weit verbreitet:

a) Ein diskontinuierlich.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-dithiothreitol	AppliChem	A1101
Acetonitrile	Merck	1.00029.2500
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	A6141
Formic acid	Sigma-Aldrich	56302
Iodoacetamide	AppliChem	A1666,0100
Micro Tube 500	Carl Zeiss	415190-9221-000
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ
PALM MicroBeam	Zeiss	494800-0014-000
PEN Membrane slide	Carl Zeiss	415190-9041-000
substantia nigra pars compacta tissue slices	Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain)
Trifluoroacetic acid	Merck	91707
Trypsin sequencing grade	Serva	37283.01
Ultimate 3000 RSLC nano LC system	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Name of Software	Weblink/Company	Version
FreeStyle	Thermo Fisher Scientific	1.6
MaxQuant	https://www.maxquant.org/	1.6.17.0
PALMRobo	Zeiss	4.6 pro
Perseus	https://www.maxquant.org/perseus/	1.6.15.0
Skyline	https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view	20.2.0.343
XCalibur	Thermo Fisher Scientific	4.3