JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول ثقافة مشتركة للورم الدبقي والخلايا النجمية ذات الاتصال المباشر المنقوشة باستخدام طباعة التلامس الدقيق على طبقات متعددة الإلكتروليتات (PEMs) لنمط خلايا U87 أو A172 GBM والخلايا النجمية الأولية.

Abstract

الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM) هو أكثر سرطانات الدماغ الخبيثة وفرة وفتكا. هناك أكثر من 13,000 حالة متوقعة في الولايات المتحدة في عامي 2020 و 2021. غالبا ما تنشأ أورام GBM من الخلايا النجمية وتتميز بطبيعتها الغازية ، وغالبا ما تقوم بتجنيد الأنسجة السليمة في أنسجة الورم. يعد فهم التواصل بين الخلايا النجمية وخلايا الورم الأرومي الدبقي أمرا حيويا للفهم الجزيئي لتطور الورم. يوضح هذا البروتوكول طريقة جديدة للثقافة المشتركة المزخرفة للتحقيق في التأثيرات بوساطة التلامس للخلايا النجمية على GBM باستخدام التجميع طبقة تلو الأخرى والزخرفة المدفوعة بالقوة الشعرية الدقيقة. تشمل المزايا بيئة زراعة الخلايا الخالية من البروتين والتحكم الدقيق في التفاعل الخلوي الذي تمليه أبعاد النمط. توفر هذه التقنية بروتوكولا متعدد الاستخدامات واقتصاديا وقابلا للتكرار لمحاكاة التفاعل الخلوي بين الورم الدبقي والخلايا النجمية في أورام الورم الدبقي. يمكن استخدام هذا النموذج أيضا لتمييز التغييرات في البيولوجيا الجزيئية GBM بسبب الاتصال الجسدي بالخلايا النجمية أو مع اتصال العامل المساعد القابل للذوبان بوساطة عدم التلامس.

Introduction

الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال (GBM) هو أكثر أنواع سرطان الدماغ غزارة وفتاكا في الولايات المتحدة بمتوسط وقت البقاء على قيد الحياة يبلغ حوالي 15 شهرا1. أقل من 7٪ من مرضى GBM يعيشون أكثر من 5 سنوات بعد التشخيص1،2. بحلول 10 سنوات ، ينخفض هذا الرقم إلى أقل من 1٪ 1،2. على الرغم من أن أنواع السرطان الأخرى قد حققت تحسينات ملحوظة في البقاء على قيد الحياة في العقود الأخيرة ، إلا أن نجاح مرضى GBM لا يقصر. لتطوير تدخلات علاجية ناجحة ، يجب استخدام نموذج مناسب في الموقع لتطوير فهم أكثر شمولا لبيولوجيا ورم GBM. هذا الفهم أمر بالغ الأهمية في تحسين النتائج السريرية لمرضى GBM.

يحتوي الدماغ على مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا ، كل منها يملأ منافذ محددة لتعزيز وظيفة الكائن الحي والبقاء على قيد الحياة. بالإضافة إلى الخلايا العصبية ، هناك مجموعة متنوعة من الخلايا الدبقية ، بما في ذلك الخلايا النجمية والخلايا الدبقية قليلة التغصن والخلايا الدبقية الصغيرة. الخلايا النجمية ، على وجه الخصوص ، متورطة في نمو ورم GBM وغزوه من خلال إفراز العوامل القابلة للذوبان المؤيدة للهجرة3. علاوة على ذلك ، هناك بعض التقارير التي تفيد بأن الاتصال الجسدي هو القوة الدافعة لهجرة خلايا الورم الدبقي بوساطة الخلايا النجمية وغزو4،5. ومع ذلك ، فإن الأساس الجزيئي الذي يقود هذا التغيير لا يزال غير معروف إلى حد كبير.

من أجل دراسة التأثيرات بوساطة الخلايا النجمية على نمو الورم ، يقدم هذا البروتوكول تقريرا عن تطوير طريقة قابلة للتكرار وخالية من البروتين لزخرفة الخلايا في المختبر . في هذه الطريقة ، يتم تجميع الطبقات متعددة الإلكتروليت (PEMs) بشكل منهجي لتشكيل سطح موحد خال من البروتين. يتم بناء PEMs باستخدام نظام polycation-polyanion الذي يتكون من بولي (كلوريد ثنائي ميثيل الأمونيوم) (PDAC) وبولي سلفونات (ستيرين) (SPS) ، على التوالي. تم اختيار هذه البوليمرات بناء على الدراسات السابقة التي أبلغت عن ارتباط تفضيلي للخلايا ب SPS على PDAC6،7،8،9،10. على أسطح PEM هذه ، يستخدم هذا البروتوكول الطباعة الحجرية لقوة الشعيرات الدموية الدقيقة لهندسة نماذج الزراعة المشتركة المزخرفة للخلايا النجمية الأولية وخلايا GBM.

تسمح التقنيات المعروضة هنا بالهندسة الدقيقة لتفاعلات خلية خلوية معينة من خلال التحكم في الزخرفة السطحية ، وبالتالي دعم التحقيق القابل للتكرار بدرجة كبيرة للاتصالات الخلوية. علاوة على ذلك ، يسهل سطح المحاكاة الحيوية المتأصل في هذه المنصة دراسة الاتصال المباشر بين الخلية والخلية وهو أمر بالغ الأهمية لتعميق الفهم الميكانيكي للتواصل بين أنواع الخلايا المختلفة. علاوة على ذلك ، فإن الطريقة منخفضة التكلفة ، مما يوفر ميزة كبيرة لإجراء دراسات في المختبر لاستكشاف الاتصالات الخلوية. على وجه التحديد ، يستغل هذا البروتوكول الارتباط التفاضلي ل GBM على SPS (-) عبر PDAC (+) لإنشاء ثقافات مشتركة منقوشة لخطوط خلايا GBM والخلايا النجمية الأولية.

Protocol

أجريت هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبر التابع للمعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على بجامعة نبراسكا لينكولن (معرف المشروع: 1046). تم تحضير الخلايا النجمية الأولية من صغار الفئران Sprague-Dawley البالغة من العمر 1-3 أيام وفقا لبروتوكول IACUC 1046 الخاص ب UNL ووفقا للبروتوكول مع تعديلات طفيفة7،11.

1. الاستعدادات

  1. احصل على نمط رئيسي للهندسة المطلوبة قبل بدء هذا البروتوكول.
    ملاحظة: يتم استخدام رقائق السيليكون المتوفرة تجاريا والمحضرة باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الضوئية القياسية في هذا البروتوكول. نمط البداية الموصى به هو خطوط 100-200 ميكرومتر.
  2. إعداد المخازن المؤقتة والوسائط.
    1. تحضير محاليل بولي (ثنائي أليل ميثيل أمونيوم كلوريد) (PDAC) وبولي (ستيرين) (SPS) بوليمر سلفونات لطلاء الألواح.
      1. محلول طلاء PDAC هو 0.3 بالوزن ٪ PDAC و 0.1 M كلوريد الصوديوم في ddH2O.
      2. محلول طلاء SPS هو 30 ميكرومتر SPS و 0.1 م كلوريد الصوديوم في ddH2O.
        ملاحظة: 1 لتر من محلول طلاء PDAC و 1 لتر من محلول طلاء SPS يكفي لطلاء ستة ألواح ذات 6 آبار. يمكن إعادة استخدام الحلول 2-5 مرات. استبدل الحلول عندما تصبح غائمة.
    2. قم بإعداد وسائط زراعة الخلايا القياسية ، إذا لزم الأمر.
      1. الوسائط النجمية النموذجية و GBM هي ، على التوالي ، مصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco.
  3. الحصول على الخلايا أو تحضيرها أو إذابتها.
    ملاحظة: تم وصف هذا البروتوكول للخلايا النجمية الأولية للفئران المعزولة من الفئران حديثي الولادة لمدة 1-3 أيام وخلايا الورم الدبقي U87MG أو A172-MG. يمكن توسيع هذا البروتوكول إلى خطوط خلايا مماثلة بعد تأكيد الارتباط التفاضلي لخطوط الخلايا ذات الأهمية على أسطح البوليمر.
    1. بسبب فقدان الخلايا أثناء التلوين ، استخدم ما لا يقل عن 200,000 خلية جيجابايت في الدقيقة في اليوم 0 و 400,000 خلية نجمية أولية حية من الفئران في اليوم 1 لكل بئر في صفيحة من 6 آبار. اضبط أرقام الخلايا إذا كنت تستخدم بئر أو لوحة مختلفة الحجم.
      ملاحظة: يوصى باستخدام الخلايا النجمية الأولية من المقاطع 2-4 المعدة كما هو موضح من قبل ويلسون وزملاؤه12 لهذا البروتوكول. تم الحصول على خلايا الورم الدبقي تجاريا (انظر جدول المواد).

2. صب الختم Polydimethylsiloxane (PDMS)

  1. في حاوية يمكن التخلص منها ، تزن 12 جزءا (بالوزن) من البوليمر المسبق PDMS وجزء واحد (بالوزن) من عامل المعالجة. تخلط بقوة لمدة 2-4 دقائق حتى يمتلئ الخليط بالكامل بالفقاعات.
    ملحوظة: 26 جم من الخليط تكفي لطبق بتري واحد 100 مم.
  2. ضع الفلوروسيلان في مجفف الفلوروسيلان. ضع الحاوية التي تستخدم لمرة واحدة مع خليط البوليمر في المجفف لتفريغ الغاز لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: هذا يسمح للفقاعات بالخروج من الخليط. قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الوقت إذا كانت الفقاعات الكبيرة لا تزال موجودة بعد 20 دقيقة.
  3. ضع سيد الهيكل المزخرف مسبقا في طبق بتري. يسكب مزيج PDMS ببطء في طبق بتري فوق سيد الهيكل المزخرف مسبقا ، مع التأكد من تغطية السيد بالكامل. يبلغ سمك العمق الأمثل لطبقة PDMS حوالي 2-3 مم.
    ملاحظة: تجنب تكوين فقاعات هواء عن طريق سكب الخليط ببطء. تأكد من أن سيد السيليكون مستلقي بشكل مسطح في طبق بتري.
  4. احتفظ بطبق بتري في مجفف الفلوروسيلان حتى تتم إزالة جميع الفقاعات. يعالج طبق بتري في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إذا لم تكن درجة الحرارة 60 درجة مئوية متوفرة ، فقم بمعالجة طبق بتري عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  5. باستخدام مشرط حاد ، قم بقص بالتساوي وبرفق حول السيد.
    تنبيه: توخي الحذر عند استخدام مشرط. لا تترك الشفرة المكشوفة دون رقابة. المشارط حادة. استخدم احتياطات السلامة المناسبة لمنع الإصابة.
  6. قم بإزالة الختم باستخدام ملاقط وضعه على سطح تقطيع مثل لوح التقطيع. باستخدام مشرط ، قم بتقطيع الطوابع إلى حجم صغير بما يكفي لتناسب ألواح 6 آبار (حوالي 2.5 سم × 2.5 سم).

3. بناء متعدد الإلكتروليت متعدد الطبقات (PEMs)

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول طلاء البلازما بخزان أكسجين مضغوط مرفق وملحق خلط الغاز (انظر جدول المواد). أي طريقة لتنظيف سطح البوليسترين لزراعة الأنسجة (TCPS) بالتساوي بالبلازما مناسبة. قد يحتاج المستخدم إلى تحسين الوقت والشدة عند استخدام طريقة مختلفة لتنظيف البلازما.

  1. نظف البلازما طبقا من 6 آبار لمدة 7 دقائق.
    1. قم بنزيف الغرفة عن طريق تدوير الصمام ثلاثي الاتجاهات في مقدمة الباب إلى اليمين حتى يمكن سماع الهسهسة من إطلاق الهواء. أعد الصمام ثلاثي الاتجاهات إلى الوضع الرأسي بمجرد أن تكون قراءة الضغط أعلى من 1800 mTorr.
    2. افتح الباب وضع اللوحة المكونة من 6 آبار في الغرفة. أغلق الباب وقم بتشغيل مضخة التفريغ. قم بإخلاء الغرفة حتى يستقر الضغط حوالي 100 mTorr.
      ملاحظة: أثناء إخلاء الغرفة ، تأكد من أن خزان الأكسجين مفتوح ، وأن ضغط خرج الأكسجين هو 10 رطل لكل بوصة مربعة.
    3. افتح الصمام ثلاثي الاتجاهات إلى اليسار لمحاذاة الخط مع خرطوم إدخال الأكسجين. اسمح لغاز الأكسجين بالنزيف في الغرفة حتى يستقر الضغط بين 400 و 450 mTorr.
      ملاحظة: تأكد من أن ضغط الإدخال على مقياس التدفق هو 10 مم واضبطه إذا لزم الأمر.
    4. قم بتشغيل طاقة التردد اللاسلكي. انتظر حتى تتشكل البلازما (~ 15 ثانية) ، ثم ابدأ المؤقت لمدة 7 دقائق.
    5. بعد 7 دقائق ، قم بإيقاف تشغيل طاقة التردد اللاسلكي وأعد الصمام ثلاثي الاتجاهات إلى موضعه الرأسي. اسمح للغرفة بالإخلاء إلى 150 mTorr.
    6. قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ وانتظر حتى يرتفع الضغط إلى 1500 متر من الساعة. قم بتنفيس الغرفة عن طريق تدوير الصمام ثلاثي الاتجاهات إلى اليمين حتى يمكن سماع الهسهسة من إطلاق الهواء. عندما تكون قراءة الضغط أعلى من 1800 mTorr ، أدر الصمام ثلاثي الاتجاهات إلى موضعه الرأسي ، وافتح الباب واسترجع العينة.
  2. ضع الألواح المطلية بالبلازما في حمامات درجة حرارة الغرفة على النحو التالي: PDAC لمدة 20 دقيقة ، وماء DI لمدة 5 دقائق ، وماء DI لمدة 5 دقائق ، ومياه DI لمدة 5 دقائق ، ومياه DI لمدة 5 دقائق. تأكد من غمر سطح اللوحة بالكامل.
    ملاحظة: اختياريا ، يمكن استخدام صبغة منزلقة آلية لتقليل الوقت النشط. استخدم التحريك اللطيف ، إن وجد.
  3. كرر الخطوة السابقة ما مجموعه 10 مرات. اترك الأطباق تجف في الهواء.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق المجففة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى عدة أسابيع قبل الاستخدام.

4. زخرفة PEM عن طريق القولبة الدقيقة في الشعيرات الدموية

  1. اغسل طوابع PDMS بصابون مختبر لطيف متبوعا بماء DI. جفف الطوابع باستخدام ضاغط هواء وضعها على سطح مستو متحرك مثل غطاء لوحة 6 آبار غير مستخدم.
    اختياري: يمكن أيضا تجفيف الطوابع بالهواء. يجب تغطية الطوابع وحمايتها من الغبار أثناء التجفيف.
  2. قم بتغطية الطوابع بالبلازما ، كما هو موضح في الخطوة 3 ، لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة الطوابع على الفور من منظف البلازما وضعها على الألواح المعدة المكونة من 6 آبار.
  3. الماصة 10 ميكرولتر من محلول PDAC على طول الحافة السفلية للطابع ، مع توزيع البوليمر بثبات على طول الطابع. تأكد من إضافة البوليمر إلى جانب الختم مع فتحات من أنماط الخط للسماح بحدوث عمل الشعيرات الدموية.
  4. ضع وزنا 350 جراما فوق كل طابع لمدة 20 ثانية للمساعدة في فرض النمط. اترك الطوابع ترتاح على الأطباق لمدة 20 دقيقة.
  5. اغمس اللوحة في ماء DI وقشر الطوابع في اتجاه أنماط الخط. اغسل الطبق مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما في ماء DI.
  6. اغسل الطوابع بالصابون والماء وجففها بضاغط الهواء. اترك الطبق يجف في الهواء.
  7. إذا كنت جاهزا لزراعة الخلايا ، فقم بتعقيم الألواح تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في شفاط السلامة الحيوية من الفئة الثانية لمدة 8 ساعات على الأقل قبل الاستخدام مباشرة. الحد الأدنى لجرعة الأشعة فوق البنفسجية الإجمالية الموصى بها هو 400 مللي جول / سم2 عند 265 نانومتر. في حالة تصور الأنماط ، تخطي خطوة التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية ، وقم بتنفيذ الخطوة 5. إذا كنت جاهزا لزراعة الخلايا ، فقم بإجراء الخطوة 6 بعد التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية.

5. تصور الأنماط المختومة باستخدام الكربوكسي فلورسين (CFSE)

ملاحظة: قم بتنفيذ هذا الإجراء لتصور الأنماط المختومة أو تخطي هذه الخطوة وبدلا من ذلك قم بإعداد أنماط لزراعة الخلايا. بمجرد تلطيخ الأنماط ، لا يمكن استخدامها لزراعة الخلايا. بمجرد اكتساب الثقة الكافية في الختم ، يمكن استخدام الأنماط لزراعة الخلايا. الكربوكسي فلورسين حساس للضوء. وصمة عار ونقل في الظلام.

  1. ضع الأنماط المجففة والمختومة في محلول تلطيخ نمط CFSE (0.1 ميكرومتر CFSE في 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم) لمدة 60-90 دقيقة. اغسل الأنماط المختومة لمدة 5 دقائق في DI H2O مرتين.
    ملاحظة: في حالة استخدام شرائح زجاجية ، ضع الشريحة بأكملها في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على محلول التلوين. في حالة استخدام ألواح البئر ، أضف محلول تلطيخ كاف لتغطية النمط بأكمله.
  2. تصور الأنماط باستخدام مجهر مضان مناسب.
    1. قم بتشغيل لمبة الفلورسنت للسماح لها بالتسخين لمدة 10 دقائق. نظرا لأن الأنماط ملطخة ب CFSE ، استخدم مرشح التداخل الأزرق (IB) لتصور الأنماط الخضراء. عرض الأنماط والتقط الصور.

6. تلطيخ وبذر خلايا الورم الأرومي الدبقي باستخدام الكربوكسي فلورسين

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع أعمال زراعة الخلايا في خزانة سلامة حيوية مناسبة من الفئة الثانية.

  1. افصل الخلايا عن سطح المزرعة باستخدام 0.25٪ تربسين-EDTA ، وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية.
  2. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسائط زراعة الخلايا بدون مصل (DMEM و 1٪ بنسلين ستربتومايسين) ، وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإزالة المادة الطافية.
  3. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من PBS ونقلها إلى أنبوب معقم 1.5 مل. أضف 10 ميكرولتر من 10 ميكروغرام/مل من CFSE واخلطها جيدا على الفور عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ثم انقله إلى أنبوب معقم سعة 15 مل.
  4. أضف ما لا يقل عن 1 مل من وسط زراعة الخلايا (انظر الخطوة 1.2.2.1) لإخماد تفاعل صبغة CFSE. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسط زراعة الخلايا وانقلها إلى أنبوب معقم جديد سعة 15 مل.
  5. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في 5 مل من وسط زراعة الخلايا.
  6. كرر خطوة الغسيل السابقة مرتين.
  7. قم بزرع خلايا الورم الدبقي الملطخة (100 خلية / مم2 أو 100,000 خلية / بئر) في لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار منقوشة من الخطوة 4 باستخدام وسائط زراعة الخلايا النجمية. قم بزراعة الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2) لمدة 24 ساعة قبل إضافة الخلايا النجمية الملطخة في الخطوة 7.

7. تلطيخ وبذر الخلايا النجمية الأولية باستخدام PKH26

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع أعمال زراعة الخلايا في خزانة سلامة حيوية مناسبة من الفئة الثانية.

  1. افصل الخلايا عن سطح المزرعة باستخدام 0.25٪ تربسين-EDTA ، وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية.
  2. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسائط زراعة الخلايا بدون مصل (DMEM و 1٪ بنسلين ستربتومايسين) ، وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وإزالة المادة الطافية.
  3. قم بإعداد معلق خلية 2x عن طريق تعليق حبيبات الخلية في 0.5 مل من المخفف C بدرجة حرارة الغرفة من مجموعة PKH26.
  4. قم بإعداد محلول صبغ 2x (4 × 10-6 م) عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من PKH26 إلى 0.5 مل من المخفف C في أنبوب معقم سعة 1.5 مل. تحضير محلول الصبغة قبل الاستخدام مباشرة.
  5. أضف معلق خلية 2x إلى محلول صبغ 2x واخلطه على الفور عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
  6. احتضان تعليق الخلية لمدة 1-5 دقائق.
    ملاحظة: يحدث التلوين بسرعة ، والمخفف C ضار بالخلايا. الحضانة الأطول لا تعني صباغة أفضل.
  7. قم بإخماد التلوين عن طريق إضافة حجم لا يقل عن 5x من وسط زراعة الخلية واحتضانه لمدة 1 دقيقة لربط الصبغة الزائدة.
  8. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسائط زراعة الخلايا وانقلها إلى أنبوب جديد معقم سعة 15 مل.
  9. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 5 مل من PBS.
  10. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 5 مل من وسائط زراعة الخلايا.
  11. كرر الخطوتين 7.9 و 7.10 ليصبح المجموع ثلاث غسلات.
  12. قم بزرع الخلايا النجمية الملطخة (200 خلية / مم2 أو 200,000 خلية / بئر) بوسائط الخلايا النجمية (انظر الخطوة 1.2.2.1) في لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار منقوشة ومصنفة مسبقا بخلايا الورم الدبقي من الخطوة 6. زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية ، حاضنة 5٪ CO2 للوقت الذي يتم فيه إجراء التجارب.

8. التصوير الفلوري للثقافة الأحادية المزخرفة والثقافة المشتركة

  1. قم بتشغيل لمبة الفلورسنت للسماح لها بالتسخين لمدة 10 دقائق.
  2. قم بإزالة مزرعة الخلية من الحاضنة ووضعها على مسرح المجهر المقلوب القادر على التصوير الفلوري.
  3. أدخل الفلتر المناسب أو أرفقه. إذا كانت الخلايا التي يتم تصويرها ملطخة ب CFSE ، فاستخدم مرشح التداخل الأزرق (IB) لتصور الخلايا الخضراء. إذا كانت الخلايا التي يتم تصويرها ملطخة ب PKH26 ، فاستخدم مرشح الرودامين لتصور الخلايا الحمراء.
  4. عرض العينة والتقط الصور.
    ملاحظة: يمكن الآن فصل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل التأثيرات البيولوجية للاتصال بوساطة التلامس.

النتائج

يصف البروتوكول هنا هندسة الثقافة المشتركة المزخرفة بالاتصال المباشر لخلايا الورم الدبقي والخلايا النجمية. توفر هذه المنصة نموذجا متعدد الخلايا للمحاكاة الحيوية لدراسة دور الاتصال المباشر في الاتصال بين الخلايا النجمية وخلايا الورم الدبقي في تطور الورم الأرومي الدبق?...

Discussion

تشمل الخطوات الحاسمة لضمان التجميع الناجح للثقافة المشتركة المزخرفة القابلة للتكرار ما يلي: 1) الزخرفة الناجحة للسطح عن طريق القولبة الدقيقة في الشعيرات الدموية ، 2) الغسيل الناجح للخلايا الملطخة ، و 3) تحليل الثقافة المشتركة في نافذة "الثقافة الناضجة". أولا ، يعد الاستنس?...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل ، كليا أو جزئيا ، من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 1R01AA027189-01A1 (إلى SK ) ، P20 GM104320 (إلى منحة تجريبية لمركز نبراسكا للوقاية من أمراض السمنة إلى SK) ، P20 GM113126 (إلى مركز نبراسكا للاتصالات الجزيئية الحيوية المتكاملة - قائد مشروع S.K.) ؛ منحة البذور الطبية الحيوية لمكتب UNL للبحث والتطوير ومنحة أنظمة مبادرة أبحاث نبراسكا (إلى S.K.). تم تمويل K.M.S. من خلال T32GM107001 ، وهي منحة تدريبية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAFisher Scientific25200056
15 ml Nunc Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific12-565-268
5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl esterMillipore SigmaCat#21888
50 ml Nunc Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific12-565-270
A172-MG GBM cell lineATCCCRL-1620
Bright-Line HemacytometerSigmaZ359629Or other suitable cell counting device
Cell IncubatorN/AN/A
Cooled tabletop centrifuge for 15 mL tubesN/AN/A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)MP BiomedicalsICN 1033120
Expanded Plasma CleanerPlasma HarrickPDC-001-HPWith attached pressurized oxygen tank and PlasmaFlo Gas Mixer (PDC-FMG) accessory
Fetal Bovine Serum (FBS)Atlanta BiologicalsS11550H
FluorosilaneSigma Aldrich667420Full chemical name: 1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane
Inverted Tabletop MicroscopeN/AN/AMicroscope capable of fluorescent imaging with λex = 551 nm; λem 567 nm [e.g. Rhodamine filter] (PKH26 dye) and λex 492 nm; λem 517 nm [e.g. interference blue filter (IB)] (CFSE dye)
NaClSigma AldrichS7653
NaOHSigma Aldrich567530
Penicillin-StreptomicenFisher Scientific15140122
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini KitMillipore SigmaCat#MINI26-1KT
Poly(diallyldimethylammonium chloride) solution (PDAC)Sigma Aldrich40901420 wt. % in H2O
Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (SPS)Sigma Aldrich243051average MW ~70,000
Primary Astrocytes, isolated from Srague Dawley ratsCharles RiverCrl:SDRats from Charles River; Lab isolated Cells
ScalpelN/AN/A
Sodium bicarbonateSigma AldrichS5761
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow ChemicalCat#2646340
Trypan Blue StainFisher Scientific15-250-061
TryplEFisher ScientificGibco TrypLE
U87-MG GBM cell lineATCCHTB-14
Vacuum DesiccatorN/AN/A

References

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2012-2016. Neuro Oncology. 21, 1 (2019).
  2. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2010-2014. Neuro Oncology. 19, 1-88 (2017).
  3. Roos, A., Ding, Z., Loftus, J. C., Tran, N. L. Molecular and microenvironmental determinants of glioma stem-like cell survival and invasion. Frontiers in Oncology. 7, 120 (2017).
  4. Rath, B. H., Fair, J. M., Jamal, M., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Astrocytes enhance the invasion potential of glioblastoma stem-like cells. PLoS One. 8 (1), 54752 (2013).
  5. Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. The Journal of Neuroscience. 23 (10), 4034-4043 (2003).
  6. Daverey, A., Brown, K. M., Kidambi, S. Breast cancer/stromal cells coculture on polyelectrolyte films emulates tumor stages and miRNA profiles of clinical samples. Langmuir. 31 (36), 9991-10001 (2015).
  7. Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Advanced Functional Materials. 18 (2), 294-301 (2008).
  8. Kidambi, S., et al. Patterned co-culture of primary hepatocytes and fibroblasts using polyelectrolyte multilayer templates. Macromolecular Bioscience. 7 (3), 344-353 (2007).
  9. Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Controlling primary hepatocyte adhesion and spreading on protein-free polyelectrolyte multilayer films. Journal of the American Chemical Society. 126 (50), 16286-16287 (2004).
  10. Mohammed, J. S., DeCoster, M. A., McShane, M. J. Micropatterning of nanoengineered surfaces to study neuronal cell attachment in vitro. Biomacromolecules. 5 (5), 1745-1755 (2004).
  11. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nature Protocols. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  12. Wilson, C. L., Hayward, S. L., Kidambi, S. Astrogliosis in a dish: substrate stiffness induces astrogliosis in primary rat astrocytes. Rsc Advances. 6 (41), 34447-34457 (2016).
  13. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Studying cell-cell communication in co-culture. Biotechnololgy Journal. 8 (4), 395-396 (2013).
  14. Chen, W., et al. Glioma cells escaped from cytotoxicity of temozolomide and vincristine by communicating with human astrocytes. Medical Oncology. 32 (3), 43 (2015).
  15. Belot, N., et al. Molecular characterization of cell substratum attachments in human glial tumors relates to prognostic features. Glia. 36 (3), 375-390 (2001).
  16. Sin, W. C., et al. Astrocytes promote glioma invasion via the gap junction protein connexin43. Oncogene. 35 (12), 1504-1516 (2016).
  17. Sin, W. C., Crespin, S., Mesnil, M. Opposing roles of connexin43 in glioma progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 2058-2067 (2012).
  18. Oliveira, R., et al. Contribution of gap junctional communication between tumor cells and astroglia to the invasion of the brain parenchyma by human glioblastomas. BMC Cell Biology. 6 (1), 7 (2005).
  19. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
  20. Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment). Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 172-183 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

GBM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved