Polyelectrolyte Multilayer Template을 사용하여 패턴화된 성상세포와 교모세포종 세포의 직접 접촉 공동 배양

요약

이 프로토콜은 U87 또는 A172 GBM 세포 및 1차 성상세포를 패턴화하기 위해 고분자 전해질 다층(PEM)에 마이크로 접촉 인쇄를 사용하여 패턴화된 직접 접촉 신경교종-성상세포 공동 배양을 설명합니다.

초록

다형성 교모세포종(GBM)은 가장 풍부하고 치명적인 악성 뇌암입니다. 2020년과 2021년에 미국에서는 13,000건 이상의 사례가 발생할 것으로 예상됩니다. 교모세포종은 대부분 성상세포에서 발생하며, 건강한 조직을 종양 조직으로 동원하는 침습적 특성이 특징입니다. 성상세포와 교모세포종 세포 간의 통신을 이해하는 것은 종양 진행에 대한 분자적 이해에 필수적입니다. 이 프로토콜은 층별 조립 및 미세 모세관 힘 기반 패터닝을 사용하여 교모세포종에 대한 성상세포의 접촉 매개 효과를 조사하기 위한 새로운 패턴화된 공동 배양 방법을 보여줍니다. 장점으로는 단백질이 없는 세포 배양 환경과 패턴 치수에 따라 결정되는 세포 상호 작용의 정밀한 제어가 있습니다. 이 기술은 신경교종 종양에서 신경교종과 성상세포 사이의 세포 상호작용을 모방하기 위한 다재다능하고 경제적이며 재현 가능한 프로토콜을 제공합니다. 이 모델은 성상세포와의 물리적 접촉 또는 비접촉 매개 용해성 보조인자 전달로 인한 교모세포종 분자생물학의 변화를 구별하는 데 추가로 사용할 수 있습니다.

서문

다형성 교모세포종(GBM)은 미국에서 가장 많이 발생하고 치명적인 뇌종양으로, 평균 생존 기간은 약 15개월이다¹. 다형성 교모세포종 환자의 7% 미만이 진단 후 5년 이상 생존한다 ^1,2. 10년이 지나면 이 수치는 1% 미만으로 떨어집니다^1,2. 최근 수십 년 동안 다른 유형의 암들이 생존율이 현저히 향상되었지만, 교모세포종 환자의 성공률은 미흡하다. 성공적인 치료 중재를 개발하기 위해서는 교모세포종 종양 생물학에 대한 보다 철저한 이해를 개발하기 위해 적절한 현장 모델을 활용해야 합니다. 이러한 이해는 교모세포종 환자의 임상 결과를 개선하는 데 중요합니다.

뇌에는 매우 다양한 세포 유형이 포함되어 있으며, 각 세포는 유기체의 기능과 생존을 촉진하기 위해 특정 틈새를 채웁니다. 뉴런 외에도 성상세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte), 미세아교세포(microglia)를 포함한 다양한 신경교세포(glial cell)가 있습니다. 특히 성상세포(astrocyte)는 이동성 용해성 인자(pro-migrationatory soluble factor)의 분비를 통해 교모세포종의 성장과 침입에 관여한다³. 또한, 신체 접촉이 성상세포 매개 신경교종 세포 이동 및 침입의 원동력이라는 일부 보고가 있습니다 ^4,5. 그러나 이러한 변화를 주도하는 분자적 기반은 아직 크게 알려지지 않았습니다.

종양 성장에 대한 성상세포의 접촉 매개 효과를 연구하기 위해 이 프로토콜은 체외 세포 패터닝을 위한 재현 가능한 단백질이 없는 방법의 개발에 대해 보고합니다. 이 방법에서는 고분자 전해질 다층(PEM)을 체계적으로 조립하여 균일한 단백질이 없는 표면을 형성합니다. PEM은 각각 폴리(디알릴메틸암모늄 클로라이드)(PDAC) 및 설폰화 폴리(스테렌)(SPS)로 구성된 폴리양이온-폴리음이온 시스템을 사용하여 구축됩니다. 이러한 중합체는 PDAC ^6,7,8,9,10보다 SPS에 세포가 우선적으로 부착된다고 보고한 이전 연구를 기반으로 선택되었습니다. 이러한 PEM 표면에서 이 프로토콜은 미세모세혈관 리소그래피를 활용하여 1차 성상세포 및 교모세포종 세포의 패턴화된 공동 배양 모델을 엔지니어링합니다.

여기에 제시된 기술은 표면 패터닝의 제어를 통해 특정 세포-세포 상호 작용의 정밀한 엔지니어링을 가능하게 하여 세포 통신에 대한 재현성이 높은 조사를 지원합니다. 또한, 이 플랫폼에 내재된 생체 모방 표면은 서로 다른 세포 유형 간의 통신에 대한 기계론적 이해를 심화하는 데 중요한 직접 세포 간 통신에 대한 연구를 용이하게 합니다. 이 외에도 이 방법은 비용이 저렴하여 세포 통신을 탐구하기 위해 체외 연구를 수행하는 데 상당한 이점을 제공합니다. 특히, 이 프로토콜은 PDAC(+)를 통해 SPS(-)에 교모세포종의 차등 부착을 활용하여 교모세포종 세포주와 1차 성상세포의 패턴화된 공동 배양을 생성합니다.

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프로토콜

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 권장 사항에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 이 프로토콜은 네브래스카-링컨 대학교(University of Nebraska-Lincoln)의 동물 실험 윤리 위원회(Committee on the Ethics of Animal Experiments)에 의해 승인되었습니다(프로젝트 ID: 1046). 1차 성상세포는 UNL의 IACUC 프로토콜 1046에 따라 그리고 프로토콜에 따라 ^7,111, 약간의 수정을 가하여 생후 1-3일 된 Sprague-Dawley 새끼 쥐에서 준비되었습니다.

1. 준비 사항

1. 이 프로토콜을 시작하기 전에 원하는 형상의 마스터 패턴을 얻습니다.
   참고: 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 제조된 시판되는 실리콘 웨이퍼가 이 프로토콜에 사용됩니다. 권장되는 시작 패턴은 100-200μm 라인입니다.
2. 버퍼 및 미디어를 준비합니다.
   1. 플레이트를 코팅하기 위해 폴리(디알릴메틸암모늄 클로라이드)(PDAC) 및 설폰화 폴리(스테렌)(SPS) 폴리머 용액을 준비합니다.
      1. PDAC 코팅 용액은_ddH2O에 0.3wt. % PDAC 및 0.1M NaCl입니다.
      2. SPS 코팅 용액은 ddH₂O에서 30 μM SPS 및 0.1 M NaCl입니다.
         참고: PDAC 코팅 용액 1L와 SPS 코팅 용액 1L는 6웰 플레이트 6개를 코팅하기에 충분합니다. 용액은 2-5회 재사용할 수 있습니다. 솔루션이 흐려지면 교체하십시오.
   2. 필요한 경우 표준 세포 배양 배지를 준비합니다.
      1. 일반적인 성상세포와 교모세포종 배지는 각각 10%의 소 태아 혈청(FBS)과 1%의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 있습니다.
3. 세포를 얻거나, 준비하거나, 해동합니다.
   참고: 이 프로토콜은 1-3일 신생아 쥐 및 U87MG 또는 A172-MG 신경교종 세포에서 분리된 1차 쥐 성상세포에 대해 설명됩니다. 이 프로토콜은 폴리머 표면에서 관심 세포주의 차등 부착을 확인한 후 유사한 세포주로 확장할 수 있습니다.
   1. 염색 중 세포 손실로 인해 6-well 플레이트에서 웰당 0일차에 최소 200,000개의 GBM 세포를 사용하고 1일차에 400,000개의 살아있는 1차 쥐 성상세포를 사용합니다. 다른 크기의 우물 또는 플레이트를 사용하는 경우 셀 번호를 조정하십시오.
      참고: Wilson과 동료¹²가 설명한 대로 준비된 2-4번 통로의 1차 성상세포가 이 프로토콜에 권장됩니다. 신경교종 세포는 상업적으로 얻어졌다( 재료 표 참조).

2. 폴리디메틸실록산(PDMS) 스탬프 성형

1. 일회용 용기에 PDMS 프리폴리머 12부(중량 기준)와 경화제 1중량(중량 기준)의 무게를 잰다. 전체 혼합물이 거품으로 채워질 때까지 2-4분 동안 세게 섞습니다.
   참고: 26g의 혼합물은 100mm 페트리 접시 하나에 충분합니다.
2. 플루오로실란을 플루오로실란 데시케이터에 넣습니다. 폴리머 혼합물이 담긴 일회용 용기를 데시케이터에 넣어 20분 동안 가스를 제거합니다.
   알림: 이렇게 하면 혼합물에서 거품이 올라올 수 있습니다. 20분 후에도 큰 거품이 여전히 존재하는 경우 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다.
3. 미리 패턴화된 구조 마스터를 페트리 접시에 놓습니다. PDMS 혼합물을 사전 패턴화된 구조 마스터 위의 페트리 접시에 천천히 붓고 마스터를 완전히 덮습니다. PDMS 층의 최적 깊이는 약 2-3mm 두께입니다.
   알림: 혼합물을 천천히 부어 기포가 생성되지 않도록 하십시오. 실리콘 마스터가 페트리 접시에 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오.
4. 모든 거품이 제거될 때까지 페트리 접시를 플루오로실란 건조제에 보관하십시오. 페트리 접시를 60°C의 오븐에서 1시간 동안 경화시킵니다. 60°C를 사용할 수 없는 경우 37°C에서 페트리 접시를 밤새 경화시킵니다.
5. 날카로운 메스를 사용하여 마스터 주위를 고르고 부드럽게 자릅니다.
   주의: 메스를 사용할 때 주의하십시오. 노출된 칼날을 방치하지 마십시오. 메스는 날카롭습니다. 부상을 방지하기 위해 적절한 안전 예방 조치를 취하십시오.
6. 핀셋을 사용하여 스탬프를 제거하고 도마 등의 절단면에 놓습니다. 메스를 사용하여 스탬프를 6웰 플레이트(약 2.5cm x 2.5cm)에 들어갈 만큼 작은 크기로 자릅니다.

3. 고분자 전해질 다층(PEM) 구축

알림: 이 프로토콜은 부착된 가압 산소 탱크와 가스 혼합 액세서리가 있는 플라즈마 코팅을 설명합니다( 재료 표 참조). 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 표면을 균일하게 플라즈마 세척하는 모든 방법이 적합합니다. 다른 플라즈마 세척 방법을 사용할 때 사용자가 시간과 강도를 최적화해야 할 수 있습니다.

1. 6웰 플레이트를 7분 동안 플라즈마 세척합니다.
   1. 공기 배출에서 쉿 소리가 들릴 때까지 도어 전면에 있는 3방향 밸브를 오른쪽으로 돌려 챔버의 공기를 빼냅니다. 압력 판독값이 1800mTorr 이상이면 3방향 밸브를 다시 수직 위치로 돌립니다.
   2. 도어를 열고 6웰 플레이트를 챔버에 넣습니다. 도어를 닫고 진공 펌프를 켭니다. 압력이 약 100mTorr로 안정될 때까지 챔버를 비웁니다.
      알림: 챔버가 대피하는 동안 산소 탱크가 열려 있고 산소의 출력 압력이 10psi인지 확인하십시오.
   3. 왼쪽에 있는 3방향 밸브를 열어 라인을 산소 입력 호스에 맞춥니다. 압력이 400mTorr에서 450mTorr 사이로 안정화될 때까지 산소 가스가 챔버로 흘러 들어가도록 합니다.
      알림: 유량계의 입력 압력이 10mm인지 확인하고 필요한 경우 조정하십시오.
   4. RF 전원을 켭니다. 플라즈마가 형성될 때까지 기다린 다음(~15초) 7분 동안 타이머를 시작합니다.
   5. 7분 후 RF 전원을 끄고 3방향 밸브를 수직 위치로 다시 돌립니다. 챔버가 150mTorr로 대피하도록 합니다.
   6. 진공 펌프를 끄고 압력이 1500mTorr로 상승할 때까지 기다립니다. 공기 방출에서 쉿 소리가 들릴 때까지 3방향 밸브를 오른쪽으로 돌려 챔버를 환기시킵니다. 압력 판독값이 1800mTorr 이상이면 3방향 밸브를 다시 수직 위치로 돌리고 도어를 열고 샘플을 회수합니다.
2. 플라즈마 코팅된 플레이트를 PDAC 20분 동안, DI 물 5분, DI 물 5분, SPS 20분 동안, DI 물 5분, DI 물 5분 동안 다음과 같이 실온 수조에 놓습니다. 전체 플레이트 표면이 물에 잠겨 있는지 확인하십시오.
   참고: 선택적으로, 자동 슬라이드 염색기를 사용하여 활성 시간을 줄일 수 있습니다. 가능한 경우 부드럽게 저어줍니다.
3. 이전 단계를 총 10회 반복합니다. 접시를 자연 건조시키십시오.
   알림: 건조된 플레이트는 사용하기 전에 최대 몇 주 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.

4. 모세관의 미세 성형 을 통한 PEM 패터닝

1. PDMS 스탬프를 순한 실험실 비누로 씻은 다음 DI 물로 씻습니다. 공기 압축기를 사용하여 스탬프를 건조시키고 사용하지 않은 6웰 플레이트 뚜껑과 같은 평평하고 움직일 수 있는 표면에 놓습니다.
   선택 사항: 스탬프는 자연 건조도 가능합니다. 스탬프는 건조하는 동안 덮고 먼지로부터 보호해야 합니다.
2. 플라즈마는 3단계에서 설명한 대로 1분 동안 스탬프를 코팅합니다. 즉시 플라즈마 클리너에서 스탬프를 제거하고 준비된 6웰 플레이트에 앞면이 아래로 향하게 놓습니다.
3. 스탬프의 하단 가장자리를 따라 10 μL의 PDAC 용액을 피펫팅하여 스탬프의 길이를 따라 폴리머를 꾸준히 분배합니다. 모세관 작용이 일어날 수 있도록 선 패턴의 개구부가 있는 스탬프 측면에 폴리머를 추가해야 합니다.
4. 패턴을 강화하는 데 도움이 되도록 각 스탬프 위에 350g 무게를 20초 동안 놓습니다. 스탬프를 접시에 20분 동안 놓아둡니다.
5. 플레이트를 DI 물에 담그고 선 패턴 방향으로 스탬프를 떼어냅니다. DI 물에 각각 5분 동안 접시를 두 번 씻습니다.
6. 비누와 DI 물로 스탬프를 씻고 공기 압축기로 말리십시오. 접시를 자연 건조시키십시오.
7. 세포 배양을 할 준비가 되면 사용 직전에 최소 8시간 동안 Class II 생물 안전 후드에서 자외선 아래에서 플레이트를 멸균합니다. 최소 권장 총 UV-C 선량은 265nm에서 400mJ/^cm2 입니다. 패턴을 시각화하는 경우 UV 살균 단계를 건너뛰고 5단계를 수행합니다. 세포 배양 준비가 되면 UV 멸균 후 6단계를 수행합니다.

5. 카르복시플루오레세인(CFSE)을 사용한 스탬프 패턴 시각화

참고: 이 절차를 수행하여 스탬프 패턴을 시각화하거나 이 단계를 건너뛰고 대신 세포 배양을 위한 패턴을 준비합니다. 패턴이 염색되면 세포 배양에 사용할 수 없습니다. 스탬핑에 대한 충분한 확신이 생기면 패턴을 세포 배양에 사용할 수 있습니다. 카르복시플루오레세인은 빛에 민감합니다. 어둠 속에서 얼룩과 운송.

1. 건조되고 스탬핑된 패턴을 CFSE 패턴 염색 용액(0.1M NaOH의 0.1μM CFSE)에 60-90분 동안 놓습니다. DI H₂O에서 5 분 동안 스탬프 패턴을 두 번 세척합니다.
   참고: 유리 슬라이드를 사용하는 경우 염색 용액이 들어 있는 50mL 튜브에 전체 슬라이드를 넣습니다. 웰 플레이트를 사용하는 경우 전체 패턴을 덮을 수 있을 만큼 충분한 염색 용액을 추가합니다.
2. 적절한 형광 현미경을 사용하여 패턴을 시각화합니다.
   1. 형광등을 켜서 10분 동안 예열합니다. 패턴은 CFSE로 염색되므로 간섭 파란색 필터(IB)를 사용하여 녹색 패턴을 시각화합니다. 패턴을 보고 사진을 찍습니다.

6. carboxyfluorescein를 가진 교모세포종 세포를 염색하고 씨를 뿌리기

참고: 모든 세포 배양 작업은 적절한 Class II 생물 안전성 캐비닛에서 수행해야 합니다.

1. 0.25% 트립신-EDTA로 배양 표면에서 세포를 분리하고 4°C에서 4분 동안 200 x g 에서 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.
2. 혈청이 없는 세포 배양 배지 1mL(DMEM 및 1% 페니실린-스트렙토마이신)에 세포를 재현탁하고, 4°C에서 4분 동안 200 x g 에서 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.
3. 1mL의 PBS에 세포를 재현탁하고 멸균 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 10 μL의 10 μg/mL CFSE를 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 즉시 완전히 혼합합니다. 실온에서 10분 동안 배양한 후 15mL 멸균 튜브로 옮깁니다.
4. 최소 1mL의 세포 배양 배지를 추가하여(단계 1.2.2.1 참조) CFSE 염료 반응을 소멸시킵니다. 400 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다. 5mL의 세포 배양 배지에 세포를 재현탁시키고 새로운 15mL 멸균 튜브로 옮깁니다.
5. 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리기를 하고 상층액을 제거하고 5mL의 세포 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.
6. 이전 세척 단계를 두 번 반복합니다.
7. 염색된 신경교종 세포(100 cells/^mm2 또는 100,000 cells/well)를 4단계의 패턴화된 6-well 조직 배양 플레이트에 성상교세포 배양 배지를 사용하여 파종합니다. 7단계에서 염색된 성상세포를 추가하기 전에 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.

7. PKH26을 가진 1차 성상세포를 염색하고 파종하기

참고: 모든 세포 배양 작업은 적절한 Class II 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.

1. 0.25% 트립신-EDTA로 배양 표면에서 세포를 분리하고 4°C에서 4분 동안 200 x g 에서 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.
2. 혈청이 없는 세포 배양 배지 1mL(DMEM 및 1% 페니실린-스트렙토마이신)에 세포를 재현탁하고, 4°C에서 4분 동안 200 x g 에서 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.
3. PKH26 키트의 0.5mL 실온 희석제 C에 세포 펠릿을 재현탁하여 2x 세포 현탁액을 준비합니다.
4. 멸균 1.5mL 튜브에 2μL의 PKH26을 0.5mL의 희석제 C에 첨가하여 2x 염료 용액(4 x ^10-6 M)을 준비합니다. 사용 직전에 염료 용액을 준비하십시오.
5. 2x 염료 용액에 2x 세포 현탁액을 추가하고 위아래로 피펫팅하여 즉시 혼합합니다.
6. 세포 현탁액을 1-5분 동안 배양합니다.
   참고: 염색이 빠르게 발생하며 희석제 C는 세포에 해롭습니다. 배양 기간이 길다고 해서 염색이 더 잘되는 것은 아닙니다.
7. 세포 배양 배지의 최소 5배 부피를 추가하고 1분 동안 배양하여 과도한 염료와 결합하여 염색을 담금질합니다.
8. 200 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 5mL의 세포 배양 배지에 세포를 재현탁하고 새로운 멸균 15mL 튜브로 옮깁니다.
9. 200 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거하고 PBS 5mL에 재현탁합니다.
10. 200 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거하고 5mL의 세포 배양 배지에 재현탁합니다.
11. 7.9단계와 7.10단계를 반복하여 총 3회 세탁합니다.
12. 6단계에서 신경교종 세포가 미리 파종된 패턴화된 6웰 조직 배양 플레이트에 성상세포 배지(1.2.2.1단계 참조)로 염색된 성상세포(200 cells^/mm2 또는 200,000 cells/well)를 파종합니다. 실험이 수행되는 동안 37 °C, 5 % CO₂ 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.

8. 패턴화된 단일 배양 및 공동 배양의 형광 이미징

1. 형광등을 켜서 10분 동안 예열합니다.
2. 인큐베이터에서 세포 배양액을 제거하고 형광 이미징이 가능한 도립 현미경의 스테이지에 놓습니다.
3. 적절한 필터를 삽입하거나 부착합니다. 이미징되는 세포가 CFSE로 염색된 경우 간섭 블루 필터(IB)를 사용하여 녹색 세포를 시각화합니다. 이미징 대상 세포가 PKH26으로 염색된 경우 Rhodamine 필터를 사용하여 빨간색 세포를 시각화합니다.
4. 표본을 보고 사진을 찍습니다.
   참고: 이제 유세포 분석을 사용하여 세포를 분리하여 접촉 매개 통신의 생물학적 효과를 분석할 수 있습니다.

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결과

여기의 프로토콜은 신경교종 세포와 성상세포의 직접 접촉 패턴 공동 배양의 엔지니어링을 설명합니다. 이 플랫폼은 다형성 교모세포종(GBM)의 진행에서 성상세포와 신경교종 세포 사이의 통신에서 직접 접촉의 역할을 연구하기 위한 생체 모방 다세포 모델을 제공합니다. 그림 1은 위에서 설명한 단계별 표면 변형 및 세포 도입 계획을 제공합니다. ?...

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토론

재현 가능한 패턴화된 공동 배양의 성공적인 조립을 보장하기 위한 중요한 단계에는 1) 모세혈관에서 미세 성형을 통한 표면의 성공적인 패터닝, 2) 염색된 세포의 성공적인 세척, 3) "성숙 배양" 창에서의 공동 배양 분석이 포함됩니다. 첫째, 모세혈관에서 마이크로 몰딩을 사용하여 패턴을 성공적으로 재현하는 것은 패턴화된 공동 배양을 무작위 공동 배양과 구별하는 요...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	25200056
15 ml Nunc Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-268
5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester	Millipore Sigma	Cat#21888
50 ml Nunc Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-270
A172-MG GBM cell line	ATCC	CRL-1620
Bright-Line Hemacytometer	Sigma	Z359629	Or other suitable cell counting device
Cell Incubator	N/A	N/A
Cooled tabletop centrifuge for 15 mL tubes	N/A	N/A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	MP Biomedicals	ICN 1033120
Expanded Plasma Cleaner	Plasma Harrick	PDC-001-HP	With attached pressurized oxygen tank and PlasmaFlo Gas Mixer (PDC-FMG) accessory
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11550H
Fluorosilane	Sigma Aldrich	667420	Full chemical name: 1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane
Inverted Tabletop Microscope	N/A	N/A	Microscope capable of fluorescent imaging with λex = 551 nm; λem 567 nm [e.g. Rhodamine filter] (PKH26 dye) and λex 492 nm; λem 517 nm [e.g. interference blue filter (IB)] (CFSE dye)
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
NaOH	Sigma Aldrich	567530
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit	Millipore Sigma	Cat#MINI26-1KT
Poly(diallyldimethylammonium chloride) solution (PDAC)	Sigma Aldrich	409014	20 wt. % in H2O
Poly(sodium 4-styrenesulfonate) (SPS)	Sigma Aldrich	243051	average MW ~70,000
Primary Astrocytes, isolated from Srague Dawley rats	Charles River	Crl:SD	Rats from Charles River; Lab isolated Cells
Scalpel	N/A	N/A
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Chemical	Cat#2646340
Trypan Blue Stain	Fisher Scientific	15-250-061
TryplE	Fisher Scientific	Gibco TrypLE
U87-MG GBM cell line	ATCC	HTB-14
Vacuum Desiccator	N/A	N/A