Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول هطول البروتين القائم على المذيبات في ظل ظروف خاضعة للرقابة من أجل الاسترداد والتنقية القويين والسريعين لعينات البروتيوم قبل قياس الطيف الكتلي.

Abstract

في حين أن التطورات المتعددة في أدوات قياس الطيف الكتلي (MS) قد حسنت التحليل النوعي والكمي للبروتينات، فإن النهج الأمامية الأكثر موثوقية لعزل البروتينات وإثرائها ومعالجتها قبل التصلب المتعدد أمر بالغ الأهمية لتوصيف البروتيوم الناجح. إن استرداد البروتين المنخفض وغير المتناسق والشوائب المتبقية مثل المواد الخافضة للتوتر السطحي تضر بتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. غالبا ما يعتبر هطول الأمطار البروتينية غير موثوق به ، ويستغرق وقتا طويلا ، ويمثل تحديا تقنيا للأداء مقارنة باستراتيجيات إعداد العينات الأخرى. يتم التغلب على هذه المخاوف من خلال استخدام بروتوكولات هطول الأمطار البروتينية المثلى. بالنسبة لهطول الأمطار الأسيتون ، فإن الجمع بين أملاح محددة ، والتحكم في درجة الحرارة ، وتكوين المذيبات ، ووقت هطول الأمطار أمر بالغ الأهمية ، في حين أن كفاءة ترسيب الكلوروفورم / الميثانول / الماء تعتمد على السحب السليم والتلاعب بالقارورة. بدلا من ذلك ، يتم تبسيط بروتوكولات هطول الأمطار هذه وشبه آلية داخل خرطوشة دوران يمكن التخلص منها. يتم توضيح النتائج المتوقعة من ترسيب البروتين القائم على المذيبات في الشكل التقليدي واستخدام خرطوشة ترشيح واستخراج يمكن التخلص منها على مرحلتين. ويشمل ذلك التوصيف التفصيلي للمخاليط البروتينية عن طريق تحليل LC-MS/MS من أسفل إلى أعلى. كما يظهر الأداء المتفوق لسير العمل القائم على SDS بالنسبة للبروتين غير الملوث.

Introduction

أصبح تحليل البروتيوم بواسطة مطياف الكتلة صارما بشكل متزايد ، نظرا للحساسية المحسنة والدقة وسرعة المسح الضوئي وتعدد استخدامات أجهزة MS الحديثة. تساهم تطورات التصلب المتعدد في زيادة كفاءة تحديد البروتين وزيادة دقة الكمية1،2،3،4،5. مع تحسين أجهزة MS ، يطلب الباحثون استراتيجية متسقة لإعداد العينات الأمامية قادرة على الاسترداد الكمي للبروتينات عالية النقاء في أقل وقت ممكن عبر جميع مراحل سير العمل 6,7,8,9,10,11 . لتعكس بدقة حالة البروتيوم للنظام البيولوجي ، يجب عزل البروتينات من مصفوفة العينة الأصلية بطريقة فعالة وغير متحيزة. تحقيقا لهذه الغاية ، بما في ذلك الفاعل بالسطح ، مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، يضمن استخراج البروتين الفعال والذوبان12. ومع ذلك ، فإن SDS تتداخل بشدة مع تأين الرش الكهربائي ، مما يتسبب في قمع إشارة MS الشديد إذا لم يتم القضاء عليها بشكل صحيح13.

تتوفر استراتيجيات استنفاد SDS مختلفة لتحليل البروتيوم اللاحق ، مثل الاحتفاظ بالبروتينات فوق مرشح قطع الوزن الجزيئي الموجود داخل خراطيش الدوران التي يمكن التخلص منها 14،15،16. يفضل استخدام طريقة تحضير العينات بمساعدة المرشح (FASP) لأنها تستنفد SDS بشكل فعال أقل من 10 جزء في المليون ، مما يسهل MS الأمثل. ومع ذلك ، فإن استعادة البروتين باستخدام FASP متغيرة ، مما دفع إلى استكشاف تقنيات أخرى. تطورت الأساليب الكروماتوغرافية التي تلتقط البروتين (أو الفاعل بالسطح) بشكل انتقائي إلى خراطيش مريحة مختلفة أو تنسيقات قائمة على الخرز17،18،19،20،21. بالنظر إلى هذه الاستراتيجيات البسيطة والمتسقة (من الناحية المثالية) لتنقية البروتين ، غالبا ما يتم تجاهل النهج الكلاسيكي لهطول الأمطار بالبروتين باستخدام المذيبات العضوية كنهج واعد لعزل البروتين. في حين تبين أن هطول الأمطار المذيبات يستنفد SDS إلى ما دون المستويات الحرجة بنجاح ، فإن استعادة البروتين كانت مصدر قلق طويل الأمد لهذا النهج. لاحظت مجموعات متعددة تحيزا في استعادة البروتين ، مع غلة هطول الأمطار المنخفضة بشكل غير مقبول كدالة لتركيز البروتين والوزن الجزيئي وكره الماء22,23. نظرا لتنوع بروتوكولات هطول الأمطار المبلغ عنها في الأدبيات ، تم تطوير ظروف هطول الأمطار الموحدة. في عام 2013 ، أبلغ Crowell et al. لأول مرة عن اعتماد القوة الأيونية على كفاءة هطول الأمطار للبروتينات في 80٪ من الأسيتون24. بالنسبة لجميع البروتينات التي تم فحصها ، تبين أن إضافة ما يصل إلى 30 ملليمتر كلوريد الصوديوم ضرورية لتحقيق أقصى قدر من الغلة (ما يصل إلى 100٪ من الانتعاش). في الآونة الأخيرة ، أظهر نيكرسون وآخرون أن الجمع بين قوة أيونية أعلى (تصل إلى 100 ملليمتر) مع درجة حرارة مرتفعة (20 درجة مئوية) أثناء هطول الأمطار الأسيتون أعطى استردادا كميا قريبا في 2-5 دقيقة25. لوحظ انخفاض طفيف في استعادة البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي (LMW). ولذلك، أظهر تقرير لاحق أعده باغالابادي وآخرون الاسترداد الناجح لبروتينات الكائنات الحية المحورة وببتيدات (≤5 كيلوداد) عن طريق الجمع بين أملاح محددة، ولا سيما كبريتات الزنك، مع مستوى أعلى من المذيبات العضوية (97٪ من الأسيتون)26.

في حين أن تحسين بروتوكول هطول الأمطار يضفي استراتيجية أكثر موثوقية لتنقية البروتين للبروتينات القائمة على MS ، فإن نجاح هطول الأمطار التقليدي يعتمد بشكل كبير على تقنية المستخدم. الهدف الأساسي من هذا العمل هو تقديم استراتيجية قوية لهطول الأمطار تسهل عزل حبيبات البروتين عن المادة الفائقة الملوثة. تم تطوير خرطوشة ترشيح يمكن التخلص منها للقضاء على السحب عن طريق عزل البروتين المجمع فوق مرشح غشاء PTFE المسامي27. تتم إزالة مكونات التداخل MS في supernatant بشكل فعال في خطوة طرد مركزي قصيرة ومنخفضة السرعة. توفر خرطوشة المرشح التي يمكن التخلص منها أيضا خرطوشة SPE قابلة للتبديل، مما يسهل تنظيف العينات لاحقا بعد إعادة الذوبان وهضم البروتين الاختياري، قبل قياس الطيف الكتلي.

يتم عرض سلسلة من سير عمل هطول الأمطار البروتيني الموصى به هنا ، بما في ذلك بروتوكولات الأسيتون والكلوروفورم / الميثانول / الماءالمعدلة 28 ، في شكل تقليدي (قائم على القارورة) وشبه آلي في خرطوشة ترشيح واستخراج ثنائية الحالة يمكن التخلص منها. يتم تسليط الضوء على عمليات استرداد البروتين الناتجة وكفاءة استنفاد SDS ، إلى جانب تغطية LC-MS / MS البروتينية من أسفل إلى أعلى ، لإظهار النتيجة المتوقعة من كل بروتوكول. وتناقش الفوائد والعيوب العملية المرتبطة بكل نهج.

Protocol

1. الاعتبارات المادية وإعداد العينات مسبقا

  1. استخدم فقط المذيبات عالية النقاء (الأسيتون والكلوروفورم والميثانول) (>99.5٪) والمواد الكيميائية الخالية من الرطوبة الزائدة.
  2. تحضير محاليل كلوريد الصوديوم وكبريتات الزنك (1 م) في الماء.
    ملاحظة: يمكن تخزين محاليل الملح إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة، طالما أنها خالية من الملوثات أو النمو الميكروبي.
  3. استخدم أصغر قارورة طرد مركزي دقيق من البولي بروبيلين (PP) كافية للاحتفاظ بالحجم المطلوب من العينات والمذيبات للحث على هطول الأمطار.
  4. تأكد من أن تركيز SDS في العينة المراد ترسيبها لا يزيد عن 2٪ (ث / v). إذا كان SDS أعلى ، فقم بتخفيف العينة بالماء.
  5. ضمان تركيز البروتين بين 0.01 و 10 جم / لتر لتحقيق الكفاءة المثلى لهطول الأمطار.
    ملاحظة: تتراوح الكتلة المثلى لهطول الأمطار بين 1-100 ميكروغرام من البروتين.
  6. تأكد من خلو جميع المذيبات والمحاليل من الجسيمات قبل الاستخدام. قم بإجراء إما الترشيح (<0.5 ميكرومتر) أو خطوة الطرد المركزي (10000 × g لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة) لإزالة الجسيمات غير الذائبة.
  7. إذا كانت هناك حاجة إلى تقليل رابطة ثاني كبريتيد والألكلة ، فقم بإجراء هذه الخطوات قبل هطول الأمطار من البروتين. ستتم إزالة كواشف الحد والألكلة الزائدة من خلال عملية هطول الأمطار.
  8. قم بترسيب البروتينات عن طريق اختيار وتنفيذ أحد البروتوكولات (الخطوات 2 أو 3 أو 4 أو 5).

2. هطول الأمطار السريع (القائم على القارورة) البروتين مع الأسيتون

  1. Pipet 90 ميكرولتر من البروتين (الخالي من الجسيمات) أو محلول البروتينات في أنبوب الطرد المركزي الدقيق PP. ثم أضف 10 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المائي 1 M.
    ملاحظة: إذا كانت القوة الأيونية لمستخلص البروتيوم تتجاوز بالفعل 100 مللي متر ، فلا يلزم ملح إضافي.
  2. Pipet 400 ميكرولتر من الأسيتون في العينة. قم بتغطية القارورة واضغط على القارورة بلطف لدمج المذيبات. الخلط القوي غير مطلوب.
    ملاحظة: يمكن زيادة حجم البروتين والملح والأسيتون طالما تم الحفاظ على النسبة النسبية لكل منها.
  3. اسمح للقارورة بالاحتضان في درجة حرارة الغرفة ، دون إزعاج ، لمدة لا تقل عن 2 دقيقة.
    ملاحظة: قد تؤدي الحضانات الأطول، بما في ذلك تلك التي تكون في درجة حرارة منخفضة (على سبيل المثال، يستخدم هطول الأمطار التقليدي من الأسيتون هطول الأمطار بين عشية وضحاها في الثلاجة)، إلى تكوين جسيمات بروتين مجمعة أكبر (مرئية) (الشكل 1A)، والتي لا تحسن عموما الاسترداد الكلي للبروتين.
  4. بعد الحضانة ، ضع عينات في جهاز طرد مركزي ، مع ملاحظة اتجاه القارورة. تدور لمدة لا تقل عن 2 دقيقة ، عند 10000 × g أو أعلى في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بفك غطاء القارورة وصب العارضة بلطف عن طريق عكس القارورة ببطء إلى حاوية نفايات. المس القارورة المقلوبة بمنشفة ورقية لسحب المذيبات المتبقية من القارورة.
    تنبيه: يجب الاحتفاظ بمذيبات النفايات والتخلص منها وفقا للبروتوكولات المناسبة.
  6. بالنسبة للعينات التي تحتوي على SDS ، قم بتوزيع 400 ميكرولتر من الأسيتون الطازج ، مع الحرص على عدم إزعاج الكريات.
    ملاحظة: الخطوة 2.6 اختيارية.
    1. قم على الفور بالطرد المركزي للعينة (10000 × g أو أعلى لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة) ، مع وضع القارورة في الدوار في نفس اتجاه الدوران الأولي. قم بتزيين مذيب الغسيل كما هو موضح في الخطوة 2.5.
  7. اترك العينة لتجف تماما مع فتح الغطاء (~ 1 دقيقة). تلخيص القارورة والمضي قدما في ذوبان الكريات (الخطوة 6).

3. هطول الأمطار من الببتيدات منخفضة الوزن الجزيئي (LMW) (ZnSO4 + الأسيتون)

  1. استغني عن 54 ميكرولتر من مستخلص البروتيوم إلى قارورة PP سعة 2 مل ، ثم أضف 6 ميكرولتر من 1 M ZnSO4.
    ملاحظة: يتم الحصول على الاسترداد الأمثل للببتيدات LMW (≤5 kDa) عن طريق إضافة الأسيتون إلى 97٪ النهائي من حيث الحجم. بافتراض قارورة PP 2 مل ، فإن الحد الأقصى لحجم العينة الأولية هو 54 ميكرولتر.
  2. أضف 1940 ميكرولتر من الأسيتون إلى 97٪ نهائية من حيث الحجم. قم بالتدوير بلطف للخلط ، واتركه يقف دون إزعاج على سطح الطاولة لمدة لا تقل عن 2 دقيقة.
  3. جهاز طرد مركزي (10000 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة) وإزالة السوبرنات عن طريق عكس القارورة ، ثم لمس القارورة إلى منشفة ورقية.
  4. بالنسبة للعينات التي تحتوي على SDS ، قم بتوزيع 400 ميكرولتر من الأسيتون الطازج ، مع الحرص على عدم إزعاج الكريات.
    ملاحظة: الخطوة 3.4 اختيارية.
    1. قم على الفور بالطرد المركزي للعينة وفقا للخطوة 3.3 ، مع وضع القارورة في الدوار في نفس اتجاه الدوران الأولي. قم بتزيين مذيب الغسيل كما هو موضح في الخطوة 3.3.
  5. أعد إذابة الكريات الجافة الناتجة في مذيب مائي مع دوامة قصيرة أو صوتنة (~ 5 دقائق).

4. هطول الأمطار البروتين عن طريق الكلوروفورم / الميثانول / الماء (CMW)

  1. استغني عن 100 ميكرولتر من محلول البروتين أو البروتيوم في قارورة PP. أضف 400 ميكرولتر من الميثانول ، متبوعا ب 100 ميكرولتر من الكلوروفورم. قم بتغطية القارورة والدوامة لفترة وجيزة للخلط.
    ملاحظة: بالنسبة لهطول الأمطار CMW ، يفضل قوارير 1.5 مل ذات القيعان الضيقة (الشكل 2A).
    تنبيه: يجب التعامل مع مذيب الكلوروفورم في غطاء تهوية مناسب. يجب التعامل مع جميع المذيبات التي تلامس الكلوروفورم كنفايات مهلجنة عند التخلص منها.
  2. قم بتوزيع 300 ميكرولتر من الماء بسرعة مباشرة في وسط القارورة. قم بتغطية القارورة. اسمح للعينة بالجلوس على سطح الطاولة دون إزعاج لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: سيظهر الحل على الفور باللون الأبيض الغائم. تجنب خلط القارورة بعد إضافة الماء.
  3. ضع قارورة PP في جهاز طرد مركزي وقم بالدوران لمدة لا تقل عن 5 دقائق (10000 × g أو أعلى في درجة حرارة الغرفة).
    ملاحظة: بمجرد الطرد المركزي ، ستتشكل طبقتان مرئيتان من المذيبات (الطبقة العليا = الميثانول / الماء ؛ القاع = الكلوروفورم). تتشكل حبيبات البروتين الصلبة في واجهة المذيبات (الشكل 2A).
  4. باستخدام طرف ماصة دقيقة كبير (1 مل) ، وعقد القارورة عند ~ 45 درجة ، قم بإزالة ~ 700 ميكرولتر من المذيب من الطبقة العليا بمعدل موحد.
  5. استخدم طرف ماصة صغيرة (200 ميكرولتر) لمواصلة إزالة طبقة المذيبات العلوية من القارورة المائلة ~ 45 درجة. Pipet في حركة واحدة مستمرة حتى تشكل طبقة المذيبات العليا خرزة في القارورة.
  6. أضف 400 ميكرولتر من الميثانول الطازج إلى قارورة العينة ، دون إزعاج الكريات ، عن طريق توزيع المذيب على جانب القارورة.
  7. قم بتغطية القارورة. امزج طبقات المذيبات عن طريق هز القارورة بلطف لتدوير المذيبات معا.
    ملاحظة: من الضروري تجنب تعطيل الكريات. لا دوامة القارورة.
  8. مع ملاحظة اتجاه القارورة في الدوار ، جهاز طرد مركزي لمدة لا تقل عن 10 دقائق (10000 × جم في درجة حرارة الغرفة). تلتصق بيليه البروتين بقاع القارورة (الشكل 2B).
  9. قم بقلب القارورة عند 45 درجة ، مع توجيه الكريات لأسفل. ضع طرف الماصة على طول الحافة العلوية للقارورة وقم بإزالة السوبرناتانت بطرف ماصة دقيقة 1 مل بمعدل بطيء ولكن مستمر. الاحتفاظ ~ 20 ميكرولتر من المذيبات في القارورة.
  10. اغسل حبيبات البروتين للعينات المحتوية على SDS عن طريق الاستغناء ببطء عن 400 ميكرولتر من الميثانول الطازج. لا دوامة القارورة.
    1. تابع مباشرة الطرد المركزي (10000 × g لمدة 2 دقيقة عند درجة الحرارة) ، ووضع القارورة في الدوار بنفس اتجاه الدوران الأولي.
  11. قم بإزالة المذيب ، وفقا للخطوة 4.9. اترك العينة لتجف في الهواء في الدخان حتى يتبخر المذيب المتبقي.
  12. راجع إجراءات إعادة الذوبان الموصى بها في الخطوة 6.

5. هطول الأمطار البروتين باستخدام خرطوشة الترشيح التي يمكن التخلص منها

ملاحظة: يمكن تنفيذ كل بروتوكول لهطول الأمطار يستند إلى المذيبات موصوف في الخطوات من 2 إلى 5 في خرطوشة ترشيح واستخراج من مرحلتين (انظر جدول المواد).

  1. مع توصيل القابس بخرطوشة الترشيح العلوية (الشكل 3A) ، قم بتوزيع الحجم المطلوب من البروتيوم المستخرج والملح والمذيب كما هو موضح في أحد الخيارات الثلاثة أدناه.
    1. (الخيار 1) لهطول البروتين مع الأسيتون ، اجمع بين 90 ميكرولتر من البروتين أو محلول البروتين ، و 10 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم المائي 1 متر ، و 400 ميكرولتر من الأسيتون. احتضان لمدة لا تقل عن 2 دقيقة على سطح الطاولة.
      ملاحظة: سيتطور راسب مرئي لعينات البروتين المركز (1 جم/لتر) (الشكل 3B).
    2. (الخيار 2) بالنسبة لهطول الأمطار من الببتيد LMW ، اجمع بين 15 ميكرولتر من العينة ، و 1.5 ميكرولتر من 1 M ZnSO4 ، و 485 ميكرولتر من الأسيتون. احتضان لمدة لا تقل عن 2 دقيقة على سطح الطاولة.
      ملاحظة: لن يؤثر تركيز الملح البالغ 90 مللي متر في العينة المائية على الاسترداد بالنسبة إلى 100 مللي متر الموصى بها في الخطوة 3.
    3. (الخيار 3) لهطول الأمطار CMW ، أضف 50 ميكرولتر من مستخلص البروتيوم ، و 200 ميكرولتر من الميثانول ، و 50 ميكرولتر من الكلوروفورم. قم بتغطية القارورة والدوامة لفترة وجيزة للمزج.
      1. قم بتوزيع 150 ميكرولتر من الماء بسرعة مباشرة في وسط القارورة. احتضان لمدة 1 دقيقة على سطح الطاولة.
  2. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 2500 × g في درجة حرارة الغرفة مع استمرار توصيل القابس بخرطوشة الترشيح.
  3. قم بعكس الخرطوشة، ثم قم بفك القابس وإزالته من قاعدة الخرطوشة.
  4. ضع خرطوشة الترشيح في قارورة نظيفة وأعد إلى جهاز الطرد المركزي. تدور لمدة 3 دقائق عند 500 × g في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المذيب المتدفق من القارورة السفلية.
    ملاحظة: إذا بقي أي مذيب في خرطوشة الترشيح العلوية، فارجع إلى جهاز الطرد المركزي وقم بإجراء دوران إضافي.
  5. اغسل حبيبات البروتين بإضافة 400 ميكرولتر من الأسيتون إلى خرطوشة الترشيح (لهطول الأمطار CMW ، الخطوة 5.1.3 ، أضف 400 ميكرولتر من الميثانول).
  6. جهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة أو حتى لا يبقى أي مذيب في الخرطوشة العلوية.
  7. إعادة إذابة بيليه هطول الأمطار كما هو موضح في الخطوة 6.

6. إعادة إذابة بيليه البروتين

  1. بلل الغشاء الموجود في قاعدة خرطوشة الترشيح عن طريق توزيع 2-5 ميكرولتر من الأيزوبروبانول مباشرة على الغشاء مباشرة قبل بروتوكولات إعادة الذوبان الموضحة أدناه.
  2. اتبع إحدى طرق إعادة الذوبان التالية.
    1. (الخيار 1) أضف ما لا يقل عن 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت المائي الذي يحتوي على SDS بنسبة ≥2٪ إلى خرطوشة الترشيح. غطاء ودوامة بقوة (~ 1 دقيقة). بدلا من ذلك ، سونيكات (>10 دقائق) لتفريق بيليه البروتين.
      1. سخني العينة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق). كرر خطوة الخلط بعد التسخين.
        ملاحظة: يمكن للمخزن المؤقت لتحميل هلام Laemmli إعادة إذابة بيليه البروتين. ومع ذلك ، فإن العينات التي تحتوي على SDS غير متوافقة مع هضم التربسين و LC و MS في الطور المعكوس.
    2. (الخيار 2) تحضير محلول من 80 ٪ (v / v) حمض الفورميك في الماء. قم بتبريد المحلول الحمضي (-20 درجة مئوية) ، وكذلك خرطوشة الترشيح التي تحتوي على البروتين المترسب.
      1. الاستغناء عن 50 ميكرولتر من حمض الفورميك البارد في خرطوشة ؛ غطاء ودوامة لمدة 30 ثانية. أعد إلى الفريزر (-20 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق.
      2. دوامة خرطوشة مرة أخرى لمدة 30 ثانية. ثم كرر دورة التبريد والخلط مرة أخرى (10 دقائق ، -20 درجة مئوية ، دوامة 30 ثانية).
      3. أضف الماء إلى 500 ميكرولتر نهائي ، مع تخفيف حمض الفورميك إلى 8٪.
        ملاحظة: بروتوكول حمض الفورميك البارد غير متوافق مع هضم التربسين اللاحق ولكنه متوافق مع LC-MS.
    3. (الخيار 3) أضف 50 ميكرولتر من اليوريا الطازجة 8 م في الماء إلى خرطوشة الترشيح. سونيكات لمدة 30 دقيقة.
      1. اسمح للخرطوشة بالاحتضان على سطح الطاولة لمدة 1 ساعة (حتى الليل).
      2. تمييع اليوريا 8M لا يقل عن 5 أضعاف بالماء أو العازلة المناسبة.
        ملاحظة: بمجرد تخفيفه ، يتوافق بروتوكول ذوبان اليوريا مع هضم التربسين اللاحق ، وكذلك LC-MS.

7. هضم البروتين

  1. لتحليل التصلب المتعدد من أسفل إلى أعلى، إخضاع البروتينات المعاد ذوبانها للهضم الأنزيمي باستخدام إحدى الطريقتين المذكورتين أدناه.
    1. (الخيار 1) لإعادة إذابة حمض الفورميك ، قلل الحجم الأولي من حمض الفورميك بنسبة 80٪ في الخطوة 6.2.2.1 إلى 25 ميكرولتر. في الخطوة 6.2.2.3 ، استخدم 375 ميكرولتر من الماء لتخفيف حمض الفورميك إلى 5٪ (v / v).
    2. قم بتوزيع البيبسين في الخرطوشة بنسبة بروتين إلى إنزيم تقريبية تبلغ 50: 1. باستخدام قابس متصل بخرطوشة الترشيح، احتضن العينة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
  2. (الخيار 2) لإعادة الذوبان في اليوريا ، تأكد من درجة الحموضة بين 8 و 8.3 مع تضمين 100 mM من Tris أو بيكربونات الأمونيوم في الخطوة 6.2.3.2.
    1. أضف التربسين بنسبة كتلة البروتين إلى الإنزيم التقريبية 50: 1. باستخدام قابس متصل بالخرطوشة ، احتضن العينة بين عشية وضحاها في حمام مائي دافئ عند 37 درجة مئوية.
    2. إنهاء عملية الهضم عن طريق تحمض المحلول بنسبة 10٪ TFA إلى 1٪ نهائية.
  3. استرجع البروتين المهضوم بالبيبسين أو التربسين عن طريق إزالة القابس من قاعدة الفلتر والطرد المركزي للخرطوشة الموجودة داخل قارورة نظيفة (2 دقيقة، 5000 × جم، درجة حرارة الغرفة).

8. تنظيف SPE

ملاحظة: بالنسبة لإزالة الملح الإضافي للعينات بعد الهضم أو تبادل المذيبات، يمكن أن تخضع العينة لتنظيف الطور المعكوس كما هو موضح.

  1. قم بتعبئة خرطوشة SPE (انظر جدول المواد) عن طريق تمرير 300 ميكرولتر من الميثانول (2 دقيقة ، 400 × جم) متبوعة ب 300 ميكرولتر من 5٪ acetonitrile / 0.1٪ من TFA (2 دقيقة ، 400 × جم).
  2. قم بتوصيل خرطوشة SPE المعدة بقاعدة خرطوشة الترشيح التي تحتوي على بروتين معاد ذوبانه أو مهضوم.
  3. قم بتدوير البروتين من خلال خرطوشة SPE (5 دقائق، 800 × جم في درجة حرارة الغرفة). إذا بقي المذيب في الخرطوشة العلوية، فأعد الخرطوشة إلى جهاز الطرد المركزي وكرر الدوران.
    ملاحظة: قد يؤدي تمرير العينة عبر خرطوشة SPE مرة ثانية إلى تحسين الاسترداد.
  4. أضف 300 ميكرولتر من 5٪ أسيتونيتريل / 0.1٪ من TFA في الماء إلى الخرطوشة. للغسل، اتدفق عبر خرطوشة SPE (2 دقيقة، 2000 × جم). تجاهل التدفق من خلال.
  5. بالنسبة لبروتينات LMW أو الببتيدات المهضومة ، قم بإخراج العينة عن طريق تدفق 300 ميكرولتر من 50٪ acetonitrile / 0.1٪ TFA (5 دقائق ، 2500 × جم).
  6. بالنسبة للبروتينات السليمة، اتبع الخطوة 8.5 مع خطوة إزالة إضافية باستخدام 300 ميكرولتر من 75٪ أسيتونيتريل / 0.1٪ TFA. الجمع بين اثنين من المستخلصات الناتجة.
    ملاحظة: الخطوة 8.6 اختيارية.

النتائج

ويلخص الشكل 4 استنفاد SDS المتوقع بعد هطول البروتينات على أساس القارورة أو الخرطوشة في خرطوشة مرشح يمكن التخلص منها باستخدام الأسيتون. تتم مقارنة الحضانة التقليدية بين عشية وضحاها (-20 درجة مئوية) في الأسيتون ببروتوكول هطول الأمطار السريع للأسيتون في درجة حرارة الغرفة (الخطو...

Discussion

يتم تحقيق التوصيف الأمثل للتصلب المتعدد عند استنفاد SDS المتبقي أقل من 10 أجزاء في المليون. في حين أن النهج البديلة ، مثل FASP والهضم على الخرز ، توفر استنفاد SDS الكمي مع الاسترداد المتغير31،32،33 ، فإن الهدف الأساسي من هطول الأمطار هو تحقيق أقصى قدر من...

Disclosures

صمم مختبر دوسيت ProTrap XG المستخدم في هذه الدراسة وحصل على براءة اختراعه. AAD هي أيضا شريك مؤسس لشركة Proteoform Scientific ، التي قامت بتسويق خرطوشة تحضير العينات.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا. يشكر المؤلفون شركة Bioinformatics Solutions Inc. (واترلو ، كندا) و SPARC BioCentre (التحليل الجزيئي) في مستشفى الأطفال المرضى (تورونتو ، كندا) لمساهماتهم في الحصول على بيانات MS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneFisher ScientificAC177170010≤0.002 % aldehyde
AcetonitrileFisher ScientificA998-4HPLC grade
Ammonium BicarbonateMillipore SigmaA6141-1KGsolid
Beta mercaptoethanolMillipore SigmaM3148-25MLMolecular biology grade
Bromophenol blueMillipore SigmaB8026-5GBromophenol blue sodium salt
ChloroformFisher ScientificC298-400Chloroform
Formic AcidHoneywell56302Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass SpectrometerThermoFisher Scientificfor analysis of standard protein mixture
GlycerolMillipore Sigma356352-1L-MFor molecular biology, > 99%
IsopropanolFisher ScientificA4641HPLC grade
MethanolFisher ScientificA452SK-4HPLC grade
MicrocentrifugeFisher Scientific75-400-102up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)Fisher Scientific05-408-130tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL)Fisher Scientific02-681-321rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL)Fisher Scientific21-197-28Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL)Fisher Scientific07-200-302Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL)Fisher Scientific07-200-303Universal pipet tip, non-sterile
MicropipettesFisher Scientific13-710-903Micropipet Trio pack
PepsinMillipore SigmaP0525000Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XGProteoform ScientificPXG-000250 complete units per box
Sodium ChlorideMillipore SigmaS9888-1KGACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl SulfateThermoFisher Scientific28312powdered solid
timsTOF Pro Mass SpectrometerBrukerfor analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic AcidThermoFisher ScientificL06374.AP99%
TrisFisher ScientificBP152-500Molecular biology grade
TrypsinMillipore Sigma9002-07-7From bovine pancreas, TPCK-treated
UreaBio-Rad1610731solid
Water (deionized)Sartorius Arium Mini Water Purification System76307-662Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc SulfateMillipore Sigma307491-100Gsolid

References

  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318 (2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856 (2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524 (2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051 (2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, 768 (1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983 (2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved