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本方案描述了在受控条件下的溶剂型蛋白质沉淀,以便在质谱分析之前稳定快速地回收和纯化蛋白质组样品。
虽然质谱(MS)仪器的多项进步改进了蛋白质组的定性和定量分析,但在MS之前分离,富集和处理蛋白质的更可靠的前端方法对于成功的蛋白质组表征至关重要。低且不一致的蛋白质回收率和残留杂质(如表面活性剂)对MS分析有害。与其他样品制备策略相比,蛋白质沉淀通常被认为是不可靠,耗时且技术上具有挑战性的。通过采用最佳的蛋白质沉淀方案可以克服这些问题。对于丙酮沉淀,特定盐的组合、温度控制、溶剂组成和沉淀时间至关重要,而氯仿/甲醇/水沉淀的效率取决于适当的移液和样品瓶操作。或者,这些沉淀方案在一次性旋转墨盒中简化和半自动化。本研究阐述了以传统形式使用一次性两级过滤和提取滤芯的溶剂型蛋白质沉淀的预期结果。这包括通过自下而上的LC-MS / MS分析对蛋白质组学混合物进行详细表征。基于SDS的工作流程相对于未受污染的蛋白质也表现出卓越的性能。
由于现代MS仪器的灵敏度,分辨率,扫描速度和多功能性的增强,质谱法的蛋白质组分析变得越来越严格。MS的进步有助于提高蛋白质鉴定效率和更精确的定量1,2,3,4,5。通过改进的MS仪器,研究人员需要一种相应一致的前端样品制备策略,能够在工作流程的所有阶段在最短的时间内定量回收高纯度蛋白质6,7,8,9,10,11.为了准确反映生物系统的蛋白质组状态,必须以高效和无偏倚的方式从天然样品基质中分离蛋白质。为此,包括变性表面活性剂,如十二烷基硫酸钠(SDS),确保蛋白质12的高效提取和增溶。然而,SDS强烈干扰电喷雾电离,如果不能适当地消除13....
1. 材料考虑和样品预制备
2. 用丙酮快速(基于小瓶)蛋白质沉淀
图4 总结了使用丙酮在一次性滤芯中基于小瓶或盒式促进的蛋白质沉淀后预期的SDS耗尽。将常规的丙酮过夜孵育(-20°C)与室温下的快速丙酮沉淀方案(步骤2)以及CMW沉淀(步骤4)进行比较。残余SDS通过亚甲基蓝活性物质(MBAS)测定29进行定量。简而言之,将100μL样品与100μLMBAS试剂(250mg亚甲基蓝,50g硫酸钠,10mL硫酸,在水中稀释至1.0L)混合,然后加入4.......
当残余SDS耗尽到10 ppm以下时,可实现最佳的MS表征。虽然FASP和磁珠消化等替代方法提供定量SDS耗尽,回收率为31,32,33,但沉淀的主要目标是同时最大化纯度和产量。这取决于在不干扰蛋白质沉淀的情况下有效分离上清液(含有SDS)。使用基于小瓶的沉淀,一旦通过移液去除了大部分上清液,一些聚集的沉淀物就越来越有可能.......
杜塞特实验室构思了本研究中使用的ProTrap XG并获得了专利。AAD也是蛋白型科学的创始合作伙伴,蛋白子科学将样品制备盒商业化。
这项工作由加拿大自然科学和工程研究委员会资助。作者感谢生物信息学解决方案公司(加拿大滑铁卢)和病童医院(加拿大多伦多)的SPARC BioCentre(分子分析)对获取MS数据的贡献。
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002 % aldehyde |
Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC grade |
Ammonium Bicarbonate | Millipore Sigma | A6141-1KG | solid |
Beta mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molecular biology grade |
Bromophenol blue | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol blue sodium salt |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
Formic Acid | Honeywell | 56302 | Eluent additive for LC-MS |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | ThermoFisher Scientific | for analysis of standard protein mixture | |
Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | For molecular biology, > 99% |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC grade |
Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC grade |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | up to 21,000 xg |
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | tapered bottom |
Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | rounded bottom |
Micropipette Tips (0.1-10 μL) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (1-200 μL) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipette Tips (200-1000 μL) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universal pipet tip, non-sterile |
Micropipettes | Fisher Scientific | 13-710-903 | Micropipet Trio pack |
Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilized powder, >3200 units/ mg |
ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 complete units per box |
Sodium Chloride | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS reagent, >99 % |
Sodium Dodecyl Sulfate | ThermoFisher Scientific | 28312 | powdered solid |
timsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | for analysis of liver proteome extract | |
Trifluoroacetic Acid | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | From bovine pancreas, TPCK-treated |
Urea | Bio-Rad | 1610731 | solid |
Water (deionized) | Sartorius Arium Mini Water Purification System | 76307-662 | Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm) |
Zinc Sulfate | Millipore Sigma | 307491-100G | solid |
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