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本文内容

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  • 摘要
  • 引言
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  • 材料
  • 参考文献
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摘要

本方案描述了在受控条件下的溶剂型蛋白质沉淀,以便在质谱分析之前稳定快速地回收和纯化蛋白质组样品。

摘要

虽然质谱(MS)仪器的多项进步改进了蛋白质组的定性和定量分析,但在MS之前分离,富集和处理蛋白质的更可靠的前端方法对于成功的蛋白质组表征至关重要。低且不一致的蛋白质回收率和残留杂质(如表面活性剂)对MS分析有害。与其他样品制备策略相比,蛋白质沉淀通常被认为是不可靠,耗时且技术上具有挑战性的。通过采用最佳的蛋白质沉淀方案可以克服这些问题。对于丙酮沉淀,特定盐的组合、温度控制、溶剂组成和沉淀时间至关重要,而氯仿/甲醇/水沉淀的效率取决于适当的移液和样品瓶操作。或者,这些沉淀方案在一次性旋转墨盒中简化和半自动化。本研究阐述了以传统形式使用一次性两级过滤和提取滤芯的溶剂型蛋白质沉淀的预期结果。这包括通过自下而上的LC-MS / MS分析对蛋白质组学混合物进行详细表征。基于SDS的工作流程相对于未受污染的蛋白质也表现出卓越的性能。

引言

由于现代MS仪器的灵敏度,分辨率,扫描速度和多功能性的增强,质谱法的蛋白质组分析变得越来越严格。MS的进步有助于提高蛋白质鉴定效率和更精确的定量12345通过改进的MS仪器,研究人员需要一种相应一致的前端样品制备策略,能够在工作流程的所有阶段在最短的时间内定量回收高纯度蛋白质67891011.为了准确反映生物系统的蛋白质组状态,必须以高效和无偏倚的方式从天然样品基质中分离蛋白质。为此,包括变性表面活性剂,如十二烷基硫酸钠(SDS),确保蛋白质12的高效提取和增溶。然而,SDS强烈干扰电喷雾电离,如果不能适当地消除13,则引起严重的MS信号抑制。

各种SDS耗尽策略可用于随后的蛋白质组分析,例如保留高于一次性旋转柱14,15,16中包含的分子量截止过滤器的蛋白质。过滤辅助样品制备方法(FASP)受到青睐,因为它有效地将SDS消耗在10 ppm以下,从而促进最佳MS。然而,FASP的蛋白质回收率是可变的,这促使了对其他技术的探索。选择性捕获蛋白质(或表面活性剂)的色谱方法已经演变成各种方便的墨盒或基于磁珠的格式1718192021。鉴于这些简单且(理想情况下)一致的蛋白质纯化策略,使用有机溶剂进行蛋白质沉淀的经典方法经常被忽视为一种有前途的蛋白质分离方法。虽然溶剂沉淀被证明可以成功地将SDS消耗到临界水平以下,但蛋白质回收一直是这种方法的长期关注点。多个研究小组观察到蛋白质回收偏倚,沉淀率与蛋白质浓度、分子量和疏水性2223的函数关系低得令人无法接受。由于文献中报道的降水方案的多样性,开发了标准化的降水条件。2013年,Crowell等人首次报道了离子强度对80%丙酮24中蛋白质沉淀效率的依赖性。对于检查的所有蛋白质,添加高达30 mM的氯化钠对于最大化产量(高达100%回收率)至关重要。最近,Nickerson等人表明,在丙酮沉淀期间,更高的离子强度(高达100mM)与高温(20°C)的组合在2-5 min25内给出了近乎定量的回收。观察到低分子量(LMW)蛋白的回收率略有下降。因此,Baghalabadi等人的后续报告证明,通过将特定盐,特别是硫酸锌与更高水平的有机溶剂(97%丙酮)26结合,可以成功回收LMW蛋白和肽(≤5 kDa)26

虽然改进沉淀方案为基于MS的蛋白质组学提供了更可靠的蛋白质纯化策略,但常规沉淀的成功在很大程度上取决于用户技术。这项工作的主要目标是提出一种强大的沉淀策略,有助于从污染的上清液中分离蛋白质沉淀。开发了一种一次性过滤滤芯,通过在多孔PTFE膜过滤器27上方分离聚集的蛋白质来消除移液。上清液中的MS干扰组分在短时间的低速离心步骤中被有效去除。一次性滤芯还提供可互换的 SPE 滤芯,便于在质谱分析之前进行再溶解和可选蛋白质消解后的后续样品清理。

这里介绍了一系列推荐的蛋白质组沉淀工作流程,包括常规(基于小瓶)和半自动格式的常规(基于小瓶)的改性丙酮和氯仿/甲醇/水28 方案,以及一次性双态过滤和提取滤芯中的半自动形式。突出显示了所得的蛋白质回收率和SDS消耗效率,以及自下而上的LC-MS / MS蛋白质组覆盖率,以证明每个方案的预期结果。讨论了与每种方法相关的实际优点和缺点。

研究方案

1. 材料考虑和样品预制备

  1. 仅使用高纯度溶剂(丙酮,氯仿,甲醇)(>99.5%)和化学品,不含过量水分。
  2. 在水中制备氯化钠和硫酸锌溶液(1M)。
    注意:盐溶液可以在室温下无限期储存,只要它们没有污染物或微生物生长。
  3. 使用最小的聚丙烯(PP)微量离心机小瓶,足以保留所需体积的样品和溶剂以诱导沉淀。
  4. 确保待沉淀样品中的SDS浓度不大于2%(w / v)。如果SDS较高,请用水稀释样品。
  5. 确保蛋白质浓度在 0.01 至 10 g/L 之间,以实现最佳沉淀效率。
    注意:沉淀的最佳质量范围在1-100μg蛋白质之间。
  6. 使用前确保所有溶剂和溶液不含颗粒物。进行过滤(<0.5μm)或离心步骤(10,000 x g 在室温下1分钟)以除去未溶解的颗粒。
  7. 如果需要二硫键还原和烷基化,请在蛋白质沉淀之前执行这些步骤。过量的还原和烷化试剂将通过沉淀过程除去。
  8. 通过选择和执行其中一种方案(步骤2,3,4或5)沉淀蛋白质。

2. 用丙酮快速(基于小瓶)蛋白质沉淀

  1. 将90μL(无颗粒)蛋白质或蛋白质组溶液移液到PP微量离心管中。然后,加入10μL1M氯化钠水溶液。
    注意:如果蛋白质组提取物的离子强度已经超过100 mM,则不需要额外的盐。
  2. 将400μL丙酮移液到样品中。盖上小瓶盖上盖子,轻轻敲击小瓶以混合溶剂。不需要剧烈混合。
    注意:只要保持蛋白质,盐和丙酮的相对比例,就可以增加蛋白质,盐和丙酮的体积。
  3. 让小瓶在室温下孵育,不受干扰,至少2分钟。
    注意:较长的孵育,包括在降低温度下的孵育(例如,传统的丙酮沉淀在冰箱中采用过夜沉淀),可能导致形成更大(可见)的聚集蛋白质颗粒(图1A),这通常不会提高总蛋白质回收率。
  4. 孵育后,将样品放入离心机中,注意小瓶的方向。在室温下以10,000 x g 或更高的速率旋转至少2分钟。
  5. 解开小瓶的盖子,轻轻地倒入上清液,将小瓶倒置到废物容器中。将倒置的小瓶碰到纸巾上,以从小瓶中吸取残留溶剂。
    注意:应根据适当的方案保留和丢弃废溶剂。
  6. 对于含SDS的样品,分配400μL新鲜丙酮,注意不要干扰沉淀。
    注意:步骤 2.6 是可选的。
    1. 立即离心样品(10,000× g 或更高,室温下1分钟),将小瓶以与初始旋转相同的方向放入转子中。倾析洗涤溶剂,如步骤2.5中所述。
  7. 让样品在盖子打开的情况下完全干燥(约1分钟)。重新盖上小瓶并继续沉淀溶解(步骤6)。

3. 低分子量 (LMW) 肽 (ZnSO4 + 丙酮) 的沉淀

  1. 将54μL蛋白质组提取物分配到2 mL PP小瓶中,然后加入6μL1 M ZnSO4
    注意:LMW肽(≤5 kDa)的最佳回收率是通过在最终的97%体积中加入丙酮获得的。假设有一个 2 mL PP 小瓶,最大初始样品体积为 54 μL。
  2. 将1940μL丙酮加入最终的97%体积中。轻轻旋转以混合,并在台面上不受干扰地站立至少2分钟。
  3. 离心(室温下10,000× g1 分钟)并通过倒置小瓶除去上清液,然后将小瓶接触纸巾。
  4. 对于含SDS的样品,分配400μL新鲜丙酮,注意不要干扰沉淀。
    注意:步骤 3.4 是可选的。
    1. 按照步骤3.3立即离心样品,将小瓶以与初始旋转相同的方向放入转子中。倾析洗涤溶剂,如步骤3.3中所述。
  5. 将所得的干沉淀重新溶解在水溶剂中,并进行短暂的涡旋或超声处理(约5分钟)。

4. 氯仿/甲醇/水(CMW)的蛋白质沉淀

  1. 将100μL蛋白质或蛋白质组溶液分配到PP小瓶中。加入400μL甲醇,然后加入100μL氯仿。盖上小瓶并短暂涡旋以混合。
    注意:对于CMW沉淀,最好使用底部较窄的1.5 mL小瓶(图2A)。
    注意:氯仿溶剂应在适当的通风罩中处理。所有与氯仿接触的溶剂在处理时均应作为卤化废物处理。
  2. 快速将300μL水直接分配到小瓶的中心。盖上小瓶。让样品在台面上不受干扰地放置1分钟。
    注:解决方案将立即显示为浑浊的白色。避免在加水后混合小瓶。
  3. 将PP小瓶放入离心机中并旋转至少5分钟(室温下为10,000× g 或更高)。
    注意:离心后,将形成两个可见的溶剂层(顶层=甲醇/水,底部=氯仿)。在溶剂界面处形成固体蛋白质沉淀(图2A)。
  4. 使用大(1 mL)微量移液器吸头,并将小瓶保持在~45°,以均匀的速率从上层除去~700μL溶剂。
  5. 使用较小的(200μL)微量移液器吸头继续从〜45°倾斜的小瓶中除去上层溶剂层。以一个连续的运动移液,直到上层溶剂层在小瓶中形成珠子。
  6. 通过将溶剂从小瓶的侧面分配,向样品瓶中加入400μL新鲜甲醇,而不会干扰沉淀。
  7. 盖上小瓶。通过轻轻摇动小瓶将溶剂旋转在一起来混合溶剂层。
    注意:必须避免破坏颗粒。不要涡旋小瓶。
  8. 注意转子中小瓶的方向,离心至少10分钟(室温下10,000× g )。蛋白质沉淀粘附在小瓶的底部(图2B)。
  9. 将小瓶倾斜45°,颗粒朝下。将移液器吸头沿小瓶的上边缘放置,然后用1 mL微量移液管吸头以缓慢但连续的速率除去上清液。在小瓶中保留约20μL溶剂。
  10. 通过缓慢分配400μL新鲜甲醇来洗涤含SDS样品的蛋白质沉淀。不要涡旋小瓶。
    1. 直接离心(在温度下10,000× g 持续2分钟),将小瓶以与初始旋转相同的方向放入转子中。
  11. 按照步骤4.9除去溶剂。让样品在通风橱中风干,直到残留溶剂蒸发。
  12. 请参阅步骤6中推荐的再溶解程序。

5. 使用一次性过滤滤芯进行蛋白质沉淀

注意:步骤2-5中描述的每个溶剂基沉淀方案都可以在两级过滤和提取滤芯中进行(参见 材料表)。

  1. 将插头连接到上部过滤盒(图3A),分配所需体积的提取蛋白质组,盐和溶剂,如以下三个选项之一所述。
    1. (备选案文1)对于用丙酮沉淀蛋白质,将90μL蛋白质或蛋白质组溶液,10μL1M NaCl水和400μL丙酮混合。在台面上孵育至少2分钟。
      注意:对于浓缩蛋白质样品(1 g / L),将形成可见的沉淀物(图3B)。
    2. (备选案文2)对于 LMW 肽沉淀,将 15 μL 样品、1.5 μL 1 M ZnSO4 和 485 μL 丙酮混合。在台面上孵育至少2分钟。
      注意:与步骤3中推荐的100 mM相比,水样中90 mM的盐浓度不会影响回收率。
    3. (备选案文3)对于CMW沉淀,加入50μL蛋白质组提取物,200μL甲醇和50μL氯仿。盖上小瓶并短暂涡旋合并。
      1. 快速将150μL水直接分配到小瓶的中心。在台面上孵育1分钟。
  2. 在室温下以2,500× g 离心2分钟,插头仍附着在过滤盒上。
  3. 反转墨盒,然后从墨盒底座上拧下并卸下插头。
  4. 将过滤滤芯放入干净的小瓶中,然后返回离心机。在室温下以500 x g 旋转3分钟。丢弃下小瓶中的流通溶剂。
    注:如果上部过滤滤芯中残留任何溶剂,请返回离心机并进行额外的旋转。
  5. 通过向过滤盒中加入400μL丙酮来洗涤蛋白质沉淀(对于CMW沉淀,步骤5.1.3,加入400μL甲醇)。
  6. 在室温下以500× g 离心3分钟,或直到上部滤芯中没有残留溶剂。
  7. 重新溶解沉淀沉淀如步骤6所述。

6. 蛋白质沉淀的再溶解

  1. 通过在下面描述的再溶解方案之前立即将2-5μL异丙醇直接分配到膜上来润湿过滤盒底部的膜。
  2. 遵循以下重解方法之一。
    1. (备选案文1)向过滤柱中加入至少20μL含有≥2%SDS的水性缓冲液。盖子并剧烈涡旋(约1分钟)。或者,超声处理(>10分钟)以分散蛋白质沉淀。
      1. 将样品在95°C下加热5分钟)。加热后重复混合步骤。
        注意:Laemmli凝胶上样缓冲液可以重新溶解蛋白质沉淀。然而,含SDS的样品与胰蛋白酶消化和反相LC和MS不相容。
    2. (备选案文2)在水中制备80%(v / v)甲酸的溶液。预冻酸溶液(-20°C),以及含有沉淀蛋白的过滤盒。
      1. 将50μL冷甲酸分配到墨盒中;盖子和涡旋30秒。返回冰箱(-20°C)10分钟。
      2. 再次涡旋墨盒 30 秒。然后,再次重复冷却和混合循环(10分钟,-20°C,30秒涡流)。
      3. 将水加入最终的500μL中,将甲酸稀释至8%。
        注意:冷甲酸方案与随后的胰蛋白酶消化不兼容,但与LC-MS兼容。
    3. (备选案文3)将50μL新鲜制备的8 M尿素加入水中至过滤盒中。超声处理30分钟。
      1. 让墨盒在台面上孵育1小时(最多过夜)。
      2. 用水或适当的缓冲液将8M尿素稀释至少5倍。
        注意:一旦稀释,尿素增溶方案与随后的胰蛋白酶消化以及LC-MS兼容。

7. 蛋白质消化

  1. 对于自下而上的MS分析,请使用下面提到的两种方法之一对重新溶解的蛋白质进行酶消化。
    1. (备选案文1)对于甲酸再溶解,在步骤6.2.2.1中将80%甲酸的初始体积减少到25μL。在步骤6.2.2.3中,使用375μL水将甲酸稀释至5%(v / v)。
    2. 将胃蛋白酶以大约50:1的蛋白质/酶比例分配到墨盒中。将插头连接到过滤盒上,将样品在室温下孵育过夜。
  2. (备选案文2)为了在尿素中重新溶解,在步骤6.2.3.2中加入100 mM的Tris或碳酸氢铵,确保pH值在8和8.3之间。
    1. 以近似50:1的蛋白质/酶质量比加入胰蛋白酶。将插头连接到墨盒上,将样品在37°C的温水浴中孵育过夜。
    2. 通过将溶液用10%TFA酸化至最终的1%来终止消化。
  3. 通过从过滤器的底部取下塞子并离心干净小瓶(2分钟,5000× g,室温)中含有的墨盒来回收胃蛋白酶或胰蛋白酶消化的蛋白质。

8. 扫描优化

注意:对于消解或溶剂交换后的其他样品脱盐,样品可以按所述进行反相清理。

  1. 通过通入300μL甲醇(2分钟,400×g),然后通过300μL5%乙腈/ 0.1%TFA(2分钟,400 x g)来启动SPE柱(参见材料表)。
  2. 将底漆的SPE滤芯连接到含有再溶解或消化的蛋白质的过滤滤芯的底部。
  3. 将蛋白质旋转通过SPE盒(5分钟,室温下800× g )。如果溶剂残留在上部滤芯中,请将滤芯放回离心机并重复旋转。
    注:再次将样品通过SPE墨盒可能会提高恢复率。
  4. 向滤筒中加入300μL5%乙腈/ 0.1%TFA。要清洗,请流过 SPE 滤芯(2 分钟,2000 x g)。丢弃流出物。
  5. 对于LMW蛋白或消化的肽,通过流动300μL50%乙腈/ 0.1%TFA(5分钟,2500× g)洗脱样品。
  6. 对于完整的蛋白质,按照步骤8.5,使用300μL 75%乙腈/ 0.1%TFA进行额外的洗脱步骤。合并两个结果提取物。
    注意:步骤 8.6 是可选的。

结果

图4 总结了使用丙酮在一次性滤芯中基于小瓶或盒式促进的蛋白质沉淀后预期的SDS耗尽。将常规的丙酮过夜孵育(-20°C)与室温下的快速丙酮沉淀方案(步骤2)以及CMW沉淀(步骤4)进行比较。残余SDS通过亚甲基蓝活性物质(MBAS)测定29进行定量。简而言之,将100μL样品与100μLMBAS试剂(250mg亚甲基蓝,50g硫酸钠,10mL硫酸,在水中稀释至1.0L)混合,然后加入4...

讨论

当残余SDS耗尽到10 ppm以下时,可实现最佳的MS表征。虽然FASP和磁珠消化等替代方法提供定量SDS耗尽,回收率为313233,但沉淀的主要目标是同时最大化纯度和产量。这取决于在不干扰蛋白质沉淀的情况下有效分离上清液(含有SDS)。使用基于小瓶的沉淀,一旦通过移液去除了大部分上清液,一些聚集的沉淀物就越来越有可能...

披露声明

杜塞特实验室构思了本研究中使用的ProTrap XG并获得了专利。AAD也是蛋白型科学的创始合作伙伴,蛋白子科学将样品制备盒商业化。

致谢

这项工作由加拿大自然科学和工程研究委员会资助。作者感谢生物信息学解决方案公司(加拿大滑铁卢)和病童医院(加拿大多伦多)的SPARC BioCentre(分子分析)对获取MS数据的贡献。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneFisher ScientificAC177170010≤0.002 % aldehyde
AcetonitrileFisher ScientificA998-4HPLC grade
Ammonium BicarbonateMillipore SigmaA6141-1KGsolid
Beta mercaptoethanolMillipore SigmaM3148-25MLMolecular biology grade
Bromophenol blueMillipore SigmaB8026-5GBromophenol blue sodium salt
ChloroformFisher ScientificC298-400Chloroform
Formic AcidHoneywell56302Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass SpectrometerThermoFisher Scientificfor analysis of standard protein mixture
GlycerolMillipore Sigma356352-1L-MFor molecular biology, > 99%
IsopropanolFisher ScientificA4641HPLC grade
MethanolFisher ScientificA452SK-4HPLC grade
MicrocentrifugeFisher Scientific75-400-102up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)Fisher Scientific05-408-130tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL)Fisher Scientific02-681-321rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL)Fisher Scientific21-197-28Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL)Fisher Scientific07-200-302Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL)Fisher Scientific07-200-303Universal pipet tip, non-sterile
MicropipettesFisher Scientific13-710-903Micropipet Trio pack
PepsinMillipore SigmaP0525000Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XGProteoform ScientificPXG-000250 complete units per box
Sodium ChlorideMillipore SigmaS9888-1KGACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl SulfateThermoFisher Scientific28312powdered solid
timsTOF Pro Mass SpectrometerBrukerfor analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic AcidThermoFisher ScientificL06374.AP99%
TrisFisher ScientificBP152-500Molecular biology grade
TrypsinMillipore Sigma9002-07-7From bovine pancreas, TPCK-treated
UreaBio-Rad1610731solid
Water (deionized)Sartorius Arium Mini Water Purification System76307-662Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc SulfateMillipore Sigma307491-100Gsolid

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