有机溶剂基蛋白质沉淀，在质谱分析之前实现强大的蛋白质组纯化

摘要

本方案描述了在受控条件下的溶剂型蛋白质沉淀，以便在质谱分析之前稳定快速地回收和纯化蛋白质组样品。

摘要

虽然质谱（MS）仪器的多项进步改进了蛋白质组的定性和定量分析，但在MS之前分离，富集和处理蛋白质的更可靠的前端方法对于成功的蛋白质组表征至关重要。低且不一致的蛋白质回收率和残留杂质（如表面活性剂）对MS分析有害。与其他样品制备策略相比，蛋白质沉淀通常被认为是不可靠，耗时且技术上具有挑战性的。通过采用最佳的蛋白质沉淀方案可以克服这些问题。对于丙酮沉淀，特定盐的组合、温度控制、溶剂组成和沉淀时间至关重要，而氯仿/甲醇/水沉淀的效率取决于适当的移液和样品瓶操作。或者，这些沉淀方案在一次性旋转墨盒中简化和半自动化。本研究阐述了以传统形式使用一次性两级过滤和提取滤芯的溶剂型蛋白质沉淀的预期结果。这包括通过自下而上的LC-MS / MS分析对蛋白质组学混合物进行详细表征。基于SDS的工作流程相对于未受污染的蛋白质也表现出卓越的性能。

引言

由于现代MS仪器的灵敏度，分辨率，扫描速度和多功能性的增强，质谱法的蛋白质组分析变得越来越严格。MS的进步有助于提高蛋白质鉴定效率和更精确的定量^1，2，^3，4，5。通过改进的MS仪器，研究人员需要一种相应一致的前端样品制备策略，能够在工作流程的所有阶段在最短的时间内定量回收高纯度蛋白质^{6，7，8，9，10，11}.为了准确反映生物系统的蛋白质组状态，必须以高效和无偏倚的方式从天然样品基质中分离蛋白质。为此，包括变性表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），确保蛋白质¹²的高效提取和增溶。然而，SDS强烈干扰电喷雾电离，如果不能适当地消除^13....

研究方案

1. 材料考虑和样品预制备

1. 仅使用高纯度溶剂（丙酮，氯仿，甲醇）（>99.5%）和化学品，不含过量水分。
2. 在水中制备氯化钠和硫酸锌溶液（1M）。
   注意：盐溶液可以在室温下无限期储存，只要它们没有污染物或微生物生长。
3. 使用最小的聚丙烯（PP）微量离心机小瓶，足以保留所需体积的样品和溶剂以诱导沉淀。
4. 确保待沉淀样品中的SDS浓度不大于2%（w / v）。如果SDS较高，请用水稀释样品。
5. 确保蛋白质浓度在 0.01 至 10 g/L 之间，以实现最佳沉淀效率。
   注意：沉淀的最佳质量范围在1-100μg蛋白质之间。
6. 使用前确保所有溶剂和溶液不含颗粒物。进行过滤（<0.5μm）或离心步骤（10，000 x g 在室温下1分钟）以除去未溶解的颗粒。
7. 如果需要二硫键还原和烷基化，请在蛋白质沉淀之前执行这些步骤。过量的还原和烷化试剂将通过沉淀过程除去。
8. 通过选择和执行其中一种方案（步骤2，3，4或5）沉淀蛋白质。

2. 用丙酮快速（基于小瓶）蛋白质沉淀

1. 将90μL（无颗粒）蛋白质或蛋白质组溶液移液到PP微量离心管中。然后，加入10μL1M氯化钠水溶液。
   注意：如果蛋白质组提取物的离子强度已经超过100....

结果

图4 总结了使用丙酮在一次性滤芯中基于小瓶或盒式促进的蛋白质沉淀后预期的SDS耗尽。将常规的丙酮过夜孵育（-20°C）与室温下的快速丙酮沉淀方案（步骤2）以及CMW沉淀（步骤4）进行比较。残余SDS通过亚甲基蓝活性物质（MBAS）测定²⁹进行定量。简而言之，将100μL样品与100μLMBAS试剂（250mg亚甲基蓝，50g硫酸钠，10mL硫酸，在水中稀释至1.0L）混合，然后加入4.......

讨论

当残余SDS耗尽到10 ppm以下时，可实现最佳的MS表征。虽然FASP和磁珠消化等替代方法提供定量SDS耗尽，回收率为^{31，32，33，但}沉淀的主要目标是同时最大化纯度和产量。这取决于在不干扰蛋白质沉淀的情况下有效分离上清液（含有SDS）。使用基于小瓶的沉淀，一旦通过移液去除了大部分上清液，一些聚集的沉淀物就越来越有可能.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Fisher Scientific	AC177170010	≤0.002 % aldehyde
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4	HPLC grade
Ammonium Bicarbonate	Millipore Sigma	A6141-1KG	solid
Beta mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148-25ML	Molecular biology grade
Bromophenol blue	Millipore Sigma	B8026-5G	Bromophenol blue sodium salt
Chloroform	Fisher Scientific	C298-400	Chloroform
Formic Acid	Honeywell	56302	Eluent additive for LC-MS
Fusion Lumos Mass Spectrometer	ThermoFisher Scientific		for analysis of standard protein mixture
Glycerol	Millipore Sigma	356352-1L-M	For molecular biology, > 99%
Isopropanol	Fisher Scientific	A4641	HPLC grade
Methanol	Fisher Scientific	A452SK-4	HPLC grade
Microcentrifuge	Fisher Scientific	75-400-102	up to 21,000 xg
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-130	tapered bottom
Microcentrifuge Tube         (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-321	rounded bottom
Micropipette Tips         (0.1-10 μL)	Fisher Scientific	21-197-28	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips         (1-200 μL)	Fisher Scientific	07-200-302	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipette Tips        (200-1000 μL)	Fisher Scientific	07-200-303	Universal pipet tip, non-sterile
Micropipettes	Fisher Scientific	13-710-903	Micropipet Trio pack
Pepsin	Millipore Sigma	P0525000	Lyophilized powder,           >3200 units/ mg
ProTrap XG	Proteoform Scientific	PXG-0002	50 complete units per box
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888-1KG	ACS reagent, >99 %
Sodium Dodecyl Sulfate	ThermoFisher Scientific	28312	powdered solid
timsTOF Pro Mass Spectrometer	Bruker		for analysis of liver proteome extract
Trifluoroacetic Acid	ThermoFisher Scientific	L06374.AP	99%
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Trypsin	Millipore Sigma	9002-07-7	From bovine pancreas, TPCK-treated
Urea	Bio-Rad	1610731	solid
Water (deionized)	Sartorius Arium Mini Water Purification System	76307-662	Type 1 ultrapure (18.2 MΩ cm)
Zinc Sulfate	Millipore Sigma	307491-100G	solid