JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يمكن أن يكون المعدل المتزايد للتحليلات الدوائية والسمية للمعادن والمركبات القائمة على المعادن في أسماك الزرد مفيدا لدراسات الترجمة البيئية والسريرية. تم التغلب على الحد من امتصاص التعرض غير المعروف للمياه عن طريق إجراء تحليل المعادن النزرة على أنسجة الزرد المهضومة باستخدام مطياف كتلة البلازما المقترن بالحث .

Abstract

وتشمل المعادن والمركبات القائمة على المعادن العديد من الكائنات الغريبة النشطة دوائيا والسمية. من سمية المعادن الثقيلة إلى المواد الكيميائية ، فإن الحركية السامة لهذه المركبات لها أهمية تاريخية وحديثة. أصبحت أسماك الزرد كائنا نموذجيا جذابا في توضيح علم الحركة الدوائية والسمية في التعرض البيئي ودراسات الترجمة السريرية. على الرغم من أن دراسات أسماك الزرد لها فائدة كونها أعلى إنتاجية من نماذج القوارض ، إلا أن هناك العديد من القيود المهمة على النموذج.

أحد هذه القيود متأصل في نظام الجرعات المنقولة بالمياه. لا يمكن استقراء تركيزات المياه من هذه الدراسات لتوفير جرعات داخلية موثوقة. تسمح القياسات المباشرة للمركبات القائمة على المعادن بعلاقة أفضل مع الاستجابات الجزيئية والبيولوجية المرتبطة بالمركبات. للتغلب على هذا القيد بالنسبة للمعادن والمركبات القائمة على المعادن ، تم تطوير تقنية لهضم أنسجة يرقات الزرد بعد التعرض وتحديد تركيزات المعادن داخل عينات الأنسجة عن طريق قياس الطيف الكتلي للبلازما المقترنة بالحث (ICPMS).

تم استخدام طرق ICPMS لتحديد تركيزات المعادن من البلاتين (Pt) من سيسبلاتين والروثينيوم (Ru) من العديد من الكيماويات الكيميائية الجديدة القائمة على Ru في أنسجة الزرد. بالإضافة إلى ذلك ، ميز هذا البروتوكول تركيزات Pt التي تم عزلها في كوريون اليرقات مقارنة بأنسجة الزرد. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة لتحديد الجرعة المعدنية الموجودة في أنسجة اليرقات. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل هذه الطريقة لتحديد معادن معينة أو مركبات قائمة على المعادن في مجموعة واسعة من دراسات التعرض والجرعات.

Introduction

ولا تزال المعادن والمركبات القائمة على الفلزات ذات أهمية دوائية وسمية. أدى انتشار التعرض للمعادن الثقيلة وتأثيرها على الصحة إلى زيادة البحث العلمي بشكل كبير منذ 1960s ووصل إلى أعلى مستوى له على الإطلاق في عام 2021. تتجاوز تركيزات المعادن الثقيلة في مياه الشرب وتلوث الهواء والتعرض المهني الحدود التنظيمية في جميع أنحاء العالم ولا تزال تمثل مشكلة بالنسبة للزرنيخ والكادميوم والزئبق والكروم والرصاص والمعادن الأخرى. لا تزال الطرق الجديدة لقياس التعرض البيئي وتحليل التطور المرضي في ارتفاع الطلب1،2،3.

على العكس من ذلك ، قام المجال الطبي بتسخير الخصائص الفيزيائية الكيميائية للمعادن المختلفة للعلاج السريري. الأدوية القائمة على المعادن أو الأدوية المعدنية لها تاريخ غني من الأغراض الطبية وأظهرت نشاطا ضد مجموعة من الأمراض ، مع أعلى نجاح مثل العلاج الكيميائي4. أشهر الأدوية المعدنية ، سيسبلاتين ، هو دواء مضاد للسرطان قائم على PT تعتبره منظمة الصحة العالمية (WHO) أحد الأدوية الأساسية في العالم5. في عام 2010 ، كان سيسبلاتين ومشتقاته Pt معدل نجاح يصل إلى 90 ٪ في العديد من أنواع السرطان وتم استخدامها في حوالي 50 ٪ من أنظمة العلاج الكيميائي6،7،8. على الرغم من أن العلاج الكيميائي القائم على PT قد حقق نجاحا لا يمكن دحضه ، إلا أن السمية التي تحد من الجرعة قد أطلقت تحقيقات في الأدوية البديلة القائمة على المعادن مع التسليم البيولوجي المكرر والنشاط. من بين هذه البدائل ، أصبحت المركبات القائمة على Ru هي الأكثر شعبية9،10،11،12.

هناك حاجة إلى نماذج ومنهجية جديدة لمواكبة معدل الحاجة إلى الدراسات الدوائية والحركية السامة المعدنية. يقع نموذج الزرد عند تقاطع التعقيد والإنتاجية ، كونه فقاريات عالية الخصوبة مع 70٪ من التماثل الجيني المحفوظ13. كان هذا النموذج أحد الأصول في علم الأدوية وعلم السموم ، مع فحوصات مكثفة لمختلف المركبات لاكتشاف الرصاص ، وتحديد الهدف ، والنشاط الميكانيكي14،15،16،17. ومع ذلك، فإن الفحص عالي الإنتاجية للمواد الكيميائية يعتمد عادة على التعرض للمياه. بالنظر إلى أن الامتصاص يمكن أن يكون متغيرا بناء على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للمركب في المحلول (أي التحلل الضوئي ، والذوبان) ، يمكن أن يكون هذا قيدا رئيسيا على توصيل الجرعة والاستجابة لها المترابطة.

للتغلب على هذا القيد لمقارنة الجرعة بالفقاريات الأعلى ، تم تصميم منهجية لتحليل تركيزات المعادن النزرة في أنسجة يرقات الزرد. هنا ، تم تقييم منحنيات استجابة الجرعة لنقاط النهاية القاتلة وشبه المميتة للسيسبلاتين والمركبات المضادة للسرطان الجديدة القائمة على Ru. تم تقييم الفتك وتأخر الفقس للتركيزات الاسمية من 0 و 3.75 و 7.5 و 15 و 30 و 60 ملغم / لتر سيسبلاتين. تم تحديد تراكم Pt في أنسجة الكائنات الحية من خلال تحليل ICPMS ، وكان امتصاص الكائنات الحية للجرعات المعنية 0.05 و 8.7 و 23.5 و 59.9 و 193.2 و 461.9 نانوغرام (Pt) لكل كائن حي. بالإضافة إلى ذلك ، تعرضت يرقات الزرد إلى 0 ، 3.1 ، 6.2 ، 9.2 ، 12.4 ملغ / لتر من PMC79. وقد حددت هذه التركيزات تحليليا على أنها تحتوي على 0 و 0.17 و 0.44 و 0.66 و 0.76 ملغم/لتر من Ru. سمح هذا البروتوكول أيضا بتمييز تركيزات Pt المعزولة في مشيمية اليرقات مقارنة بأنسجة الزرد. كانت هذه المنهجية قادرة على توفير بيانات موثوقة وقوية لمقارنات النشاط الدوائي والسمي بين العلاج الكيميائي الراسخ والمركب الجديد. يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة واسعة من المعادن والمركبات القائمة على المعادن.

Protocol

تم استخدام سلالة AB من أسماك الزرد (Danio rerio) لجميع التجارب (انظر جدول المواد) ، وتمت الموافقة على بروتوكول التربية (# 08-025) من قبل لجنة رعاية ومرافق الحيوانات بجامعة روتجرز.

1. تربية أسماك الزرد

  1. قم بتربية أسماك الزرد والحفاظ عليها في نظام موائل مائية معاد تدويرها على ضوء 14 ساعة: 10 ساعات دورة مظلمة.
    1. تنقية مياه الصنبور البلدية من خلال الرمل وترشيح الكربون للحصول على مياه نظام الأسماك. الحفاظ على مياه النظام المائي عند 28 درجة مئوية ، <0.05 جزء في المليون من النتريت ، <0.2 جزء في المليون من الأمونيا ، ودرجة الحموضة بين 7.2 و 7.7.
    2. إطعام سمك الزرد اتباع نظام غذائي من الخراجات الأرتيميا فقس ، والروبيان الملحي ، والأسماك حمية تقشر الطعام.

2. بروتوكول الاستجابة لجرعة سمك الزرد (الشكل 1)

  1. تحضير محلول ماء بيض الزرد ، إما E3 متوسط أو ماء بيض مصنوع من ملح البحر بتركيز 60 ميكروغرام / مل مذاب في ماء منزوع الأيونات18. تجنب استخدام الميثيلين الأزرق.
    ملاحظة: من خلال ICPMS ، تم تحديد التداخل متساوي الضغط لمياه بيض الزرد لأكاسيد السترونتيوم ، والتي تتداخل مع نظير الروثينيوم. الشطف الدقيق لليرقات قبل تحليل المصب خفف من هذه المشكلة. قد يكون وسط E3 خيارا أسهل للبعض بسبب التركيب الخاص لأملاح البحر التجارية.
  2. قم بإذابة المعدن أو المركبات المعدنية في E3 أو ماء البيض. دوامة لتفتيت أي مادة مجمعة وتجانس الحل.
    ملاحظة: في التجربة المبينة أدناه، تم إذابة PMC79 وسيسبلاتين بتركيزات قصوى قدرها 12.4 ملغم/لتر و60 ملغم/لتر بتركيز أقصى قدره 0.5٪ من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لمقاومة هطول الأمطار.
    1. تمييع المعادن الثقيلة أو المركبات القائمة على المعادن ، مثل PMC79 و cisplatin ، مع E3 أو ماء البيض ، وإعداد ما لا يقل عن 5 جرعات تركيز.
      1. ابدأ بتركيزات منخفضة من محاليل المخزون في السيارة النقية (أي DMSO) ، ثم قم بتخفيفها باستخدام E3 أو ماء البيض. النظر في تركيزات السيارة النهائية بعناية.
        ملاحظة: تتحلل بعض المركبات المعدنية ، مثل سيسبلاتين ، بسرعة ، ويجب أن تكون محاليقها طازجة يوميا. تنبيه: تعامل مع المعادن الثقيلة والمعالجة الكيميائية بعناية. راجع ورقة بيانات سلامة المواد المحددة (MSDS) بحثا عن المعدن محل الاهتمام. قد يسبب سيسبلاتين تهيج العين والجلد ، ويكون قاتلا إذا تم ابتلاعه ، ويمكن أن يسبب سمية في الكلى والدم والأعضاء المكونة للدم وأنسجة الجنين. تجنب استنشاق الأبخرة وملامسة العينين والجلد والملابس. ارتداء قفازات وملابس منيعة ، ونظارات السلامة أو نظارات واقية19.
  3. قم بإعداد خزانات تربية بعد ظهر اليوم السابق للتجربة بنسبة مثالية من 2 أنثى إلى 1 ذكر مع وجود فاصل بين الجنسين20.
    1. اسحب الفاصل عندما تضيء الأضواء للدورة الصباحية.
    2. السماح للزرد أن تتكاثر.
      ملاحظة: يعتمد طول الفترة الزمنية للتكاثر على مرحلة التعرض الأولية المطلوبة. لمدة 3 ساعات بعد الإخصاب ، اسمح بالتكاثر لمدة 2 ساعة تقريبا. سيصل البيض إلى 3 hpf بعد تنظيف البيض وفصله.
    3. انقل أسماك التربية إلى خزان نظيف.
    4. جمع البيض عن طريق صب ماء الخزان من خلال مصفاة.
    5. اقلب المصفاة فوق طبق بتري واستخدم زجاجة بخاخ مملوءة بماء E3 أو البيض لشطف البيض في الطبق.
    6. نظف الطبق من الطعام والفضلات قبل الاستخدام التجريبي.
  4. قم بتوزيع ما يقرب من 22 3 جنينا من نوع hpf لكل جرعة في قوارير زجاجية فردية باستخدام ماصة نقل وكمية صغيرة من الماء.
  5. بعد أن تكون جميع الأجنة في قوارير ، قم بإزالة كل ماء البيض واستبدله بمحلول جرعات كاف بحيث يكون هناك ما يقرب من 1 بوصة من المحلول فوق ارتفاع البويضة.
    ملاحظة: ينبغي النظر بعناية في ضرورة إزالة التورية. راجع قسم المناقشة لمزيد من التفاصيل.
  6. راقب الأجنة يوميا بحثا عن الآفات أو الفتك. نظرا للتطور السريع لأسماك الزرد الجنينية ، احصل على صور يومية باستخدام أي إعداد مجهر / كاميرا ساطعة لتحديد الآفات البسيطة بين الأيام.
  7. عند إنهاء الاستجابة للجرعة (4-5 أيام بعد الإخصاب [dpf] ، وفقا للمبدأ التوجيهي21 لمنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي [OECD]) ، قم بدمج 3-5 يرقات قبل القتل الرحيم لأخذ العينات المركبة. القتل الرحيم عن طريق التبريد السريع عن طريق التجميد المفاجئة في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: القتل الرحيم من خلال جرعة زائدة من MS-222 أو تريكاين ميثان سلفونات قد تتداخل مع تحليل ICPMS في المصب. يتم تشجيع طرق القتل الرحيم سريعة التبريد لهذا البروتوكول للحد من إمكانية التداخل.
  8. قم بإجراء 3 غسلات للأنسجة بمياه عالية النقاء (مثل التناضح العكسي) لإزالة المركب الزائد من الخارج من الأنسجة.
  9. انقل العينات إلى أنابيب طرد مركزي من البولي بروبيلين 15 مل آمنة من الأحماض والميكروويف. كن حذرا لإزالة جميع المياه الزائدة لأن أي سائل متبقي قد يخفف من حمض النيتريك ، وبالتالي ، فإن إمكانات الأكسدة للحمض أثناء تدهور الأنسجة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين الأنسجة عند -20 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل. بالنسبة للمعادن الوفيرة بشكل طبيعي ، فإن تنظيف الأنابيب في حمام حمض النيتريك بنسبة 5٪ قبل الاستخدام سيحسن مستويات الخلفية المحيطة.

3. هضم الأنسجة وتقييم ICPMS (الشكل 2)

  1. أضف حوالي 0.25 مل إلى أنابيب الطرد المركزي المصنوعة من البولي بروبيلين سعة 15 مل لما يصل إلى 10 يرقات (~ 100 ميكروغرام) من حمض النيتريك عالي النقاء (69٪). الموجات فوق الصوتية لمدة 1 ساعة لهضم العينات باستخدام الإعدادات التالية: إخراج الحمام بالموجات فوق الصوتية: 85 واط. 42 كيلو هرتز ± 6 ٪ ؛ نطاق درجة الحرارة: 19-27 درجة مئوية.
    تنبيه: ارتداء حماية الأذن أثناء الصوتنة. حمض النيتريك يسبب حروق خطيرة في الجهاز التنفسي والعين والجلد. ارتداء معدات الحماية الكاملة والعمل في غطاء الدخان أو في الأماكن ذات التهوية الكافية. يمكن أن تكون قابلة للاشتعال مع مواد أخرى. يجب التعامل مع حمض النيتريك حصريا في غطاء الدخان لمنع التعرض للأبخرة المنتجة أثناء الهضم. لا تستنشق أو تبتلع.
    1. قم بإجراء دورات قصيرة من هضم الأنسجة (فترات 5 دقائق) في هاضم ميكروويف آمن للأحماض حتى تتأكسد جميع الأنسجة بشكل واضح (أي محلول موحد وأصفر واضح).
      ملاحظة: يوصى بإجراء بروتوكول الميكروويف الوارد في الجدول 1 ثلاث مرات ويتضمن فترة تبريد مدتها 5 دقائق بين كل خطوة تسخين.
    2. راقب سلامة الأنابيب بعناية لتجنب التمزق وإجراء دورات قصيرة في جهاز الطرد المركزي (313 × جم لمدة 1 دقيقة) بين الدورات لنقل التكثيف الحمضي إلى أسفل الأنبوب.
      ملاحظة: إذا كان من الصعب هضم الأنسجة (خاصة الكوريونات) ، يمكن استخدام بيروكسيد الهيدروجين عالي النقاء بنسبة 30٪ بعد هضم الحمض. استخدم بيروكسيد الهيدروجين (6.75 مل) لتخفيف تركيز الحمض إلى 3.5٪ ، والسماح للعينات بالجلوس بين عشية وضحاها في غطاء الدخان. سوف يتحلل بيروكسيد الهيدروجين إلى H2O وهو مناسب لتحليل ICPMS. علاوة على ذلك ، قد تذوب المعادن البديلة بشكل أفضل في حمض الهيدروكلوريك أو خليط من حمض الهيدروكلوريك وحمض النيتريك (أي أكوا ريجيا). بيروكسيد الهيدروجين ضار إذا تم ابتلاعه ويسبب أضرارا خطيرة للعين. ارتداء حماية البشرة والعين22,23.
  2. بمجرد أكسدة الأنسجة بشكل واضح (أي محلول موحد وأصفر واضح) ، قم بتخفيف العينات في غطاء الدخان إلى 3.5٪ من حمض النيتريك باستخدام 6.75 مل من الماء عالي النقاء والدوامة لخلطها جيدا.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة غير ضرورية إذا تمت إضافة بيروكسيد الهيدروجين للمساعدة في الهضم في الخطوة 3.1.
  3. قم بإجراء منحنى معايرة من 7 نقاط مطابق للمصفوفة (نطاق تركيز يتراوح بين 0.001 و 10 جزء في البليون) باستخدام معيار عنصري معتمد (أي Pt أو Ru ، اعتمادا على الفحص) مع المعدن ذي الأهمية والنظائر (النظائر) المثلى لحساب أي تداخلات متساوية الضغط محتملة.
    1. باستخدام تركيز مخزون من معيار العناصر المائي المعتمد (Ru ، Pt = 1000 ppb) ، خذ أليكوت 0.1 مل وماصة في أنبوب طرد مركزي جديد 15 مل. تمييع مع 3.5٪ حمض النيتريك إلى حجم نهائي من 10 مل لإنتاج محلول قياسي 10 جزء في المليون.
    2. باستخدام مخزون 10 ppb ، قم بإجراء التخفيفات التسلسلية التالية: المحاليل القياسية 0.1 و 1.0 و 5.0 ppb في 3.5٪ من حمض النيتريك.
    3. باستخدام مخزون 0.1 ، قم بإجراء التخفيفات التسلسلية التالية: 0.001 و 0.005 و 0.01 ppb المحاليل القياسية في 3.5٪ من حمض النيتريك.
  4. إعداد صك ICPMS (انظر جدول المواد) لتحليل العينات على النحو التالي:
    1. قبل بدء تشغيل الجهاز، تأكد من أن صمام غاز الأرجون مفتوح، وأن جميع الأنابيب متصلة بإحكام، وأن حمض النيتريك النظيف بنسبة 5٪ مفتوح لشطف الأنابيب والأواني الزجاجية بين تحليلات العينات.
    2. تحقق من حالة الشعلة والمخاريط ، وتأكد من أن صندوق الشعلة مغلق بإحكام وأن أنبوب تصريف غرفة الرش متصل بشكل صحيح بالمضخة المحيطية.
    3. افتح البرنامج (انظر جدول المواد).
    4. تحقق من قراءات التفريغ وتأكد من أن جميع المضخات التوربينية تعمل بنسبة 100٪.
    5. انقر فوق START في نافذة حالة نظام التحكم في البلازما لبدء تسلسل البدء وتشغيل مضخة البلازما ومبرد البلازما وتطهير البخاخات وإضاءة البلازما. انتظر حتى تكون البلازما مضاءة ومستقرة عندما تشير نافذة الحالة إلى اكتمال تسلسل بدء التشغيل. عند هذه النقطة، لاحظ النقاط الخضراء الموجودة في نافذة حالة النظام التي تشير إلى أن جميع مصادر الطاقة قيد التشغيل.
    6. في شريط القوائم ، انقر فوق التحكم | أخذ العينات التلقائية في القائمة المنسدلة. أدخل موضع حامل أخذ العينات التلقائية للأنبوب الذي يحتوي على 5٪ من حمض النيتريك. اسمح للحمض بدخول البلازما.
    7. في شريط القوائم ، انقر فوق المسح الضوئي | مغناطيس في القائمة المنسدلة. في نافذة MagnetScan ، اكتب 115 في موضع كتلة العلامة وانقر فوق Enter. اسمح للمغناطيس بالمسح الضوئي عبر نطاق الكتلة لمدة 115بوصة (114.6083 إلى 115.3749) لمدة 30 دقيقة أثناء ارتفاع درجة حرارة الجهاز.
    8. بعد 30 دقيقة، استخدم عنصر التحكم التلقائي في أخذ العينات للانتقال إلى موضع حل ضبط متعدد العناصر 1 جزء في المليون. قم بشفط حل الضبط وضبط الأداة لتحسين قراءة الإشارة. اضبط موضع الشعلة (X ، Y ، Z ) بحيث يتم محاذاة الشعلة مع مركز المخاريط ومعدل تدفق البخاخات (~ 30 رطل لكل بوصة مربعة) في نافذة التحكم في البلازما . قم بإجراء التعديلات اللازمة في نافذة ضبط البصريات الأيونية للمصدر والكاشف والمحلل.
    9. بمجرد تحسين قراءة الإشارة (~ 1.2 × 106 التهم / ثانية ل 1 جزء في المليار على 115بوصة) ، انقر فوق إيقاف في نافذة مسح المغناطيس .
      1. انقر فوق معايرة المغناطيس وحدد دقة منخفضة في النافذة المنبثقة.
      2. انقر فوق موافق وافتح ملف "معايرة الكتلة (دقة منخفضة).smc" لمعايرة المغناطيس.
        ملاحظة: ستقوم معايرة المغناطيس بقياس الأعداد / الثواني وتناسب منحنى من خلال نطاق الكتلة التالي: 7Li إلى 238U.
      3. انقر على حفظ | استخدم لتطبيق معايرة المغناطيس الحالية على التحليلات. في حالة قياس عينات غير معروفة بمجموعة كبيرة من التركيزات، قم بإجراء معايرة الكاشف لمقارنة إشارات تعداد نبضات الأيونات بتركيزات منخفضة بإشارات الأيونات الموهنة المنتجة بتركيزات أعلى. قم بتحليل العينات بمجرد اكتمال الضبط والمعايرة.
    10. في شريط القوائم، انقر على الحصول على البيانات.
      1. انقر فوق إعداد الطريقة في القائمة المنسدلة. استخدم طريقة موجودة توفرها الشركة المصنعة، أو قم بإنشاء طريقة تستند إلى عناصر الاهتمام. إذا لزم الأمر ، اضبط وضع التحليل ، ووقت الإقامة ، وتأخير التبديل ، وعدد عمليات الاجتياح / الدورات ، والدقة ، ووضع الكشف ، وكتلة الركن لإعدادات الانحراف.
      2. انقر فوق حفظ لتسجيل إعدادات الطريقة. تحسين المعلمات لكل معدن ونظائر. انظر الجدول 2 للاطلاع على معلمات التشغيل المحددة المستخدمة في هذه الدراسة.
    11. في شريط القوائم، انقر على الحصول على البيانات.
      1. انقر فوق تشغيل الدفعات في القائمة المنسدلة. بدلا من ذلك ، انقر فوق رمز BATCH أسفل شريط القوائم. استيراد معلمات الدفعات من جدول بيانات، أو إنشاء تسلسل في نافذة تشغيل الدفعات . أدخل نوع العينة، وموضع حامل أخذ العينات التلقائي، ووقت النقل، ووقت الغسيل، والنسخ المتماثل، ومعرف العينة، وملف الطريقة.
    12. رتب تشغيل الدفعة بالترتيب التالي: الحلول القياسية لمنحنى المعايرة (0.001-10 ppb Pt أو Ru) ، متبوعة بمعيار مراقبة الجودة ، ثم عينات غير معروفة.
      ملاحظة: يتم قياس الحلول القياسية كأعداد / ثوان على ICPMS ، ويتم ملاءمة الانحدار الخطي من خلال المعايير مع انحراف معياري نسبي (RSD) > 0.999. يتم قياس المجهولات أيضا كأعداد / ثوان وحلها للتركيز في ppb باستخدام الانحدار الخطي لمنحنى المعايرة ، y = mx + b. يمكن أيضا إكمال معالجة البيانات باستخدام البرنامج المشار إليه.
    13. راقب انحراف الأجهزة وقابلية تكرار العينات من خلال تضمين معيار مراقبة الجودة 0.5 جزء في المليار كل 5-10 عينات.
      ملاحظة: يجب أن تكون معايير مراقبة الجودة المناسبة مادة مرجعية قياسية معتمدة تختلف عن المعيار المستخدم في منحنى المعايرة.
واتسقوةمحضر
30050%5
30075%5
3000%5
30075%5

الجدول 1: بروتوكول الهضم بالميكروويف لكتلة الأنسجة اليرقية. تم هضم عينات يرقات الزرد في 0.25 مل من حمض النيتريك. عدل هذا الجدول من 24.

النتائج

وقد نشرت هذه النتائج سابقا24. أجريت دراسات امتصاص الأنسجة مع التعرض للسيسبلاتين المنقول بالماء ومركب جديد مضاد للسرطان قائم على Ru ، PMC79. تم تقييم الفتك والفقس المتأخر للتركيزات الاسمية من سيسبلاتين 0 و 3.75 و 7.5 و 15 و 30 و 60 ملغم / لتر سيسبلاتين. تم تحديد تراكم Pt في أنسجة الكائنات الح?...

Discussion

تم تنفيذ البروتوكول الموصوف هنا لتحديد تسليم وامتصاص الأدوية المضادة للسرطان القائمة على المعادن التي تحتوي إما على Pt أو Ru. على الرغم من أن هذه الأساليب قد تم نشرها بالفعل ، إلا أن هذا البروتوكول يناقش اعتبارات وتفاصيل مهمة لتكييف هذه المنهجية مع مجموعة من المركبات. سمح لنا بروتوكول منظمة...

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح يمكن الكشف عنه من قبل أي من المؤلفين.

Acknowledgements

التمويل: NJAES-Rutgers NJ01201 ، منحة تدريب NIEHS T32-ES 007148 ، NIH-NIEHS P30 ES005022. بالإضافة إلى ذلك ، يتم دعم بريتاني كاراس من خلال منحة التدريب T32NS115700 من NINDS ، المعاهد الوطنية للصحة. ويعترف صاحبا البلاغ بأندريا فالنتي وبالمؤسسة البرتغالية للعلوم والتكنولوجيا (Fundação para a Ciência e Tecnologia, FCT; PTDC/QUI-QIN/28662/2017) لتوريد PMC79.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AB Strain Zebrafish (Danio reri)Zebrafish International Resource CenterWild-Type ABWild-Type AB Zebrafish
ACS Grade Nitric AcidVWR BDH ChemicalsBDH3130-2.5LPNitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes
Aquatox Fish Diet (Flake)Zeigler Bros, Inc.Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Artemia cysts, brine shrimpPentairAESBS90Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed
ASX-510 Autosampler for ICPMSTeledyne CETACAutomatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses.  
CentrifugeThermo ScientificCL 2Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention
Centrifuge tubesVWR21008-105Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom
Class A Clear Glass Threaded VialsFisherbrand03-339-25BIndividual glass vials for exposure containment
Dimethyl SulfoxideMillipore SigmaD8418Solvent or vehicle for hydrophobic compounds
Fixed Speed Vortex MixerVWR10153-834Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution
High Purity Hydrogen PeroxideMerk KGaA, EDM Millipore1.07298.0250Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion
High Purity Nitric AcidEDM MilliporeNX0408-2Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion
Instant Ocean Sea SaltSpectrum Brands, Inc.Instant Ocean® Sea SaltEgg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml
Mars X Microwave Digestion SystemCEM, Matthews, NCMicrowave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W). 
Multi-element Solution 3SPEX CertiPREPCLMS-3Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses
Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS)Nu Instruments/AmatekDouble focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software. 
Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140National Institute of Standards and Technology3140Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses
Platinum (Pt) standard solution, single-elementHigh Purity Standards100040-2Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl
Ruthenium (Ru) standard solution, single-elementHigh Purity Standards100046-2Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl
TetraMin Tropical FlakesTetra77101Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Trace Metal Grade Nitric AcidVWR BDH Chemicals87003-261Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler
Ultrasonic water bathVWRB2500A-DTHUltrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion

References

  1. Rehman, K., Fatima, F., Waheed, I., Akash, M. S. H. Prevalence of exposure of heavy metals and their impact on health consequences. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (1), 157-184 (2018).
  2. Anyanwu, B. O., Ezejiofor, A. N., Igweze, Z. N., Orisakwe, O. E. Heavy metal mixture exposure and effects in developing nations: an update. Toxics. 6 (4), 65 (2018).
  3. Doherty, C. L., Buckley, B. T. Translating analytical techniques in geochemistry to environmental health. Molecules. 26 (9), 2821 (2021).
  4. Boros, E., Dyson, P. J., Gasser, G. Classification of metal-based drugs according to their mechanisms of action. Chem. 6 (1), 41-60 (2020).
  5. Robertson, J., Barr, R., Shulman, L. N., Forte, G. B., Magrini, N. Essential medicines for cancer: WHO recommendations and national priorities. Bulletin of the World Health Organization. 94 (10), 735-742 (2016).
  6. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  7. Brown, A., Kumar, S., Tchounwou, P. B. Cisplatin-based chemotherapy of human cancers. Journal of Cancer Science & Therapy. 11 (4), 97 (2019).
  8. Ghosh, S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug. Bioorganic Chem. 88, 102925 (2019).
  9. Abid, M., Shamsi, F., Azam, A. Ruthenium complexes: an emerging ground to the development of metallopharmaceuticals for cancer therapy. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 16 (10), 772-786 (2016).
  10. Alessio, E., Messori, L. NAMI-A and KP1019/1339, two iconic ruthenium anticancer drug candidates face-to-face: a case story in medicinal inorganic chemistry. Molecules. 24 (10), 1995 (2019).
  11. Alessio, E., Mestroni, G., Bergamo, A., Sava, G. Ruthenium antimetastatic agents. Current Topics in Medicinal Chemistry. 4 (15), 1525-1535 (2004).
  12. Lin, K., Zhao, Z. -. Z., Bo, H. -. B., Hao, X. -. J., Wang, J. -. Q. Applications of ruthenium complex in tumor diagnosis and therapy. Frontiers in Pharmacology. 9, 1323 (2018).
  13. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  14. Wiley, D. S., Redfield, S. E., Zon, L. I. Chemical screening in zebrafish for novel biological and therapeutic discovery. Methods in Cell Biology. 138, 651-679 (2017).
  15. Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in toxicology and environmental health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
  16. Rubinstein, A. L. Zebrafish assays for drug toxicity screening. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (2), 231-240 (2006).
  17. Cassar, S., et al. Use of zebrafish in drug discovery toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
  18. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , (2000).
  19. Material safety data sheet: cisplatin injection). Pfizer Available from: https://cdn.pfizer.com/pfizercom/products/material_safety_data/PZ01470.pdf (2011)
  20. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  21. OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals Available from: https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-236-fish-embryo-acute-toxicity-fet-test_9789264203709-en (2013)
  22. EMD Millipore Corporation. Material Safety Data Sheet: OmniTrace Nitric Acid. EMD Millipore Corporation. , (2013).
  23. Safety data sheet: Hydrogen peroxide 30% Suprapur. EMD Millipore Corporation Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/product/Hydrogen-peroxide-300-0 (2014)
  24. Karas, B. F., et al. A novel screening method for transition metal-based anticancer compounds using zebrafish embryo-larval assay and inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis. Journal of Applied Toxicology. 39 (8), 1173-1180 (2019).
  25. Henn, K., Braunbeck, T. Dechorionation as a tool to improve the fish embryo toxicity test (FET) with the zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology: CBP. 153 (1), 91-98 (2011).
  26. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  27. Karas, B. F., Hotz, J. M., Buckley, B. T., Cooper, K. R. Cisplatin alkylating activity in zebrafish causes resistance to chorionic degradation and inhibition of osteogenesis. Aquatic Toxicology. 229, 105656 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved