Absorção de dose de exposição composta à base de platina e rutênio em zebrafish por espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado com aplicações mais amplas

Resumo

O aumento da taxa de análises farmaco-e toxicoléticas de metais e compostos à base de metal em zebrafish pode ser vantajoso para estudos de tradução ambiental e clínica. A limitação da absorção de exposição transmitida pela água desconhecida foi superada pela realização de análises metálicas de traços no tecido de zebrafish digerido usando espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada.

Resumo

Metais e compostos à base de metal compreendem xenobióticos farmaco-ativos e toxicológicos multifásicos. Da toxicidade do metal pesado à quimioterapia, os toxicokinetics desses compostos têm relevância histórica e moderna. Os zebrafish tornaram-se um organismo modelo atraente na elucidação da farmaco e toxicopinatics em estudos de exposição ambiental e tradução clínica. Embora os estudos de zebrafish tenham o benefício de serem mais bem-colocados do que os modelos de roedores, existem várias restrições significativas ao modelo.

Uma dessas limitações é inerente ao regime de dosagem aquaviário. As concentrações de água desses estudos não podem ser extrapoladas para fornecer doses internas confiáveis. Medições diretas dos compostos à base de metal permitem uma melhor correlação com respostas moleculares e biológicas relacionadas a compostos. Para superar essa limitação para metais e compostos à base de metal, desenvolveu-se uma técnica para digerir tecido larval de zebrafish após exposição e quantificar concentrações metálicas dentro de amostras de tecido por espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICPMS).

Métodos ICPMS foram usados para determinar as concentrações metálicas de platina (Pt) de cisplatina e rutênio (Ru) de várias quimioterapias baseadas em Ru em tecido de zebrafish. Além disso, este protocolo distinguiu concentrações de Pt que foram sequestradas no acorde da larva em comparação com o tecido zebrafish. Estes resultados indicam que este método pode ser aplicado para quantificar a dose metálica presente nos tecidos larvais. Além disso, este método pode ser ajustado para identificar metais específicos ou compostos à base de metal em uma ampla gama de estudos de exposição e dosagem.

Introdução

Metais e compostos metálicos continuam a ter relevância farmacológica e toxicológica. A prevalência de exposição ao metal pesado e seu impacto na saúde aumentou exponencialmente a investigação científica desde a década de 1960 e atingiu um recorde em 2021. As concentrações de metais pesados na água potável, poluição do ar e exposição ocupacional excedem os limites regulatórios em todo o mundo e permanecem um problema para arsênico, cádmio, mercúrio, cromo, chumbo e outros metais. Novos métodos para quantificar a exposição ambiental e analisar o desenvolvimento patológico continuam em alta demanda ^1,2,3

Protocolo

O zebrafish de cepa AB (Danio rerio) foi utilizado para todos os experimentos (ver a Tabela de Materiais), e o protocolo de criação (#08-025) foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Instalações de Animais da Universidade Rutgers.

1. Criação de zebrafish

1. Procriar e manter o zebrafish em um sistema de habitat aquático recirculante em um ciclo escuro de 14 horas:10 h.
   1. Purificar a água da torneira municipal através da areia e filtragem de carbono para obter água do sistema de peixes. Mantenha a água do sistema aquático a 28 °C, <0,05 ppm de nitrito, <0,2 ppm de amônia e pH entre 7,2 e ....

Resultados

Esses resultados foram publicados anteriormente²⁴. Estudos de absorção de tecidos foram realizados com exposições transmitidas pela água de cisplatina e um novo composto anticâncer baseado em Ru, PMC79. A letalidade e o eclosão retardado foram avaliados para concentrações nominais de cisplatina 0, 3,75, 7,5, 15, 30 e 60 mg/L cisplatina. O acúmulo de PT no tecido do organismo foi determinado pela análise do ICPMS, e o tecido do organismo continha as respectivas doses de 0,05, 8,7, 23,5, .......

Discussão

O protocolo aqui descrito foi implementado para determinar a entrega e a absorção de drogas anticancerígenas baseadas em metal contendo Pt ou Ru. Embora esses métodos já tenham sido publicados, este protocolo discute considerações e detalhes importantes para adaptar essa metodologia para uma variedade de compostos. O protocolo da OCDE, juntamente com a digestão tecidual e a análise do ICPMS, nos permitiu determinar que o PMC79 era mais potente que a cisplatina e resultou em acúmulo de tecidos díspares, sugerin.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AB Strain Zebrafish (Danio reri)	Zebrafish International Resource Center	Wild-Type AB	Wild-Type AB Zebrafish
ACS Grade Nitric Acid	VWR BDH Chemicals	BDH3130-2.5LP	Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes
Aquatox Fish Diet (Flake)	Zeigler Bros, Inc.		Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Artemia cysts, brine shrimp	PentairAES	BS90	Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed
ASX-510 Autosampler for ICPMS	Teledyne CETAC		Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses.
Centrifuge	Thermo Scientific	CL 2	Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention
Centrifuge tubes	VWR	21008-105	Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom
Class A Clear Glass Threaded Vials	Fisherbrand	03-339-25B	Individual glass vials for exposure containment
Dimethyl Sulfoxide	Millipore Sigma	D8418	Solvent or vehicle for hydrophobic compounds
Fixed Speed Vortex Mixer	VWR	10153-834	Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution
High Purity Hydrogen Peroxide	Merk KGaA, EDM Millipore	1.07298.0250	Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion
High Purity Nitric Acid	EDM Millipore	NX0408-2	Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion
Instant Ocean Sea Salt	Spectrum Brands, Inc.	Instant Ocean® Sea Salt	Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml
Mars X Microwave Digestion System	CEM, Matthews, NC		Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W).
Multi-element Solution 3	SPEX CertiPREP	CLMS-3	Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses
Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS)	Nu Instruments/Amatek		Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software.
Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140	National Institute of Standards and Technology	3140	Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses
Platinum (Pt) standard solution, single-element	High Purity Standards	100040-2	Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl
Ruthenium (Ru) standard solution, single-element	High Purity Standards	100046-2	Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl
TetraMin Tropical Flakes	Tetra	77101	Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Trace Metal Grade Nitric Acid	VWR BDH Chemicals	87003-261	Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler
Ultrasonic water bath	VWR	B2500A-DTH	Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion