Absorción de dosis de exposición a compuestos a base de platino y rutenio en peces cebra mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente con aplicaciones más amplias

Resumen

El aumento de la tasa de análisis farmacológicos y toxicocinéticos de metales y compuestos a base de metales en el pez cebra puede ser ventajoso para los estudios de traducción ambiental y clínica. La limitación de la absorción de exposición desconocida en el agua se superó mediante la realización de análisis de metales traza en tejido de pez cebra digerido mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente.

Resumen

Los metales y los compuestos a base de metales comprenden xenobióticos farmacoactivos y toxicológicos múltiples. Desde la toxicidad por metales pesados hasta la quimioterapéutica, la toxicocinética de estos compuestos tiene relevancia histórica y moderna. El pez cebra se ha convertido en un organismo modelo atractivo para dilucidar la farmacocinética y la toxicocinética en estudios de exposición ambiental y traducción clínica. Aunque los estudios de pez cebra tienen el beneficio de ser de mayor rendimiento que los modelos de roedores, hay varias restricciones significativas para el modelo.

Una de esas limitaciones es inherente al régimen de dosificación en el agua. Las concentraciones de agua de estos estudios no se pueden extrapolar para proporcionar dosis internas confiables. Las mediciones directas de los compuestos a base de metales permiten una mejor correlación con las respuestas moleculares y biológicas relacionadas con los compuestos. Para superar esta limitación para metales y compuestos a base de metales, se desarrolló una técnica para digerir el tejido larvario de pez cebra después de la exposición y cuantificar las concentraciones de metales dentro de las muestras de tejido mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICPMS).

Se utilizaron métodos ICPMS para determinar las concentraciones metálicas de platino (Pt) a partir de cisplatino y rutenio (Ru) de varios quimioterapéuticos novedosos basados en Ru en tejido de pez cebra. Además, este protocolo distinguió las concentraciones de Pt que fueron secuestradas en el corion de la larva en comparación con el tejido del pez cebra. Estos resultados indican que este método se puede aplicar para cuantificar la dosis de metal presente en los tejidos larvales. Además, este método puede ajustarse para identificar metales específicos o compuestos a base de metales en una amplia gama de estudios de exposición y dosificación.

Introducción

Los metales y los compuestos a base de metales siguen teniendo relevancia farmacológica y toxicológica. La prevalencia de la exposición a metales pesados y su impacto en la salud ha aumentado exponencialmente la investigación científica desde la década de 1960 y alcanzó un máximo histórico en 2021. Las concentraciones de metales pesados en el agua potable, la contaminación del aire y la exposición ocupacional exceden los límites regulatorios en todo el mundo y siguen siendo un problema para el arsénico, el cadmio, el mercurio, el cromo, el plomo y otros metales. Los métodos novedosos para cuantificar la exposición ambiental y analizar el desarrollo patológico siguen^teniendo una gran demanda ^1,2,3.

Por el contrario, el campo médico ha aprovechado las propiedades fisicoquímicas de varios metales para el tratamiento clínico. Los medicamentos a base de metales o metalodrugs tienen una rica historia de propósitos medicinales y han demostrado actividad contra una variedad de enfermedades, con el mayor éxito como la quimioterapéutica⁴. El más famoso de los metalofármacos, el cisplatino, es un medicamento contra el cáncer a base de Pt considerado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como uno de los medicamentos esenciales del mundo⁵. En 2010, el cisplatino y sus derivados Pt tuvieron una tasa de éxito de hasta el 90% en varios cánceres y se utilizaron en aproximadamente el 50% de los regímenes de quimioterapia ^6,7,8. Aunque los quimioterapéuticos basados en Pt han tenido un éxito irrefutable, la toxicidad limitante de la dosis ha puesto en marcha investigaciones de fármacos alternativos a base de metales con administración y actividad biológica refinada. De estas alternativas, los compuestos a base de Ru se han convertido en los^{más populares} 9,10,11,12.

Se requieren nuevos modelos y metodología para mantener el ritmo de la tasa de necesidad de estudios farmacológicos y toxicocinéticos de metales. El modelo de pez cebra se encuentra en la intersección de complejidad y rendimiento, siendo un vertebrado de alta fecundidad con un 70% de homología génica conservada¹³. Este modelo ha sido un activo en farmacología y toxicología, con extensos exámenes de detección de diversos compuestos para el descubrimiento de plomo, la identificación de objetivos y la actividad mecanicista ^14,15,16,17. Sin embargo, el cribado de alto rendimiento de productos químicos generalmente se basa en exposiciones transmitidas por el agua. Dado que la absorción puede ser variable en función de las propiedades fisicoquímicas del compuesto en solución (es decir, fotodegradación, solubilidad), esto puede ser una limitación importante para correlacionar la administración de dosis y la respuesta.

Para superar esta limitación para la comparación de la dosis con vertebrados superiores, se diseñó una metodología para analizar las concentraciones de metales traza en el tejido larvario del pez cebra. Aquí, se evaluaron las curvas dosis-respuesta de los criterios de valoración letales y subletales para el cisplatino y los nuevos compuestos anticancerígenos a base de Ru. La letalidad y el retraso en la eclosión se evaluaron para concentraciones nominales de 0, 3,75, 7,5, 15, 30 y 60 mg/L de cisplatino. La acumulación de Pt en el tejido del organismo se determinó mediante el análisis de ICPMS, y la absorción del organismo de las dosis respectivas fue de 0,05, 8,7, 23,5, 59,9, 193,2 y 461,9 ng (Pt) por organismo. Además, las larvas de pez cebra fueron expuestas a 0, 3.1, 6.2, 9.2, 12.4 mg / L de PMC79. Estas concentraciones se determinaron analíticamente para contener 0, 0,17, 0,44, 0,66 y 0,76 mg/L de Ru. Este protocolo también permitió distinguir las concentraciones de Pt secuestrado en el corion de las larvas en comparación con el tejido del pez cebra. Esta metodología fue capaz de proporcionar datos fiables y sólidos para las comparaciones de la actividad farmacocinética y toxicocinética entre un quimioterapéutico bien establecido y un compuesto nuevo. Este método se puede aplicar a una amplia gama de metales y compuestos a base de metales.

Protocolo

El pez cebra de la cepa AB (Danio rerio) se utilizó para todos los experimentos (consulte la Tabla de materiales), y el protocolo de cría (# 08-025) fue aprobado por el Comité de Cuidado e Instalaciones de Animales de la Universidad de Rutgers.

1. Cría de pez cebra

1. Cría y mantiene al pez cebra en un sistema de hábitat acuático de recirculación en un ciclo de oscuridad de 14 h de luz:10 h.
   1. Purificar el agua del grifo municipal a través de la arena y la filtración de carbono para obtener agua del sistema de peces. Mantener el agua del sistema acuático a 28 °C, <0.05 ppm nitrito, <0.2 ppm de amoníaco y pH entre 7.2 y 7.7.
   2. Alimente al pez cebra con una dieta de quistes de Artemia eclosionados, camarones en salmuera y alimentos en escamas de la dieta de los peces.

2. Protocolo dosis-respuesta del pez cebra (Figura 1)

1. Preparar una solución de agua de huevo de pez cebra, ya sea E3 medio o agua de huevo hecha de sal marina de stock a una concentración de 60 μg/mL disuelta en agua desionizada¹⁸. Evite el uso de azul de metileno.
   NOTA: A través de ICPMS, se identificó la interferencia isobárica del agua de huevo de pez cebra para los óxidos de estroncio, que se superponían con un isótopo de rutenio. El enjuague cuidadoso de las larvas antes del análisis aguas abajo mejoró este problema. El medio E3 puede ser una opción más fácil para algunos debido a la composición patentada de sales marinas comerciales.
2. Disuelva el metal o los compuestos a base de metal en E3 o agua de huevo. Vórtice para romper cualquier material agregado y homogeneizar la solución.
   NOTA: En el experimento descrito a continuación, PMC79 y cisplatino se disolvieron a concentraciones máximas de 12,4 mg / L y 60 mg / L con una concentración máxima de 0,5% de dimetilsulfóxido (DMSO) para resistir la precipitación.
   1. Diluya metales pesados o compuestos a base de metales, como PMC79 y cisplatino, con E3 o agua de huevo, preparando al menos 5 dosis de concentración.
      1. Comience con bajas concentraciones de soluciones madre en vehículo puro (es decir, DMSO), luego diluya con E3 o agua de huevo. Considere cuidadosamente las concentraciones finales del vehículo.
         NOTA: Ciertos compuestos a base de metales, como el cisplatino, se degradan rápidamente y sus soluciones deben hacerse frescas diariamente. PRECAUCIÓN: Manipule los metales pesados y la quimioterapia con cuidado. Revise la hoja de datos de seguridad de materiales específicos (MSDS) para el metal de interés. El cisplatino puede causar irritación de los ojos y la piel, ser fatal si se ingiere y puede causar toxicidad en los riñones, la sangre, los órganos formadores de sangre y el tejido fetal. Evite los vapores respiratorios y el contacto con los ojos, la piel y la ropa. Use guantes y ropa impermeables, y gafas o gafas de seguridad¹⁹.
3. Instale tanques de cría la tarde anterior al experimento en la proporción ideal de 2 hembras por 1 macho con un divisor en su lugar entre los sexos²⁰.
   1. Tire del divisor cuando se enciendan las luces para el ciclo de la mañana.
   2. Permita que el pez cebra se reproduzca.
      NOTA: El período de tiempo para la reproducción depende de la etapa de exposición inicial requerida. Durante 3 h después de la fertilización, permita la reproducción durante aproximadamente 2 h. Los huevos alcanzarán los 3 hpf después de limpiar y segregar los huevos.
   3. Mueva los peces reproductores a un tanque limpio.
   4. Recoge los huevos vertiendo el agua del tanque a través de un colador.
   5. Invierta el colador sobre una placa de Petri y use una botella de chorro llena de E3 o agua de huevo para enjuagar los huevos en el plato.
   6. Limpie el plato de alimentos y desechos antes del uso experimental.
4. Aleatorizar aproximadamente veinte embriones de 3 hpf por dosis en viales de vidrio individuales utilizando una pipeta de transferencia y una pequeña cantidad de agua.
5. Después de que todos los embriones estén en viales, retire toda el agua del huevo y reemplácela con suficiente solución dosificadora para que haya aproximadamente 1 pulgada de solución por encima de la altura del óvulo.
   NOTA: La necesidad de la deelección debe considerarse cuidadosamente. Consulte la sección de discusión para obtener más detalles.
6. Observar los embriones diariamente en busca de lesiones o letalidad. Debido al rápido desarrollo del pez cebra embrionario, obtenga imágenes diarias utilizando cualquier configuración de microscopio / cámara de campo brillante para identificar lesiones menores entre días.
7. Al finalizar la respuesta a la dosis (4-5 días después de la fertilización [dpf], según la directriz²¹ de la Organización de Cooperación y Desarrollo Económicos [OCDE]), combine 3-5 larvas antes de la eutanasia para el muestreo compuesto. Eutanasia por enfriamiento rápido por congelación instantánea en nitrógeno líquido.
   NOTA: La eutanasia a través de una sobredosis de MS-222 o metanosulfonato de tricaína puede interferir potencialmente con el análisis de ICPMS aguas abajo. Se recomiendan métodos de eutanasia de enfriamiento rápido para este protocolo para reducir la posibilidad de interferencia.
8. Realice 3 lavados de tejido con agua de alta pureza (como ósmosis inversa) para eliminar el exceso de compuesto del exterior del tejido.
9. Mueva las muestras a tubos centrífugos de polipropileno de 15 ml seguros para ácido y microondas. Tenga cuidado de eliminar todo el exceso de agua , ya que cualquier líquido restante puede diluir el ácido nítrico y, por lo tanto, el potencial oxidante del ácido durante la degradación del tejido.
   NOTA: En este punto, el tejido puede almacenarse a -20 °C hasta un análisis adicional. Para metales naturalmente abundantes, la limpieza de los tubos en un baño de ácido nítrico al 5% antes de su uso mejorará los niveles de fondo ambiental.

3. Digestión tisular y evaluación del ICPMS (Figura 2)

1. Agregue aproximadamente 0,25 ml a los tubos centrífugos de polipropileno de 15 ml para hasta 10 larvas (~ 100 μg) de ácido nítrico de alta pureza (69%). Ultrasonicar durante 1 h para predigerir las muestras utilizando los siguientes ajustes: salida de baño ultrasónico: 85 W; 42 kHz ± 6%; rango de temperatura: 19-27 °C.
   PRECAUCIÓN: Use protección para los oídos durante la sonicación. El ácido nítrico causa quemaduras graves en las vías respiratorias, los ojos y la piel. Use equipo de protección completo y trabaje en la campana de humos o en lugares con ventilación adecuada. Puede ser inflamable con otros materiales. El ácido nítrico debe manipularse exclusivamente en una campana extractora de humos para evitar la exposición a los vapores producidos durante la digestión. No inhale ni ingiera.
   1. Realice ciclos cortos de digestión de tejidos (intervalos de 5 minutos) en un digestor de microondas seguro para el ácido hasta que todo el tejido esté visiblemente oxidado (es decir, una solución uniforme de color amarillo claro).
      NOTA: Se recomienda que el protocolo de microondas de la Tabla 1 se realice tres veces e incluye un intervalo de enfriamiento de 5 minutos entre cada paso de calentamiento.
   2. Controle cuidadosamente la integridad de los tubos para evitar la ruptura y realice giros cortos en la centrífuga (313 × g durante 1 minuto) entre ciclos para mover la condensación ácida al fondo del tubo.
      NOTA: Si el tejido es difícil de digerir (especialmente los coriones), se puede usar peróxido de hidrógeno de alta pureza al 30% después de la digestión ácida. Use el peróxido de hidrógeno (6.75 ml) para diluir la concentración de ácido al 3.5% y permita que las muestras se sienten durante la noche en una campana de humos. El peróxido de hidrógeno se descompone en H₂O y es adecuado para el análisis ICPMS. Además, los metales alternativos pueden disolverse mejor en ácido clorhídrico o una mezcla de ácido clorhídrico y ácido nítrico (es decir, aqua regia). El peróxido de hidrógeno es dañino si se ingiere y causa daños oculares graves. Use protección para la piel y los ojos^22,23.
2. Una vez que el tejido esté visiblemente oxidado (es decir, una solución uniforme de color amarillo claro), diluya las muestras en una campana de humos a ácido nítrico al 3,5% utilizando 6,75 ml de agua de alta pureza y vórtice para mezclar bien.
   NOTA: En este punto, las muestras se pueden almacenar a temperatura ambiente. Este paso es innecesario si se agregó peróxido de hidrógeno para ayudar a la digestión en el paso 3.1.
3. Realice una curva de calibración de 7 puntos emparejada con la matriz (rango de concentración de 0.001-10 ppb) utilizando un estándar elemental certificado (es decir, Pt o Ru, dependiendo del ensayo) con el metal de interés y los isótopos óptimos para tener en cuenta cualquier interferencia isobárica potencial.
   1. Utilizando una concentración de stock del estándar elemental acuoso y certificado (Ru, Pt = 1000 ppb), tome una alícuota de 0,1 ml y pipete en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml. Diluir con ácido nítrico al 3,5% a un volumen final de 10 ml para producir una solución estándar de 10 ppb.
   2. Usando el stock de 10 ppb, haga las siguientes diluciones en serie: soluciones estándar de 0.1, 1.0 y 5.0 ppb en ácido nítrico al 3.5%.
   3. Usando el stock 0.1, haga las siguientes diluciones en serie: soluciones estándar de 0.001, 0.005 y 0.01 ppb en ácido nítrico al 3.5%.
4. Preparar el instrumento ICPMS (véase el Tabla de Materiales) para el análisis de muestras, según se indica a continuación:
   1. Antes de arrancar el instrumento, asegúrese de que la válvula de gas argón esté abierta, que todos los tubos estén bien conectados y que el ácido nítrico limpio al 5% esté abierto para enjuagar los tubos y la cristalería entre los análisis de muestras.
   2. Verifique el estado de la antorcha y los conos, y asegúrese de que la caja de la antorcha esté bien cerrada y que el tubo de drenaje de la cámara de pulverización esté conectado correctamente a la peribomba.
   3. Abra el software (consulte la Tabla de materiales).
   4. Compruebe las lecturas de vacío y asegúrese de que todas las bombas turbo funcionen al 100%.
   5. Haga clic en INICIAR en la ventana Estado del sistema de control de plasma para iniciar la secuencia de inicio, encender la bomba de plasma, el enfriador de plasma, purgar el nebulizador y encender el plasma. Espere a que el plasma esté encendido y estable cuando la ventana de estado indique que la secuencia de inicio está completa. En este punto, observe los puntos verdes en la ventana Estado del sistema que indican que todas las fuentes de alimentación están encendidas.
   6. En la barra de menús, haga clic en Control | muestreador automático en el menú desplegable. Introduzca la posición del bastidor del muestreador automático para el tubo que contiene un 5% de ácido nítrico. Permita que el ácido entre en el plasma.
   7. En la barra de menús, haga clic en Escanear | Imán en el menú desplegable. En la ventana MagnetScan , escriba 115 en la posición de masa del marcador y haga clic en Entrar. Permita que el imán escanee a través del rango de masa durante ¹¹⁵pulgadas (114.6083 a 115.3749) durante 30 minutos mientras el instrumento se calienta.
   8. Después de 30 minutos, utilice el control de muestreo automático para pasar a la posición de una solución de ajuste multielemento de 1 ppb. Aspire la solución de afinación y ajuste el instrumento para optimizar la lectura de la señal. Ajuste la posición de la antorcha (X, Y, Z) de modo que la antorcha esté alineada con el centro de los conos y el caudal del nebulizador (~ 30 psi) en la ventana de control de plasma . Realice los ajustes necesarios en la ventana Sintonización de óptica de iones para la fuente, el detector y el analizador.
   9. Una vez que se haya optimizado la lectura de la señal (~ 1.2 × 10⁶ recuentos / s para 1 ppb en ^{115 in}), haga clic en Detener en la ventana Magnet Scan .
      1. Haga clic en Calibrar imán y seleccione Baja resolución en la ventana emergente.
      2. Haga clic en Aceptar y abra el archivo "Calibración de masa (baja resolución).smc" para calibrar el imán.
         NOTA: La calibración del imán medirá los recuentos / s y se ajustará a una curva a través del siguiente rango de masa: ⁷Li a ²³⁸U.
      3. Haz clic en Guardar | Se utiliza para aplicar la calibración del imán actual a los análisis. Si mide muestras desconocidas con un amplio rango de concentraciones, realice una calibración del detector para comparar las señales de recuento de pulsos iónicos a bajas concentraciones con las señales de iones atenuadas producidas a concentraciones más altas. Analice las muestras una vez que se completen el ajuste y la calibración.
   10. En la barra de menú, haga clic en Adquisición de datos.
       1. Haga clic en Configuración del método en el menú desplegable. Utilice un método existente proporcionado por el fabricante o cree un método basado en los elementos de interés. Si es necesario, ajuste el modo de análisis, el tiempo de permanencia, el retardo del interruptor, el número de barridos/ciclos, la resolución, el modo de detección y la masa de estacionamiento para la configuración del deflector.
       2. Haga clic en Guardar para registrar la configuración del método. Optimizar los parámetros para cada metal e isótopo. Consulte la Tabla 2 para conocer los parámetros de operación específicos utilizados en este estudio.
   11. En la barra de menú, haga clic en Adquisición de datos.
       1. Haga clic en Ejecución por lotes en el menú desplegable. Alternativamente, haga clic en el icono BATCH debajo de la barra de menú. Importe los parámetros de lote desde una hoja de cálculo o cree una secuencia en la ventana Ejecución por lotes . Introduzca el tipo de muestra, la posición del bastidor del muestreador automático, el tiempo de transferencia, el tiempo de lavado, las réplicas, el ID de muestra y el archivo de método.
   12. Organice el lote en el siguiente orden: soluciones estándar para la curva de calibración (0.001-10 ppb Pt o Ru), seguidas de un estándar de control de calidad, luego muestras desconocidas.
       NOTA: Las soluciones estándar se miden como recuentos/s en el ICPMS, y se ajusta una regresión lineal a través de los estándares con una desviación estándar relativa (DSR) > 0,999. Las incógnitas también se miden como recuentos/s y se resuelven para la concentración en ppb utilizando la regresión lineal de la curva de calibración, y = mx + b. El procesamiento de datos también se puede completar utilizando el software al que se hace referencia.
   13. Monitoree la deriva del instrumento y la reproducibilidad de la muestra incluyendo un estándar de control de calidad de 0.5 ppb cada 5-10 muestras.
       NOTA: Los estándares de control de calidad adecuados deben ser un material de referencia estándar certificado diferente del estándar utilizado en la curva de calibración.

Vatios	Poder	Acta
300	50%	5
300	75%	5
300	0%	5
300	75%	5

Tabla 1: Protocolo de digestión por microondas para la masa de tejido larvario. Las muestras larvales de pez cebra se digirieron en 0,25 ml de ácido nítrico. Esta tabla ha sido modificada de ²⁴.

Resultados

Estos resultados han sido publicados previamente²⁴. Se realizaron estudios de captación de tejidos con exposiciones transmitidas por el agua de cisplatino y un nuevo compuesto anticancerígeno a base de Ru, PMC79. La letalidad y el retraso en la eclosión se evaluaron para las concentraciones nominales de cisplatino 0, 3,75, 7,5, 15, 30 y 60 mg/L de cisplatino. La acumulación de Pt en el tejido del organismo se determinó mediante el análisis del ICPMS, y el tejido del organismo contenía dosis...

Discusión

El protocolo descrito aquí se ha implementado para determinar la administración y la absorción de medicamentos contra el cáncer a base de metal que contienen Pt o Ru. Aunque estos métodos ya han sido publicados, este protocolo discute consideraciones y detalles importantes para adaptar esta metodología para una variedad de compuestos. El protocolo de la OCDE junto con la digestión tisular y el análisis ICPMS nos permitió determinar que PMC79 era más potente que el cisplatino y dio lugar a una acumulación de te...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AB Strain Zebrafish (Danio reri)	Zebrafish International Resource Center	Wild-Type AB	Wild-Type AB Zebrafish
ACS Grade Nitric Acid	VWR BDH Chemicals	BDH3130-2.5LP	Nitric Acid (68-70%); used to make 10% HNO3 acid-bath solution for soaking/pre-celaning centrifuge tubes
Aquatox Fish Diet (Flake)	Zeigler Bros, Inc.		Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Artemia cysts, brine shrimp	PentairAES	BS90	Brine shrimp eggs sold in 15-ozz, vacuum-packed cans to be hatched and used as feed
ASX-510 Autosampler for ICPMS	Teledyne CETAC		Automatic sampler with conifgurable XYZ movement, flowing rinse station, and 0.3 mm inner dimension probe. Compatible with Nu AttoLab software for programmable batch analyses.
Centrifuge	Thermo Scientific	CL 2	Thermo Scientific CL 2 compact benchtop centrifuge with variable speed range up to 5200 rpm; used to bring sample and acid condensate to the bottom of the centrifuge tube bewteen microwave digestion intervals; aids in sample retention
Centrifuge tubes	VWR	21008-105	Ultra high performance polypropylene centrifuge tubes with flat cap; 15 mL volume; leak-proof with conical bottom
Class A Clear Glass Threaded Vials	Fisherbrand	03-339-25B	Individual glass vials for exposure containment
Dimethyl Sulfoxide	Millipore Sigma	D8418	Solvent or vehicle for hydrophobic compounds
Fixed Speed Vortex Mixer	VWR	10153-834	Vortex mixer; used to homogenize sample after acid digestion and dilution
High Purity Hydrogen Peroxide	Merk KGaA, EDM Millipore	1.07298.0250	Suprapur Hydrogen peroxide (30%); used for sample digestion
High Purity Nitric Acid	EDM Millipore	NX0408-2	Omni Trace Ultra Nitric Acid (69%); used for sample digestion
Instant Ocean Sea Salt	Spectrum Brands, Inc.	Instant Ocean® Sea Salt	Egg water solution contains instand ocean sea salt with a final concentration of 60 µg/ml
Mars X Microwave Digestion System	CEM, Matthews, NC		Microwave acid digestion system used to digest and homogenize samples under uniform conditions. For this methodology the open vessel digestion method was completed using single-use polypropylene centrifuge tubes at low power (300 W).
Multi-element Solution 3	SPEX CertiPREP	CLMS-3	Contains 10 mg/L Au, Hf, Ir, Pd, Pt, Fu, Sb, Sr, Te, Sn in 10% HCl/1% HNO3; used as a quality control standard for Pt and Ru analyses
Nu Instruments AttoM High Resolution Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer (HR-ICP-MS)	Nu Instruments/Amatek		Double focussing magnetic sector inductively coupled plasma mass spectrometer with flexible low to high resolution slit system, and dynamic range detector system. Data processing and quantification is done using NuQuant companion software.
Platinum (Pt) standard solution, NIST 3140	National Institute of Standards and Technology	3140	Prepared from ampoule containing 9.996 mg/g Pt in 10% HCl; ; used as a quality control standard for Pt analyses
Platinum (Pt) standard solution, single-element	High Purity Standards	100040-2	Contains 1000 mg/L Pt in 5% HCl
Ruthenium (Ru) standard solution, single-element	High Purity Standards	100046-2	Contains 1000 mg/L Ru in 2% HCl
TetraMin Tropical Flakes	Tetra	77101	Flake food to be mixed in a 1:4 ratio of Aquatox Fish Diet to TetraMin Tropical Flakes and used as feed
Trace Metal Grade Nitric Acid	VWR BDH Chemicals	87003-261	Aristar Plus Nitric Acid (67-70%); used for rinse solution in ASX-510 Autosampler
Ultrasonic water bath	VWR	B2500A-DTH	Ultrasonic water bath used to aid in acid digestion prior to microwave digestion