تنقية بروتينات p53 في كل مكان من خلايا الثدييات

Summary

يصف البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان من خلايا الثدييات باستخدام بروتين مثبط الورم p53 كمثال. تم تنقية بروتينات p53 في كل مكان من الخلايا في ظل ظروف صارمة غير مسخ وتغيير طبيعة .

Abstract

Ubiquitination هو نوع من التعديل بعد الترجمة الذي ينظم ليس فقط الاستقرار ولكن أيضا توطين ووظيفة بروتين الركيزة. تحدث عملية الانتشار في كل مكان داخل الخلايا في حقيقيات النوى وتنظم جميع العمليات البيولوجية الخلوية الأساسية تقريبا. تساعد تنقية البروتينات في كل مكان على التحقيق في دور الوجود في كل مكان في التحكم في وظيفة بروتينات الركيزة. هنا ، يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات مع بروتين مثبط الورم p53 كمثال. تم تنقية بروتينات p53 في كل مكان في ظل ظروف صارمة غير تغيير طبيعة وتغيير الطبيعة. تم تنقية إجمالي بروتين p53 الخلوي الموسوم بالعلم باستخدام الأغاروز المترافق بالأجسام المضادة للعلم في ظل ظروف غير طبيعية. بدلا من ذلك ، تم تنقية البروتين الخلوي الكلي الموسوم في كل مكان باستخدام راتنج مشحون بالنيكل في ظل ظروف تغيير الطبيعة. تم الكشف بنجاح عن بروتينات p53 في كل مكان في الشطف بأجسام مضادة محددة. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن تنقية الأشكال المنتشرة في كل مكان من بروتين معين بكفاءة من خلايا الثدييات ، مما يسهل الدراسات حول أدوار الانتشار في كل مكان في تنظيم وظيفة البروتين.

Introduction

Ubiquitin هو بروتين محفوظ تطوريا من 76 من الأحماض الأمينية¹،^2،3. يوبيكويتين يربط تساهميا بقايا ليسين على البروتينات المستهدفة من خلال الشلالات التي تنطوي على تنشيط (E1) ، واقتران (E2) ، وإنزيمات ligase (E3). يتم تنشيط Ubiquitin أولا بواسطة إنزيم E1 ثم يتم نقله إلى إنزيمات الاقتران E2. بعد ذلك ، تتفاعل أربطة يوبيكويتين E3 مع كل من إنزيمات E2 المحملة باليوبيكويتين وبروتينات الركيزة وتتوسط في تكوين رابطة إيزوببتيد بين الطرف C من يوبيكويتين وبقايا ليسين في الركيزة¹،²،³،^4،5. يتضمن الوجود في كل مكان ربط شقوق ubiquitin ببقايا اللايسين على بروتينات الركيزة أو على نفسها ، مما يؤدي إلى أحادي البروتين أو تعدد البيئات. تحدث عملية الانتشار هذه داخل الخلايا في حقيقيات النوى وتنظم مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات البيولوجية. يؤدي الوجود في كل مكان إلى تدهور بروتينات الركيزة عبر نظام يوبيكويتين بروتيازوم¹،²،³،^4،5. بالإضافة إلى ذلك ، يعدل الانتشار في كل مكان توطين البروتين تحت الخلوي ، وتكوين مركب البروتين ، والاتجار بالبروتين في الخلايا ^3,5. يمكن إزالة شقوق Ubiquitin المرتبطة ببروتينات الركيزة عن طريق إنزيمات deubiquitinating (DUBs)^6,7. والجدير بالذكر أن الطرق المختلفة التي يتم بها تجميع سلاسل ubiquitin توفر عددا لا يحصى من الوسائل لتنظيم العمليات البيولوجية المختلفة ^1,5. لا تزال الأدوار الدقيقة للانتشار في كل مكان في تنظيم وظيفة بروتين الركيزة غير مفهومة بشكل كامل حتى الآن. يساهم تنقية البروتينات في كل مكان في توضيح آثار انتشار البروتين في كل مكان على مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية.

يعد بروتين p53 أحد أهم البروتينات المثبطة للورم ويظهر طفرات جينية أو تعطيلا في جميع أنواع السرطان البشرية تقريبا⁸،⁹،^10،11. يتم تنظيم استقرار ونشاط P53 بدقة في الجسم الحي من خلال تعديلات ما بعد الترجمة ، بما في ذلك الوجود في كل مكان ، والفسفرة ، والأستيل ، والمثيلة^12،13. يحتوي بروتين p53 على عمر نصف قصير يتراوح من 6 دقائق إلى 40 دقيقة في خلايا مختلفة ، والذي ينتج بشكل رئيسي عن تعدد الجزيئات والتحلل البروتيني اللاحق^10,12. الماوس المزدوج الدقيقة 2 (Mdm2) هو E3 ubiquitin ligase من p53 الذي يرتبط بنهاية N من p53 لمنع نشاطه النسخي¹²،^14،15. يعزز Mdm2 تعدد البائن والتدهور البروتيني ل p53 للتحكم في استقراره ويحث على تعدد p53 لتسهيل تصديره النووي¹²،¹⁴،^15،16. هنا ، يتم استخدام انتشار p53 بوساطة Mdm2 كمثال لتقديم طريقة لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان من خلايا الثدييات بالتفصيل. يمكن تحديد المنظمين الذين يؤثرون على حالة انتشار البروتينات المستهدفة في كل مكان باستخدام مقايسة الانتشار في الجسم الحي عندما يتم التعبير عنها بشكل مفرط أو هدمها / إخراجها في خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام البروتينات في كل مكان كركائز لمقايسة deubiquitination في المختبر. يمكن إجراء فحص عالي الإنتاجية لتحديد DUBs محددة للبروتينات المستهدفة عن طريق احتضان ركائز موجودة في كل مكان مع DUBs الفردية. قد تعمل البروتينات الموجودة في كل مكان كسقالة لتجنيد بروتينات الإشارات في الخلايا. يمكن تنقية مركب البروتين المستهدف في كل مكان عن طريق الترسيب المناعي المتسلسل في ظل ظروف التنقية الأصلية وتحديده بواسطة قياس الطيف الكتلي. يمكن استخدام البروتوكول الحالي على نطاق واسع للتحقيق في البروتينات الخلوية التي ينظمها الوجود في كل مكان.

تم إنشاء عدة طرق لتنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان ، والتي تشمل استخدام يوبيكويتين الموسومة بالتقارب ، والأجسام المضادة لليوبيكويتين ، والبروتينات المرتبطة باليوبيكويتين ، والمجالات المعزولة المرتبطة باليوبيكويتين (UBDs)¹⁷. هنا ، نقدم بروتوكولا باستخدام يوبيكويتين الموسوم بالتقارب كوسيط لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات. يوفر استخدام ubiquitin ذو العلامات المتعددة مزايا على الطرق الأخرى. يتم تنقية البروتينات في كل مكان في وجود مسخ قوي ، مما يقلل من الارتباط غير المحدد بالراتنج المشحون بالنيكل عن طريق خطي البروتينات الخلوية وتعطيل تفاعلات البروتين والبروتين. في المقابل ، فإن استخدام الأجسام المضادة لليوبيكويتين ، والبروتينات المرتبطة باليوبيكويتين ، و UBDs المعزولة كوسطاء لا يمكن أن يستبعد بشكل فعال شركاء الربط من البروتين المستهدف لأن التنقية تحتاج إلى إجراء في ظل ظروف أقل صرامة. علاوة على ذلك ، قد تؤدي التنقية أيضا إلى زيادة ارتباط البروتينات غير ذات الصلة باستخدام هذه الوسطاء. بالإضافة إلى ذلك ، هناك ميل ملزم لأنواع ربط ubiquitin المختلفة بالإضافة إلى أحادي ومتعدد الوجود بواسطة بروتينات ملزمة لليوبيكويتين أو UBDs^{المعزولة 17}. يساهم استخدام ubiquitin ذو العلامات المتعددة في سحب جميع البروتينات الخلوية في كل مكان. بدلا من ذلك ، فإن استخدام الأغاروز المقترن بالأجسام المضادة للعلم أو الأجسام المضادة لحمض الهيمونيك المتاح تجاريا يجعل من السهل ترسيب البروتينات المستهدفة واسعة النطاق التي تحمل علامة العلم أو HA في ظل ظروف غير مسخة. يمكن استخدام خطوة تنقية ثانية ، على سبيل المثال ، عن طريق راتنج مشحون بالنيكل يستهدف يوبيكويتين بولي هيس ، للحصول على بروتينات مستهدفة في كل مكان ذات نقاوة عالية للتجارب النهائية. والجدير بالذكر أنه يمكن تكييف استراتيجية تنقية علامات الخاتمة عندما لا يمكن الحصول على جسم مضاد معين لترسيب البروتينات المستهدفة بشكل فعال. أخيرا ، فإن تنقية البروتينات الموجودة في كل مكان في خلايا الثدييات ، مقارنة بالتنقية في المختبر ، تحتفظ بوضع ربط ubiquitin للبروتينات المستهدفة في ظل ظروف فسيولوجية أكثر.

Protocol

ملاحظة: تم توفير خلايا H1299 من قبل بنك الخلايا الجذعية ، الأكاديمية الصينية للعلوم وثبت أنها سلبية للتلوث الميكوبلازما.

1. ثقافة الخلية

1. بالنسبة للمزرعة الأولية ، ضع 1 × 10⁶ خلايا من خط خلايا الورم الغدي الرئوي البشري ، H1299 في طبق بتري 10 سم مع 10-12 مل من وسط RPMI 1640 مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 1٪ مضاف جلوتامين ، 1٪ بيروفات الصوديوم ، ومضادات حيوية (100 وحدة / مل بنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين). الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مع 5٪ CO₂. قم بتقسيم الخلايا كل 2-3 أيام اعتمادا على وقت وصولها إلى 80٪ -90٪ التقاء.
2. قبل يوم واحد من النقل ، قم بإعداد 6-9 × 10⁶ خلايا لثلاثة أطباق بتري وطبق 2-3 × 10⁶ خلايا في طبق بتري واحد 10 سم يحتوي على 10-12 مل من الوسط لتحقيق التقاء 70٪ -90٪ أثناء النقل.
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام خلايا HEK293T لتنقية البروتينات الموجودة في كل مكان نظرا لكفاءتها العالية في النقل ومستوى تعبير البروتين.

2. نقل البلازميد

1. أضف 1.5 مل من وسط المصل المختزل في ثلاثة أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل.
2. أضف الحمض النووي البلازميد الجاهز للنقل إلى كل أنبوب لعمل التخفيفات على النحو التالي. الأنبوب 1: 1 ميكروغرام من بلازميد Flag-p53 ، 12 ميكروغرام من المتجه الفارغ ؛ الأنبوب 2: 1 ميكروغرام من بلازميد Flag-p53 ، و 3 ميكروغرام من بلازميد His-HA-Ub (HH-Ub) ، و 9 ميكروغرام من المتجه الفارغ ؛ الأنبوب 3: 1 ميكروغرام من بلازميد Flag-p53 ، 3 ميكروغرام من بلازميد HH-Ub ، و 9 ميكروغرام من بلازميد Mdm2. أضف ما مجموعه 0.2 ميكروغرام من بلازميد البروتين الفلوري الأخضر (GFP) إلى كل أنبوب لمراقبة كفاءة النقل.
   ملاحظة: يجب إجراء تجربة تجريبية لتحديد الكميات المثلى من البلازميدات اللازمة لتحقيق تعبير البروتين المستهدف الفعال في الخلايا.
3. أضف 78 ميكرولتر من كاشف نقل الجسيمات الشحمية إلى 4.5 مل من وسط المصل المختزل في أنبوب طرد مركزي آخر لتخفيف الجسيمات الشحمية. امزج جيدا عن طريق تحريك الأنبوب واتركه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
4. أضف 1.5 mL من محلول الجسيمات الشحمية المخففة إلى كل أنبوب من الخطوة 2.2 التي تحتوي على 1.5 mL من محلول الحمض النووي المخفف. امزج جيدا واربط البلازميدات بالليبوزومات لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT. استخدم الحمض النووي البلازميدي: نسبة الجسيمات الشحمية 1: 2 (ميكروغرام: ميكرولتر) لكل عملية نقل.
5. تخلصي من الوسط الأصلي من أطباق بتري وأضيفي 9 مل من وسط المصل المختزل إلى كل طبق. أضف 3 مل من خليط الحمض النووي الشحمي إلى كل طبق واخلط المحلول عن طريق هز الطبق برفق ذهابا وإيابا 3x ، ثم اليسار واليمين 3x لتوزيع الخليط بالتساوي في الطبق.
6. زراعة الخلايا في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂. استبدل الوسط بعد 4-6 ساعات واستمر في زراعة الخلايا لمدة 24-36 ساعة.

3. جمع الخلايا

1. بعد 24-36 ساعة ، عالج الخلايا ب MG132 بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر لمدة 4-6 ساعات.
   ملاحظة: MG132 هو ألدهيد الببتيد الذي يمنع بكفاءة النشاط المحلل للبروتين لمركب البروتيازوم 26S. يمكن زيادة كميات البروتينات الموجودة في كل مكان مع سلاسل البولي يوبيكويتين المرتبطة بالليسين -48 (K48) بعد معالجة الخلايا ب MG132 أو مثبطات البروتيازوم الأخرى.
2. تخلص من الوسط ، واغسل الخلايا 2x (مع الحرص على عدم طرد الخلايا) بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS) ، واستنشاق الخلايا باستخدام ماصات مصلية.
3. أضف 1 مل من PBS إلى الطبق ، وقم بإزالة الخلايا عن طريق الكشط باستخدام مكشطة نظيفة ، ونقل تعليق الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. جهاز طرد مركزي بسرعة 700 × جم لمدة 5 دقائق لجمع كريات الخلايا.

4. تنقية البروتينات في كل مكان في ظل ظروف غير تغيير طبيعة

1. تحضير مخزن تحلل العلم (50 مللي مول Tris-HCl (درجة الحموضة 7.9) ، 137 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 10 مللي متر كلوريد الصوديوم ، 1 مللي مول حمض رباعي الخليك ثنائي الأمين الإيثيلين (EDTA) ، 1٪ Triton X-100 ، 0.2٪ ساركوسيل ، و 10٪ جلسرين) مكمل طازجا بكوكتيل مثبط للبروتياز قبل الاستخدام.
2. أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل العلم المثلج إلى الخلايا الموجودة في كل أنبوب ، وامزج الخلايا باستخدام مذبذب دوامة أو مسدس ماصة ، ثم احتضن الخليط على دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. تخضع الخليط إلى 5-10 نبضات قصيرة من الموجات فوق الصوتية. أداء الموجات فوق الصوتية على الجليد في تردد صوتنة من 20 كيلو هرتز و 80 ٪ السعة مع كل نبضة دائمة لمدة 1 ثانية. احتضان الخليط على دوار بسرعة 40 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. أجهزة الطرد المركزي للعينات بالموجات فوق الصوتية عند 8000 × جم لمدة 20-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. نقل الطافت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
5. حصة 80 ميكرولتر (1/10) من مستخلص الخلية وتخلط مع 20 ميكرولتر من 5x كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) تحميل المخزن المؤقت. تغلى العينات على حرارة 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتبرد على الثلج لمدة 2 دقيقة ، وتخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. استخدم هذه العينات كمجموعة إدخال لمراقبة تعبير البروتين.
6. أضف 30 ميكرولتر من حبات الأجسام المضادة M2 المترافقة (Flag / M2) المضادة للعلم إلى مستخلصات الخلايا المتبقية واحتضانها على دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل أو طوال الليل.
7. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية لجمع الخرز. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل العلم المثلج إلى الخرز واخلطه عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.
8. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية لجمع الخرز. كرر الخطوة 4.7 لمدة 4-6 مرات.
9. أضف 40 ميكرولتر من ببتيدات العلم بتركيز نهائي قدره 200 نانوغرام / ميكرولتر إلى الخرز واحتضانها على دوار عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة لتقشير البروتينات المرتبطة.
10. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل الطافت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
11. أضف 10 ميكرولتر من مخزن تحميل SDS 5x ، وغلي الخليط عند 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تبرد على الثلج لمدة 2 دقيقة ، وخزنه في -20 درجة مئوية للنشاف الغربي. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الشطف من الخطوة 4.10 مباشرة عند -80 درجة مئوية لتجارب المصب الأخرى.
    ملاحظة: يمكن زيادة كمية البروتينات المنقاة في كل مكان عن طريق زيادة عدد الخلايا وكميات البلازميدات المنقولة. يمكن تكييف استراتيجية وضع العلامات على epitope لتنقية المجمعات الخلوية التي ترتبط على وجه التحديد ب p53 في كل مكان في ظل ظروف التنقية الأصلية. من خلال التعبير المشترك عن Flag-p53 و mdm2 و HA-ubiquitin ، قد يتم ترسيب مركب بروتين p53 في كل مكان بواسطة الأغاروز المتتابع Flag و HA المترافق بالأجسام المضادة من خلايا الثدييات. للحفاظ على شركاء الربط لبروتينات p53 في كل مكان ، يجب استخدام محلول تحلل BC100 الأقل صرامة (20 mM Tris-HCl (pH 7.9) ، 100 mM NaCl ، 10٪ glycerol ، 0.2 mM EDTA ، 0.2٪ Triton X-100 ، و 1x مثبط الأنزيم البروتيني) أثناء عملية التنقية. يخضع الشطف من ببتيد HA لقياس الطيف الكتلي لتحديد جميع الشركاء الذين يرتبطون على وجه التحديد ب p53 في كل مكان.

5. تنقية البروتينات في كل مكان تحت ظروف تغيير طبيعة

1. أضف 1 مل من PBS المثلج إلى كريات الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.3 واخلطها بالتساوي. القسمة 100 ميكرولتر (حجم 1/10) من تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق كعينة إدخال.
2. جهاز طرد مركزي عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لجمع كريات الخلية. أضف 80 ميكرولتر من مخزن تحلل العلم إلى عينة الإدخال ، وامزج الخلايا باستخدام مذبذب دوامة أو مسدس ماصة ، وقم بتحليل الخلايا على الجليد لمدة 1 ساعة.
3. جهاز طرد مركزي عند 8000 × جم لمدة 20-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. حاصل 80 ميكرولتر من المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
4. أضف 20 ميكرولتر من مخزن تحميل SDS 5x إلى الطافي ، ثم غليه عند 98 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق ، ثم تبرد على الثلج لمدة دقيقتين ، واحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
5. جهاز طرد مركزي 900 ميكرولتر المتبقية من تعليق الخلية عند 700 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لجمع حبيبات الخلية. أضف 1 مل من المخزن المؤقت يوبيكويتين 1 (المخزن المؤقت UB 1 ؛ 6 M guanidine-HCI ، 0.1 M Na 2 HPO 4 ، 6.8 mM NaH 2 PO₄ ، 10 mM Tris-HCI (الرقم الهيدروجيني 8.0) ، و_0.2٪ Triton X-100 ، مكمل حديثا ب 10 mM β-mercaptoethanol و 5 mM imidazole) إلى كريات الخلية واخلطها عدة مرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل لتوزيع الخلايا بالتساوي.
   ملاحظة: قد يختلف تركيز إيميدازول من 5 مليمول إلى 20 مليمول لتقليل ارتباط البروتين غير النوعي بالراتنج المشحون بالنيكل. يحتوي المخزن المؤقت Ubiquitin على هيدروكلوريد جوانيدين ، الذي يعطل كل من الأربطة و DUBs. β-mercaptoethanol هو سائل واضح عديم اللون مع رائحة قوية غير سارة تشبه البيض الفاسد. سوف يتسبب المحلول عالي التركيز في أضرار جسيمة للغشاء المخاطي والجهاز التنفسي العلوي والجلد والعينين. ارتداء القفازات والنظارات الواقية والعمل في غطاء الدخان.
6. تخضع الخلية المحللة إلى 10-20 جولات من الموجات فوق الصوتية حتى الحل لم يعد لزجا. أداء الموجات فوق الصوتية على الجليد في تردد صوتنة من 20 كيلو هرتز و 80 ٪ السعة مع كل نبضة دائمة لمدة 1 ثانية. جهاز طرد مركزي بسرعة 8000 × جم لمدة 20-30 دقيقة في RT ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
7. أضف 30 ميكرولتر من الراتنج المشحون بالنيكل إلى المادة الطافية واحتضانها على دوار مضبوط على 15 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات أو طوال الليل في RT. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة في RT لجمع الخرز.
8. أضف 1 مل من المخزن المؤقت UB 1 ، واحتضان مع الدوران في شاكر لمدة 10 دقائق في RT ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة دقيقتين في RT لجمع الخرز.
9. أضف 1 مل من المخزن المؤقت ubiquitin 2 (المخزن المؤقت UB 2 ؛ 8 M اليوريا ، 0.1 M Na 2 HPO 4 ، 6.8 mM NaH 2 PO₄ ، 10 mM Tris-HCI (الرقم الهيدروجيني 8.0) ، و_0.2٪ Triton X-100) إلى الخرز ، واحتضان مع الدوران في شاكر لمدة 10 دقائق في RT ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة دقيقتين لجمع الخرز. كرر هذا مرة أخرى.
10. إلى الخرز ، أضف 1 مل من PBS ، واحتضن بالتناوب في شاكر لمدة 10 دقائق في RT ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة في RT لجمع الخرز. كرر هذا مرة أخرى.
11. قم بإذابة البروتينات المرتبطة عن طريق احتضان الخرز ب 40 ميكرولتر من الإيميدازول بتركيز نهائي قدره 0.5 M لمدة 1 ساعة عند RT. جهاز طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 2 دقيقة عند RT.
12. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف ، وأضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل 5x SDS ، ثم غليها عند 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تبرد على الثلج لمدة 2 دقيقة ، وخزنها في -20 درجة مئوية للنشاف الغربي. بدلا من ذلك ، قم بتخزين الشطف غير المعالج عند -80 درجة مئوية لتجارب المصب الأخرى.

6. الكشف عن البروتينات المنقاة في كل مكان عن طريق النشاف الغربي

1. حل العينات من الخطوتين 4.11 و 5.12 بواسطة كبريتات دوديسيل الصوديوم بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) ، ثم نقلها إلى غشاء النيتروسليلوز عن طريق النشاف الغربي للكشف عن البروتينات المستهدفة باستخدام الأجسام المضادة المقابلة كما هو موضح¹⁸.
2. باختصار ، احتضن الغشاء عن طريق غمر 20 مل من محلول الحجب الذي يحتوي على مسحوق حليب defat بنسبة 5٪ في محلول TBST (15 mM Tris-HCI ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.6 ، 4.6 mM Tris-base ، 150 mM NaCI ، مكمل حديثا بنسبة 0.1٪ Tween-20 قبل الاستخدام) في RT لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، احتضان الغشاء بالأجسام المضادة الأولية في RT لمدة 2 ساعة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. استخدم الأجسام المضادة التالية لكل مجموعة. تم استخدام جميع الأجسام المضادة الأولية بتخفيف 1: 1000.
   1. الكشف عن إجمالي بروتين p53 ، بما في ذلك p53 في كل مكان ، مع جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل p53 بعد الترسيب المناعي باستخدام حبات الأغاروز Flag / M2.
   2. الكشف عن بروتينات p53 في كل مكان مع الجسم المضاد لحمض الهيمونيك أو الجسم المضاد لليوبيكويتين بعد الترسيب المناعي باستخدام حبات الأغاروز Flag / M2.
   3. اكتشف بروتينات p53 المنتشرة في كل مكان باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل p53 بعد سحب الراتنج المشحون بالنيكل.
   4. اكتشف البروتين الكلي في كل مكان باستخدام جسم مضاد مضاد لحمض الهيالورونيك أو جسم مضاد لليوبيكويتين بعد سحب الراتنج المشحون بالنيكل.
3. احتضان الغشاء بأجسام مضادة ثانوية مترافقة من بيروكسيديز الفجل (HRP) في RT لمدة 1 ساعة بعد غسل 3x باستخدام محلول TBST لمدة 5 دقائق لكل منهما. تم استخدام جميع الأجسام المضادة الثانوية بتخفيف 1: 3000. بعد ذلك ، اغسل الغشاء باستخدام المخزن المؤقت TBST 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما بتحريض لطيف.
4. بدء نظام التصوير الكيميائي للكشف عن الإشارات من النشاف الغربي. تحضير محلول الركيزة ل HRP عن طريق خلط المحاليل A و B بنسبة 1: 1.
5. ضع غشاء النيتروسليلوز في الكاميرا الغامضة ووجهه لأعلى وقم بتغطية محلول الركيزة بالتساوي على الغشاء باستخدام مسدس ماص. حدد إجراء التعرض التلقائي لالتقاط إشارات الإضاءة الكيميائية وضبط وقت التعرض يدويا حتى يتم الحصول على إشارة مثالية.

النتائج

يوضح الرسم التخطيطي بروتينات يوبيكويتين (HH-Ub) ذات العلامات المزدوجة (HH-Ub) (الشكل 1 أ). يلخص الشكل 1 ب الإجراءات المستخدمة لتنقية البروتينات المنتشرة في كل مكان. يمكن ربط يوبيكويتين الموسومة بولي هيه لاستهداف البروتينات في خلايا الثدييات. يمكن تنقية البروتينا?...

Discussion

يلعب الوجود في كل مكان دورا مهما في جميع العمليات الخلوية الفسيولوجية والمرضية تقريبا². في السنوات الأخيرة ، تم إحراز تقدم كبير في فهم الدور الجزيئي لليوبيكويتين في مسارات الإشارات وكيف تؤدي التغييرات في نظام يوبيكويتين إلى أمراض بشرية مختلفة². تساهم تنقية البرو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-mercaptoethanol	Sangon Biotech	M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE healthcare	NA931	Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE healthcare	NA935	Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220	FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody	Santa cruz	sc-9996	Primary antibody
Anti-HA High Affinity	Roche	11867423001	Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)	Santa cruz	sc-965	Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)	Santa cruz	sc-126	Primary antibody
EDTA	Sigma-Alddich	E5134	solvent
Fetal Bovine Serum	VivaCell	C04001-500	FBS
FLAG Peptide	Sigma-Alddich	F3290	Prepare elution buffer
GlutaMAX	Gibco	35050-061	supplement
Guanidine-HCI	Sangon Biotech	A100287-0500	solvent
H1299	Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab	Bio-rad		software
Immidazole	Sangon Biotech	A500529-0100	solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents	Invitrogen	11668019	Transfection reagent
MG132	MedChemExpress	HY-13259	Proteasome inhibitor
Na2HPO4	Sangon Biotech	A501727-0500	solvent
NaCl	Sangon Biotech	A610476-0005	solvent
NaF	Sigma-Alddich	201154	solvent
NaH2PO4	Sangon Biotech	A501726-0500	solvent
Ni-NTA Agarose	QIAGEN	30230	nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane	GE healthcare	10600002	0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985-070	Transfection medium
PBS	Corning	21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution	Sangon Biotech	E607011-0100	antibiotic
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
RPMI 1640	Biological Industries	01-100-1ACS	medium
Sarkosyl	Sigma-Alddich	L5777	solvent
SDS Loading Buffer	Beyotime	P0015L
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	supplement
Tris-base	Sangon Biotech	A501492-0005	solvent
Tris-HCI	Sangon Biotech	A610103-0250	solvent
Triton X-100	Sangon Biotech	A110694-0500	reagent
Tween-20	Sangon Biotech	A100777-0500	supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System	Bio-rad		ChemiDoc XRS+
Urea	Sangon Biotech	A510907-0500	solvent