טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

Summary

הפרוטוקול מתאר שיטה שלב אחר שלב לטיהור חלבונים הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים באמצעות חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו מתאים בתנאים מחמירים של אי-דנטורציה ודנאטורציה.

Abstract

Ubiquitination הוא סוג של שינוי posttranslational המסדיר לא רק את היציבות אלא גם את לוקליזציה ותפקוד של חלבון המצע. תהליך ה-ubiquitination מתרחש באופן תוך-תאי באאוקריוטים ומווסת כמעט את כל התהליכים הביולוגיים הבסיסיים של התאים. טיהור של חלבונים ubiquitinated מסייע לחקור את התפקיד של ubiquitination בשליטה על תפקוד של חלבונים המצע. כאן, הליך שלב אחר שלב לטיהור חלבונים ubiquitinated בתאי יונקים מתואר עם חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו בתנאים מחמירים של אי-דנטורינג ודנאטורציה. סה"כ חלבון p53 המתויג כ-Flag טוהר באמצעות אגרוז מצומד נגד נוגדנים של פלאג בתנאים של אי-דנטורציה. לחלופין, סך כל החלבון התאי המתויג כיוביקוויטין טוהר באמצעות שרף טעון ניקל בתנאי דנטורציה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום באלואטים זוהו בהצלחה עם נוגדנים ספציפיים. באמצעות הליך זה, ניתן לטהר ביעילות את הצורות הנמצאות בכל מקום של חלבון נתון מתאי יונקים, ובכך להקל על מחקרים על התפקידים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד החלבון.

Introduction

אוביקוויטין הוא חלבון משומר אבולוציונית של 76 חומצות אמינו ^1,2,3. אוביקוויטין קושר באופן קוולנטי שאריות ליזין על חלבוני מטרה באמצעות מפלים המערבים אנזימים מפעילים (E1), מצומדים (E2) וליגאז (E3). יוביקוויטין מופעל תחילה על ידי האנזים E1 ולאחר מכן מועבר לאנזימים המצומדים E2. לאחר מכן, ליגאזות יוביקוויטין E3 מתקשרות הן עם אנזימי E2 טעונים ביוביקוויטין והן עם חלבוני סובסטרט ומתווכות את היווצרותו של קשר איזופפטידי בין מסוף C של יוביקוויטין לבין שאריות ליזין במצע 1,2,3,4,5. יוביקוויטינציה כרוכה בחיבור של יוביקוויטין מואטי לשאריות ליזין על חלבוני המצע או לעצמה, מה שמוביל למונוביקוויטינציה של חלבונים או לפוליוביקוויטינציה. תהליך זה של ubiquitination מתרחש באופן תוך-תאי באאוקריוטים ומסדיר מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. יוביקוויטינציה גורמת לפירוק חלבוני הסובסטרט באמצעות מערכת יוביקוויטין-פרוטאזומים 1,2,3,4,5. בנוסף, יוביקוויטינציה מווסתת לוקליזציה של חלבונים תת-תאיים, היווצרות קומפלקס חלבונים וסחר בחלבונים בתאים ^3,5. ניתן להסיר יוביקוויטין מואטי הקשור לחלבוני סובסטרט על ידי דה-אוביקוויטין אנזימים (DUBs)^6,7. יש לציין כי הדרכים השונות שבהן שרשראות יוביקוויטין מורכבות מספקות מספר עצום של אמצעים לוויסות תהליכים ביולוגיים שונים ^1,5. התפקידים המדויקים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד חלבון המצע עדיין אינם מובנים במלואם עד כה. הטיהור של חלבונים ubiquitinated תורם להבהרת ההשפעות של חלבון ubiquitination על מגוון רחב של תהליכים תאיים.

החלבון p53 הוא אחד החלבונים מדכאי הגידול החשובים ביותר והוא מציג מוטציות גנטיות או השבתה כמעט בכל סוגי הסרטן האנושיים 8,9,10,11^. היציבות והפעילות של P53 מווסתות בעדינות in vivo על-ידי שינויים פוסט-טרנסלציוניים, כולל יוביקוויטינציה, זרחון, אצטילציה ומתילציה^12,13. לחלבון p53 יש זמן מחצית חיים קצר הנע בין 6 דקות ל-40 דקות בתאים שונים, מה שנובע בעיקר מהפוליוביקוויטינציה שלו ומפירוק פרוטאזומלי^10,12 לאחר מכן. עכבר כפול דקה 2 (Mdm2) הוא ליגאז יוביקוויטין E3 של p53 הנקשר ל-N-terminus של p53 כדי לעכב את פעילות השעתוק שלו^12,14,15. Mdm2 מקדם את הפוליוביקוויטינציה והפירוק הפרוטיאזומלי של p53 כדי לשלוט ביציבותו וגורם למונוביקוויטינציה של p53 כדי להקל על ייצוא הגרעין שלה^12,14,15,16. כאן, יוביקוויטינציה p53 בתיווך Mdm2 משמשת כדוגמה להצגת שיטה לטיהור חלבונים יוביקוויטין מתאי יונקים בפירוט. ניתן לזהות את הרגולטורים המשפיעים על מצב האוביקוויטינציה של חלבוני המטרה באמצעות בדיקת יוביקוויטינציה in vivo זו כאשר הם מתבטאים יתר על המידה או מופלים/נדפקים בתאי יונקים. בנוסף, חלבונים המכילים יוביקוויטין יכולים לשמש כמצעים לבדיקת דאוביקוויטינציה במבחנה. ניתן לבצע בדיקת תפוקה גבוהה כדי לזהות DUBs ספציפיים עבור חלבוני מטרה על ידי דגירה של מצעים ubiquitinated עם DUBs בודדים. חלבונים הנמצאים בכל מקום עשויים לשמש כפיגום לגיוס חלבוני איתות במורד הזרם בתאים. קומפלקס חלבוני מטרה הנמצאים בכל מקום יכול להיות מטוהר על ידי מיצוי חיסוני רציף בתנאי טיהור מקומיים ולזהות על ידי ספקטרומטריית מסה. ניתן להשתמש בפרוטוקול הנוכחי באופן נרחב כדי לחקור את החלבונים התאיים המווסתים על ידי יוביקוויטינציה.

מספר שיטות הוקמו כדי לטהר חלבונים ubiquitinated, הכוללות שימוש ביוביקוויטין המתויג על ידי זיקה, נוגדני יוביקוויטין, חלבונים קושרי יוביקוויטין, ותחומים מבודדים הקושרים יוביקוויטין (UBDs)¹⁷. כאן, אנו מספקים פרוטוקול המשתמש ביוביקוויטין המתויג כמתווך לטיהור חלבונים הנמצאים בתאים של יונקים. השימוש ביוביקוויטין המתויג של פולי-היס מציע יתרונות על פני השיטות האחרות. חלבונים הנמצאים בכל מקום מטוהרים בנוכחות דנטורנטים חזקים, מה שמפחית קשירה לא ספציפית לשרף טעון ניקל על ידי ליניאריזציה של חלבונים תאיים ושיבוש אינטראקציות חלבון-חלבון. לעומת זאת, השימוש בנוגדנים ליוביקוויטין, חלבונים קושרי יוביקוויטין ו-UBDs מבודדים כמתווכים אינו יכול להוציא ביעילות שותפים קושרים מחלבון המטרה מכיוון שיש לבצע טיהור בתנאים פחות מחמירים. יתר על כן, טיהור עשוי גם להוביל לקשירה מוגברת של חלבונים שאינם קשורים באמצעות מתווכים אלה. בנוסף, קיימת נטייה מחייבת לסוגי קישור שונים של יוביקוויטין, כמו גם מונו ופולי-יוביקוויטינציה על ידי חלבונים קושרי יוביקוויטין או UBDs¹⁷ מבודדים. השימוש באוביקוויטין המתויג על-ידי פולי-היס תורם להורדת כל החלבונים הנמצאים בכל התאים הנמצאים בכל מקום. לחלופין, השימוש באגרוז מצומד נגד פלאג או אנטי-HA זמין מסחרית ומקל על חיסונית חלבוני מטרה מתויגים של דגל או HA בקנה מידה גדול בתנאים שאינם מתויגים. שלב טיהור שני, לדוגמה, על ידי שרף טעון ניקל המכוון ליוביקוויטין מתויג פולי-היס, יכול לשמש לרכישת חלבוני מטרה ubiquitinated עם טוהר גבוה לניסויים במורד הזרם. יש לציין כי אסטרטגיית טיהור תיוג אפיטופים יכולה להיות מותאמת כאשר לא ניתן לרכוש נוגדן מסוים לחלבוני מטרה חיסוניים יעילים. לבסוף, טיהור של חלבונים ubiquitinated בתאי יונקים, בהשוואה לטיהור במבחנה, שומר על מצב הקישור של יוביקוויטין של חלבוני מטרה בתנאים פיזיולוגיים יותר.

Protocol

הערה: תאי H1299 סופקו בחביבות על ידי בנק תאי הגזע, האקדמיה הסינית למדעים והוכחו כשליליים לזיהום מיקופלסמה.

1. תרבית תאים

1. עבור התרבית הראשונית, יש למקם 1 x 10⁶ תאים של קו תאי אדנוקרצינומה בריאה אנושית, H1299 בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ עם 10-12 מ"ל של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), תוסף גלוטמין 1%, 1% נתרן פירובט ואנטיביוטיקה (100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין). שמור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% CO₂. פצלו את התאים כל 2-3 ימים, תלוי מתי הם מגיעים למפגש של 80%-90%.
2. יום אחד לפני ההעברה, הכינו 6-9 x 10 6 תאים לשלוש צלחות פטרי וצלחת 2-3 x 10^{6 תאים} בצלחת פטרי אחת בגודל 10 ס"מ המכילה 10-12 מ"ל בינוני כדי להשיג מפגש של 70%-90% במהלך ההעברה.
   הערה: תאי HEK293T יכולים לשמש גם לטיהור חלבונים המכילים יוביקוויטין בשל יעילות ההעברה הגבוהה שלהם ורמת ביטוי החלבון.

2. טרנספקציה פלסמידית

1. הוסף 1.5 מ"ל של מדיום סרום מופחת בשלושה צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל.
2. הוסיפו דנ"א פלסמיד מוכן להעברה לכל צינור כדי לבצע דילולים באופן הבא. צינור 1: 1 מיקרוגרם של פלסמיד דגל-p53, 12 מיקרוגרם של וקטור ריק; צינור 2: 1 מיקרוגרם של פלסמיד פלאג-p53, 3 מיקרוגרם של פלסמיד His-HA-Ub (HH-Ub), ו-9 מיקרוגרם של וקטור ריק; צינור 3: 1 מיקרוגרם של פלסמיד פלאג-p53, 3 מיקרוגרם של פלסמיד HH-Ub, ו-9 מיקרוגרם של פלסמיד Mdm2. הוסף סך של 0.2 מיקרוגרם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) פלסמיד לכל צינור כדי לפקח על יעילות הטרנספקציה.
   הערה: יש לבצע ניסוי פיילוט כדי לקבוע את הכמויות האופטימליות של פלסמידים הדרושים להשגת ביטוי יעיל של חלבון מטרה בתאים.
3. הוסף 78 μL של ריאגנט טרנספקציה ליפוזום ל-4.5 מ"ל של מדיום סרום מופחת בצינור צנטריפוגה אחר כדי לדלל ליפוזומים. מערבבים היטב על ידי הבהוב הצינור ומאפשרים לעמוד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
4. הוסף 1.5 מ"ל של תמיסת הליפוזום המדוללת לכל צינור משלב 2.2 המכיל 1.5 מ"ל של תמיסת ה- DNA המדוללת. ערבבו היטב וצלבו את הפלסמידים עם הליפוזומים למשך 20 דקות לפחות ב-RT. השתמשו בדנ"א פלסמיד: יחס ליפוזום של 1:2 (מיקרוגרם:μL) עבור כל טרנספקציה.
5. השליכו את המדיום המקורי מצלחות הפטרי והוסיפו 9 מ"ל של מדיום סרום מופחת לכל מנה. מוסיפים 3 מ"ל מתערובת הליפוזום-DNA לכל מנה ומערבבים את התמיסה על ידי ניעור עדין של הצלחת קדימה ואחורה פי 3, ואז שמאלה וימינה פי 3 לפיזור שווה של התערובת בצלחת.
6. תרבית את התאים באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂. מחליפים את המדיום לאחר 4-6 שעות וממשיכים לתרבת את התאים במשך 24-36 שעות.

3. איסוף תאים

1. לאחר 24-36 שעות, לטפל בתאים עם MG132 בריכוז סופי של 10 μM במשך 4-6 שעות.
   הערה: MG132 הוא אלדהיד פפטידי החוסם ביעילות את הפעילות הפרוטאוליטית של קומפלקס פרוטאזום 26S. ניתן להגדיל את כמויות החלבונים המכילים שרשראות פוליוביקוויטין המקושרות לליזין-48 (K48) לאחר טיפול בתאים ב-MG132 או במעכבי פרוטאזומים אחרים.
2. יש להשליך את המדיום, לשטוף את התאים פי 2 (תוך הקפדה שלא לשטוף את התאים) בתמיסת מלח זרחתית קרה כקרח (PBS), ולשאוף את התאים עם פיפטים סרולוגיים.
3. הוסף 1 מ"ל של PBS לצלחת, להסיר את התאים על ידי גירוד עם מגרד נקי, ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינורות microcentrifuge. צנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 5 דקות כדי לאסוף כדורי תא.

4. טיהור של חלבונים ubiquitinated בתנאים nondenaturing

1. יש להכין את חיץ התסיסה של פלאג (50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM אתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA), 1% טריטון X-100, 0.2% סרקוזי ו-10% גליצרול) בתוספת טרייה של קוקטייל מעכב פרוטאז לפני השימוש.
2. הוסיפו 800 μL של חיץ Flag lysis קר כקרח לתאים בכל צינור, ערבבו את התאים באמצעות מתנד מערבולת או אקדח פיפטה, ולאחר מכן דגרו את התערובת על סיבוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
3. נושא התערובת ל 5-10 פולסים קצרים של אולטרה סאונד. בצע את האולטרה-סאונד על הקרח בתדר סוניקציה של 20 קילו-הרץ ומשרעת של 80% כאשר כל פעימה נמשכת שנייה אחת. דגירה של התערובת על מסובב ב-40 סיבובים לדקה (סל"ד) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
4. צנטריפוגה דגימות אולטרה סאונד ב 8,000 x גרם במשך 20-30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
5. Aliquot 80 μL (1/10) של תמצית התא ולערבב עם 20 μL של 5x נתרן דודציל סולפט (SDS) טעינה חיץ. מרתיחים את הדגימות בטמפרטורה של 98°C למשך 5 דקות, מצננים על קרח למשך 2 דקות ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. השתמש בדגימות אלה כקבוצת הקלט כדי לנטר את ביטוי החלבון.
6. יש להוסיף 30 μL של חרוזי נוגדנים מצומדים נגד דגל M2 (Flag/M2) לתמציות התאים הנותרות ולדגור על סיבוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לפחות או למשך הלילה.
7. צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את החרוזים. הוסיפו 1 מ"ל של חיץ ליסיס פלאג קר כקרח לחרוזים וערבבו על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.
8. צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 2 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את החרוזים. חזור על שלב 4.7 במשך 4-6 פעמים.
9. הוסיפו 40 μL של פפטידי דגל בריכוז סופי של 200 ng/μL לחרוזים ודגרו על סיבוב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לחמוק מהחלבונים הקשורים.
10. צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
11. מוסיפים 10 μL של מאגר טעינה 5x SDS, מרתיחים את התערובת בטמפרטורה של 98°C למשך 5 דקות, מצננים על קרח למשך 2 דקות ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C להכתמה מערבית. לחלופין, אחסנו את ה-eluate משלב 4.10 ישירות בטמפרטורה של -80°C לניסויים אחרים במורד הזרם.
    הערה: ניתן להגדיל את כמות החלבונים המטוהרים המכילים יוביקוויטין על-ידי הגדלת מספר התאים וכמויות הפלסמידים שעברו טרנספקציה. ניתן להתאים אסטרטגיית תיוג אפיטופים כדי לטהר קומפלקסים תאיים הנקשרים במיוחד ל-p53 המצוי בכל מקום בתנאי טיהור מקומיים. על-ידי ביטוי משותף של Flag-p53, mdm2 ו-HA-ubiquitin, קומפלקס החלבונים p53 המצוי בכל מקום עשוי להיות משוקע על ידי אגרוז מצומד של דגל רציף ונוגדנים HA מתאי יונקים. כדי לשמור על שותפים קושרים של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום, יש להשתמש במאגר התזה BC100 המחמיר פחות (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10% גליצרול, 0.2 mM EDTA, 0.2% Triton X-100 ומעכב פרוטאז 1x) במהלך תהליך הטיהור. הפלט מפפטיד HA נתון לספקטרומטריית מסות כדי לזהות את כל השותפים הנקשרים באופן ספציפי ל-p53 המצוי בכל מקום.

5. טיהור של חלבונים ubiquitinated בתנאים denaturing

1. הוסיפו 1 מ"ל של PBS קר כקרח לכדורי התא שהתקבלו בשלב 3.3 וערבבו באופן שווה. Aliquot 100 μL (נפח 1/10) של מתלה התא לתוך צינור microcentrifuge כמו דגימת קלט.
2. צנטריפוגה ב 700 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את כדורי התא. הוסף 80 μL של מאגר Flag lysis לדגימת הקלט, ערבב את התאים באמצעות מתנד מערבולת או אקדח פיפטה, ותלה את התאים על הקרח במשך שעה אחת.
3. צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 20-30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. Aliquot 80 μL של supernatant לתוך צינור microcentrifuge חדש.
4. יש להוסיף 20 μL של מאגר טעינה 5x SDS לסופרנטנט, להרתיח בטמפרטורה של 98°C למשך 5-10 דקות, לקרר על קרח למשך 2 דקות ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
5. צנטריפוגה את 900 μL הנותרים של מתלה התא ב 700 x g במשך 5 דקות ב 4 °C כדי לאסוף את גלולת התא. הוסף 1 מ"ל של מאגר יוביקוויטין 1 (מאגר UB 1; 6 M guanidine-HCI, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO₄, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0), ו-0.2% Triton X-100, בתוספת טרייה של 10 mM β-מרקפטואתנול ו-5 mM imidazole) לכדורי התא וערבב מספר פעמים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כדי לפזר את התאים באופן שווה.
   הערה: ריכוז האימידזול עשוי להשתנות בין 5 mM ל-20 mM כדי להפחית את קשירת החלבון הלא ספציפי על השרף הטעון ניקל. חיץ יוביקוויטין מכיל גואנידין הידרוכלוריד, אשר משבית הן ליגאזות והן DUBs. β-מרקפטואתנול הוא נוזל צלול וחסר צבע עם ריח חזק ולא נעים הדומה לביצים רקובות. תמיסה בריכוז גבוה תגרום נזק חמור לקרום הרירי, לדרכי הנשימה העליונות, לעור ולעיניים. יש ללבוש כפפות ומשקפי מגן ולפעול במכסה המנוע.
6. נושא התא lysates ל 10-20 סיבובים של אולטרה סאונד עד הפתרון הוא כבר לא צמיג. בצע את האולטרה-סאונד על הקרח בתדר סוניקציה של 20 קילו-הרץ ומשרעת של 80% כאשר כל פעימה נמשכת שנייה אחת. צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 20-30 דקות ב RT ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש.
7. הוסיפו 30 μL של שרף טעון ניקל לסופרנטנט ודגרו על מסובב שנקבע ב-15 סל"ד למשך 4 שעות או לילה ב-RT. צנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 2 דקות ב-RT כדי לאסוף את החרוזים.
8. הוסיפו 1 מ"ל של מאגר UB 1, דגרו עם סיבוב בשייקר למשך 10 דקות ב-RT, וצנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 2 דקות ב-RT כדי לאסוף את החרוזים.
9. הוסיפו 1 מ"ל של מאגר יוביקוויטין 2 (מאגר UB 2; 8 M אוריאה, 0.1 M Na 2 HPO 4, 6.8 mM NaH 2 PO₄, 10 mM Tris-HCI (pH 8.0) ו-0.2% Triton X-100) לחרוזים, דגרו עם סיבוב בשייקר למשך 10 דקות ב-RT, וצנטריפוגה ב-1,500 x g למשך₂דקות כדי לאסוף את החרוזים. חזור על כך פעם נוספת.
10. לחרוזים, הוסיפו 1 מ"ל של PBS, דגרו עם סיבוב בשייקר במשך 10 דקות ב-RT, וצנטריפוגה ב-1,500 x גרם למשך 2 דקות ב-RT כדי לאסוף את החרוזים. חזור על כך פעם נוספת.
11. חלבונים הקשורים לאלוטה על ידי דגירה של החרוזים עם 40 μL של אימידזול בריכוז סופי של 0.5 M למשך שעה אחת ב-RT. צנטריפוגה בגודל 1,500 x g למשך 2 דקות ב-RT.
12. מעבירים את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי, מוסיפים 10 μL של מאגר טעינה 5x SDS, מרתיחים ב-98°C למשך 5 דקות, מצננים על קרח למשך 2 דקות ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C להכתמה מערבית. לחלופין, אחסנו את ה-eluate הלא מעובד בטמפרטורה של -80°C לניסויים אחרים במורד הזרם.

6. זיהוי של חלבונים מטוהרים בכל מקום על ידי כתם מערבי

1. פתור את הדגימות משלבים 4.11 ו- 5.12 על ידי נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE), ולאחר מכן העבר אותן לממברנה ניטרוצלולוז על ידי כתם מערבי כדי לזהות חלבוני מטרה באמצעות הנוגדנים המתאימים כמתואר¹⁸.
2. בקצרה, דגירה על הממברנה על ידי טבילה ב-20 מ"ל של תמיסה חוסמת המכילה אבקת חלב 5% דפט בחיץ TBST (15 mM Tris-HCI; pH = 7.6, 4.6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, תוספת טרייה עם 0.1% Tween-20 לפני השימוש) ב-RT למשך שעה אחת. לאחר מכן, לדגור את הממברנה עם נוגדנים ראשוניים ב RT במשך 2 שעות או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש בנוגדנים הבאים עבור כל קבוצה. כל הנוגדנים הראשוניים שימשו בדילול של 1:1000.
   1. זהה חלבון p53 כולל, כולל p53 ubiquitinated, עם נוגדן חד-שבטי נגד p53 לאחר מיצוי חיסוני עם חרוזי אגרוז Flag/M2.
   2. זהה חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום עם נוגדן נגד HA או נוגדן נגד יוביקוויטין לאחר מיצוי חיסוני עם חרוזי אגרוז Flag/M2.
   3. זהה חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום עם נוגדן חד-שבטי אנטי-p53 לאחר משיכת שרף טעון ניקל.
   4. זהה את סך כל החלבון המצוי בכל מקום עם נוגדן אנטי-HA או נוגדן נגד יוביקוויטין לאחר משיכת שרף טעון ניקל.
3. לדגום את הממברנה עם נוגדנים משניים מצומדים של חזרת פרוקסידאז (HRP) ב-RT למשך שעה אחת לאחר שטיפה 3x עם חיץ TBST במשך 5 דקות כל אחד. כל הנוגדנים המשניים שימשו בדילול של 1:3000. לאחר מכן, לשטוף את הממברנה עם חיץ TBST 3x במשך 5 דקות כל אחד עם תסיסה עדינה.
4. הפעל את מערכת ההדמיה chemiluminescence כדי לזהות אותות מכתם מערבי. הכן את פתרון המצע עבור תוכנית המענה ההומניטרי על-ידי ערבוב פתרונות A ו- B ביחס של 1:1.
5. מניחים את קרום הניטרוצלולוז בקמרה אובסקורה עם הפנים כלפי מעלה ומצפים את תמיסת המצע באופן שווה על הממברנה באמצעות אקדח פיפטינג. בחר את הליך החשיפה האוטומטי כדי ללכוד אותות כימילומינסנטיים וכוונן ידנית את זמן החשיפה עד להשגת אות אידיאלי.

תוצאות

הדיאגרמה הסכמטית מציגה את חלבוני האוביקוויטין המתויגים בדגל (HH-Ub) (איור 1A). ההליכים המשמשים לטיהור חלבונים הנמצאים בכל מקום מסוכמים באיור 1B. ניתן לקשור יוביקוויטין מתויג של Poly-His לחלבונים ממוקדים בתאי יונקים. חלבונים הנמצאים בכל מקום יכולים להיות מטוהרים בא...

Discussion

יוביקוויטינציה ממלאת תפקיד קריטי כמעט בכל התהליכים התאיים הפיזיולוגיים והפתולוגיים². בשנים האחרונות חלה התקדמות רבה בהבנת התפקיד המולקולרי של יוביקוויטין במסלולי איתות וכיצד שינויים במערכת האוביקוויטין מובילים למחלות אנושיות שונות². הטיהור של חלבונים המכילי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-mercaptoethanol	Sangon Biotech	M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE healthcare	NA931	Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE healthcare	NA935	Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220	FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody	Santa cruz	sc-9996	Primary antibody
Anti-HA High Affinity	Roche	11867423001	Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)	Santa cruz	sc-965	Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)	Santa cruz	sc-126	Primary antibody
EDTA	Sigma-Alddich	E5134	solvent
Fetal Bovine Serum	VivaCell	C04001-500	FBS
FLAG Peptide	Sigma-Alddich	F3290	Prepare elution buffer
GlutaMAX	Gibco	35050-061	supplement
Guanidine-HCI	Sangon Biotech	A100287-0500	solvent
H1299	Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab	Bio-rad		software
Immidazole	Sangon Biotech	A500529-0100	solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents	Invitrogen	11668019	Transfection reagent
MG132	MedChemExpress	HY-13259	Proteasome inhibitor
Na2HPO4	Sangon Biotech	A501727-0500	solvent
NaCl	Sangon Biotech	A610476-0005	solvent
NaF	Sigma-Alddich	201154	solvent
NaH2PO4	Sangon Biotech	A501726-0500	solvent
Ni-NTA Agarose	QIAGEN	30230	nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane	GE healthcare	10600002	0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985-070	Transfection medium
PBS	Corning	21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution	Sangon Biotech	E607011-0100	antibiotic
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
RPMI 1640	Biological Industries	01-100-1ACS	medium
Sarkosyl	Sigma-Alddich	L5777	solvent
SDS Loading Buffer	Beyotime	P0015L
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	supplement
Tris-base	Sangon Biotech	A501492-0005	solvent
Tris-HCI	Sangon Biotech	A610103-0250	solvent
Triton X-100	Sangon Biotech	A110694-0500	reagent
Tween-20	Sangon Biotech	A100777-0500	supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System	Bio-rad		ChemiDoc XRS+
Urea	Sangon Biotech	A510907-0500	solvent