Очистка убиквитинированных белков p53 из клеток млекопитающих

Резюме

Протокол описывает пошаговый метод очистки убиквитинированных белков из клеток млекопитающих с использованием белка-супрессора опухоли p53 в качестве примера. Убиквитинированные белки р53 были очищены из клеток в строгих условиях неденатурации и денатурации.

Аннотация

Убиквитинация — это тип посттрансляционной модификации, которая регулирует не только стабильность, но и локализацию и функцию субстратного белка. Процесс убиквитинирования происходит внутриклеточным образом у эукариот и регулирует практически все основные клеточные биологические процессы. Очистка убиквитинированных белков помогает исследовать роль убиквитинирования в контроле функции субстратных белков. Здесь описана пошаговая процедура очистки убиквитинированных белков в клетках млекопитающих с помощью белка-супрессора опухоли p53 в качестве примера. Убиквитинированные белки р53 очищали в строгих условиях неденатурации и денатурации. Общий клеточный белок p53, помеченный флагом, очищали антифланг-конъюгированной агарозой в неденатурирующих условиях. Альтернативно, общий клеточный убиквитинированный белок, помеченный His, очищали с использованием никелевой смолы в условиях денатурации. Убиквитинированные белки р53 в элюатах были успешно обнаружены со специфическими антителами. Используя эту процедуру, убиквитинированные формы данного белка могут быть эффективно очищены от клеток млекопитающих, что облегчает исследования роли убиквитинирования в регулировании функции белка.

Введение

Убиквитин представляет собой эволюционно сохраненный белок из 76 аминокислот ^1,2,3. Убиквитин ковалентно связывает остатки лизина с белками-мишенями через каскады, включающие активирующие (E1), конъюгирующие (E2) и лигазные (E3) ферменты. Убиквитин сначала активируется ферментом E1, а затем переносится на конъюгирующие ферменты E2. Впоследствии лигазы убиквитина Е3 взаимодействуют как с убиквитин-нагруженными ферментами Е2, так и с белками субстрата и опосредуют образование изопептидной связи между С-терминалом убиквитина и остатком лизина в субстрате 1,2,3,4,5. Убиквитинирование включает в себя присоединение фрагментов убиквитина к остаткам лизина на белках субстрата или к самому себе, что приводит к моноубиквитинированию белка или полиубиквитинированию. Этот процесс убиквитинирования происходит внутриклеточным образом у эукариот и регулирует большое разнообразие биологических процессов. Убиквитинирование приводит к деградации белков субстрата через убиквитин-протеасомную систему 1,2,3,4,5. Кроме того, убиквитинирование модулирует субклеточную локализацию белка, образование белкового комплекса и незаконный оборот белка в клетках ^3,5. Фрагменты убиквитина, лигированные белкам субстрата, могут быть удалены деубиквитинирующими ферментами (DUBs)^6,7. Примечательно, что различные способы, которыми собраны цепи убиквитина, обеспечивают множество средств для регулирования различных биологических процессов ^1,5. Точные роли убиквитинирования в регуляции функции субстратного белка до сих пор остаются не полностью изученными. Очистка убиквитинированных белков способствует выяснению влияния убиквитинирования белка на различные клеточные процессы.

Белок p53 является одним из наиболее важных белков-супрессоров опухолей и проявляет генетические мутации или инактивацию почти во всех раковых заболеваниях человека 8,9,10,11. Стабильность и активность p53 деликатно регулируются in vivo посттрансляционными модификациями, включая убиквитинирование, фосфорилирование, ацетилирование и метилирование^12,13. Белок p53 имеет короткий период полувыведения от 6 мин до 40 мин в различных клетках, что является результатом в основном его полиубиквитинирования и последующей протеасомальной деградации^10,12. Мышиная двойная минута 2 (Mdm2) представляет собой E3-убиквитин-лигазу p53, которая связывается с N-концом p53 для ингибирования его транскрипционной активности 12,14,15. Mdm2 способствует полиубиквитинированию и протеасомальной деградации р53 для контроля его стабильности и индуцирует моноубиквитинацию р53 для облегчения его ядерного экспорта 12,14,15,16. Здесь Mdm2-опосредованная p53 убиквитинация используется в качестве примера для введения способа очистки убиквитинированных белков из клеток млекопитающих в деталях. Регуляторы, которые влияют на статус убиквитинации белков-мишеней, могут быть идентифицированы с помощью этого анализа убиквитинирования in vivo, когда они чрезмерно экспрессируются или сбиваются / выбиваются в клетках млекопитающих. Кроме того, убиквитинированные белки могут быть использованы в качестве субстратов для анализа деубиквитинации in vitro. Высокопроизводительный скрининг может быть выполнен для идентификации конкретных DUB для целевых белков путем инкубации убиквитинированных субстратов с отдельными DUB. Убиквитинированные белки могут действовать как каркас для набора нисходящих сигнальных белков в клетках. Убиквитинированный целевой белковый комплекс может быть очищен последовательным иммунопреципитацией в условиях нативной очистки и идентифицирован масс-спектрометрией. Текущий протокол может быть широко использован для исследования клеточных белков, регулируемых убиквитинацией.

Было установлено несколько методов очистки убиквитинированных белков, которые включают использование аффинно-меченого убиквитина, антител убиквитина, убиквитин-связывающих белков и изолированных убиквитин-связывающих доменов (UBD)¹⁷. Здесь мы предоставляем протокол, использующий убиквитин с аффинными метками в качестве медиатора для очистки убиквитинированных белков в клетках млекопитающих. Использование поли-Гис-меченого убиквитина дает преимущества по сравнению с другими методами. Убиквитинированные белки очищаются в присутствии сильных денатурантов, что снижает неспецифическое связывание с никелевой смолой путем линеаризации клеточных белков и нарушения белково-белковых взаимодействий. Напротив, использование убиквитиновых антител, убиквитин-связывающих белков и изолированных UBD в качестве медиаторов не может эффективно исключать связывающих партнеров из целевого белка, потому что очистка должна выполняться в менее строгих условиях. Кроме того, очистка может также привести к усилению связывания несвязанных белков с использованием этих медиаторов. Кроме того, существует склонность к связыванию для различных типов связей убиквитина, а также моно- и полиубиквитинирования убиквитин-связывающими белками или изолированными UBDs¹⁷. Использование поли-Гис-меченого убиквитина способствует снижению всех клеточных убиквитинированных белков. Альтернативно, использование коммерчески доступной анти-Флаг или анти-ГК антитело-конъюгированной агарозы облегчает иммунопреципитацию крупномасштабных флаг- или ГК-меченых целевых белков в неденатурирующих условиях. Вторая стадия очистки, например, никелевой смолой, нацеленной на поли-Гис-меченый убиквитин, может быть использована для получения убиквитинированных целевых белков с высокой чистотой для последующих экспериментов. Примечательно, что стратегия очистки эпитопных меток может быть адаптирована, когда специфическое антитело не может быть приобретено для эффективного иммунопреципитации белков-мишеней. Наконец, очистка убиквитинированных белков в клетках млекопитающих, по сравнению с очисткой in vitro, сохраняет режим убиквитиновой связи белков-мишеней в более физиологических условиях.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки H1299 были любезно предоставлены Банком стволовых клеток Китайской академии наук и оказались отрицательными для загрязнения микоплазмой.

1. Клеточная культура

1. Для первоначальной культуры поместите 1 х 10⁶ клеток клеточной линии аденокарциномы легких человека, H1299 в чашку Петри 10 см с 10-12 мл среды RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1% добавкой глутамина, 1% пируватом натрия и антибиотиками (100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина). Поддерживайте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂. Расщепляйте клетки каждые 2-3 дня в зависимости от того, когда они достигают 80-90% конфлюзии.
2. За сутки до трансфекции подготовьте 6-9 х 10⁶ клеток для трех чашек Петри и пластину 2-3 х 10⁶ клеток в одной чашке Петри размером 10 см, содержащей 10-12 мл среды, для достижения конфьюляции 70%-90% при трансфекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HEK293T также могут быть использованы для очистки убиквитинированных белков из-за их высокой эффективности трансфекции и уровня экспрессии белка.

2. Плазмидная трансфекция

1. Добавьте 1,5 мл восстановленной сывороточной среды в три 15 мл центрифужных пробирок.
2. Добавьте плазмидную ДНК, готовую к трансфекции, в каждую трубку, чтобы сделать разбавления следующим образом. Трубка 1: 1 мкг плазмиды Flag-p53, 12 мкг пустого вектора; Трубка 2: 1 мкг плазмиды Flag-p53, 3 мкг плазмиды His-HA-Ub (HH-Ub) и 9 мкг пустого вектора; Трубка 3: 1 мкг плазмиды Flag-p53, 3 мкг плазмиды HH-Ub и 9 мкг плазмиды Mdm2. Добавьте в общей сложности 0,2 мкг плазмиды зеленого флуоресцентного белка (GFP) в каждую трубку для мониторинга эффективности трансфекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пилотный эксперимент должен быть выполнен для определения оптимального количества плазмид, необходимого для достижения эффективной экспрессии целевого белка в клетках.
3. Добавьте 78 мкл реагента трансфекции липосом к 4,5 мл восстановленной сывороточной среды в другой центрифужной трубке для разбавления липосом. Тщательно перемешать, щелкнув тюбиком и дать постоять 5 мин при комнатной температуре (RT).
4. Добавьте 1,5 мл разбавленного раствора липосом в каждую пробирку со стадии 2,2, содержащую 1,5 мл разбавленного раствора ДНК. Тщательно перемешайте и смешайте плазмиды с липосомами в течение не менее 20 минут при RT. Используйте плазмидную ДНК: соотношение липосом 1:2 (мкг:мкл) для каждой трансфекции.
5. Выбрасывайте исходную среду из чашки Петри и добавляйте в каждую чашку 9 мл восстановленной сывороточной среды. Добавьте 3 мл смеси липосом-ДНК в каждое блюдо и перемешайте раствор, осторожно встряхнув тарелку вперед и назад 3x, а затем влево и вправо 3x для равномерного распределения смеси в тарелке.
6. Культивируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5% CO₂. Заменяют среду через 4-6 ч и продолжают культивировать клетки в течение 24-36 ч.

3. Коллекция ячеек

1. Через 24-36 ч обрабатывают клетки MG132 в конечной концентрации 10 мкМ в течение 4-6 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: MG132 представляет собой пептидный альдегид, который эффективно блокирует протеолитическую активность протеасомного комплекса 26S. Количество белков, убиквитинированных полиубиквитиновыми цепями, связанными с лизином-48 (K48), может быть увеличено после обработки клеток MG132 или другими ингибиторами протеасомы.
2. Отбросьте среду, промыть клетки в 2 раза (заботясь о том, чтобы не вымыть клетки) ледяным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и аспирировать клетки серологическими пипетками.
3. Добавьте в чашку 1 мл PBS, удалите ячейки путем соскабливания чистым скребком и перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужные трубки. Центрифуга при 700 х г в течение 5 мин для сбора гранул клеток.

4. Очистка убиквитинированных белков в неденатурирующих условиях

1. Перед использованием приготовьте буфер лизиса Флага (50 мМ Tris-HCl (рН 7,9), 137 мМ NaCl, 10 мМ NaF, 1 мМ этилендиаминовой тетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1% тритона X-100, 0,2% саркосила и 10% глицерина), только что добавленный коктейлем ингибитора протеазы.
2. Добавьте 800 мкл ледяного буфера лизиса Flag к ячейкам в каждой трубке, перемешайте клетки с помощью вихревого генератора или пипетки, а затем инкубируйте смесь на ротаторе при 4 °C в течение 30 мин.
3. Подвергайте смесь 5-10 коротким импульсам ультразвука. Выполняют ультразвуковую обработку на льду на частоте ультразвуковой обработки 20 кГц и амплитуде 80% с каждым импульсом продолжительностью 1 с. Инкубировать смесь на ротаторе со скоростью 40 оборотов в минуту (об/мин) при 4 °C в течение 30 мин.
4. Центрифугирование ультразвуковых образцов при 8 000 х г в течение 20-30 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку.
5. Аликвота 80 мкл (1/10) клеточного экстракта и смешивается с 20 мкл 5x буфера нагрузки додецилсульфата натрия (SDS). Вскипятите образцы при 98 °C в течение 5 мин, охладите на льду в течение 2 мин и храните при -20 °C до использования. Используйте эти образцы в качестве входной группы для мониторинга экспрессии белка.
6. Добавьте 30 мкл анти-Flag M2-конъюгированных антител (Flag/M2) шариков к оставшимся клеточным экстрактам и инкубируйте на ротаторе при 4 °C в течение не менее 4 ч или на ночь.
7. Центрифуга при 1 500 х г в течение 2 мин при 4 °C для сбора шариков. Добавьте 1 мл ледяного буфера лизиса Flag к шарикам и перемешайте, перевернув трубку несколько раз.
8. Центрифуга при 1 500 х г в течение 2 мин при 4 °C для сбора шариков. Повторите шаг 4.7 4-6 раз.
9. Добавьте 40 мкл пептидов Флага в конечной концентрации 200 нг/мкл к шарикам и инкубируйте на ротаторе при 4 °C в течение 2 ч для элюирования связанных белков.
10. Центрифуга при 1,500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку.
11. Добавьте 10 мкл 5x SDS загрузочного буфера, отварите смесь при 98 °C в течение 5 минут, охладите на льду в течение 2 минут и храните при -20 °C для вестерн-блоттинга. В качестве альтернативы, храните элюат из шага 4.10 непосредственно при -80 °C для других последующих экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество очищенных убиквитинированных белков может быть увеличено за счет увеличения количества клеток и количества трансфектированных плазмид. Стратегия маркировки эпитопов может быть адаптирована для очистки клеточных комплексов, которые связываются специфически с убиквитинированным р53 в условиях нативной очистки. Путем совместной экспрессии Flag-p53, mdm2 и HA-убиквитина, убиквитинированный белковый комплекс p53 может быть иммунопреципитирован последовательной агарозой Flag и HA-конъюгированной антителами из клеток млекопитающих. Для сохранения партнеров по связыванию убиквитинированных белков р53 во время процесса очистки следует использовать менее строгий буфер лизиса BC100 (20 мМ Tris-HCl (рН 7,9), 100 мМ NaCl, 10% глицерина, 0,2 мМ ЭДТА, 0,2% тритона X-100 и ингибитор протеазы 1x). Элюат из пептида ГК подвергают масс-спектрометрии для идентификации всех партнеров, которые связываются специфически с убиквитинированным р53.

5. Очистка убиквитинированных белков в условиях денатурации

1. Добавьте 1 мл ледяного PBS к гранулам клеток, полученным на стадии 3.3, и равномерно перемешайте. Аликвота 100 мкл (1/10 объема) клеточной суспензии в микроцентрифужную трубку в качестве входного образца.
2. Центрифуга при 700 х г в течение 5 мин при 4 °С для сбора гранул ячейки. Добавьте 80 мкл буфера лизиса Флага во входной образец, перемешайте ячейки с помощью вихревого генератора или пипетки и лизируйте ячейки на льду в течение 1 ч.
3. Центрифуга при 8 000 х г в течение 20-30 мин при 4 °C. Aliquot 80 мкл супернатанта в новую микроцентрифужную трубку.
4. Добавьте 20 мкл 5x SDS загрузочного буфера к супернатанту, прокипятите при 98 °C в течение 5-10 мин, охладите на льду в течение 2 мин и храните при -20 °C до использования.
5. Центрифугируют оставшиеся 900 мкл клеточной суспензии при 700 х г в течение 5 мин при 4°С для сбора клеточной гранулы. Добавьте 1 мл убиквитинового буфера 1 (UB-буфер 1; 6 M гуанидин-HCI, 0,1 M Na₂HPO₄, 6,8 мМ₂PO₄, 10 мМ Tris-HCI (pH 8,0) и 0,2% Triton X-100, только что дополненный 10 мМ β-меркаптоэтанола и 5 мМ имидазола) к клеточным гранулам и перемешайте несколько раз путем пипетирования вверх и вниз для равномерного распределения клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация имидазола может варьироваться от 5 мМ до 20 мМ для уменьшения неспецифического связывания белка на никелевой смоле. Буфер убиквитина содержит гуанидина гидрохлорид, который инактивирует как лигазы, так и DUBs. β-меркаптоэтанол представляет собой прозрачную, бесцветную жидкость с сильным, неприятным запахом, похожим на тухлые яйца. Раствор высокой концентрации нанесет серьезный ущерб слизистой оболочке, верхним дыхательным путям, коже и глазам. Надевайте перчатки и очки и работайте в вытяжном капюшоне.
6. Подвергайте клетку лизатам 10-20 раундов ультразвуковой обработки до тех пор, пока раствор не перестанет быть вязким. Выполняют ультразвуковую обработку на льду на частоте ультразвуковой обработки 20 кГц и амплитуде 80% с каждым импульсом продолжительностью 1 с. Центрифуга при 8 000 х г в течение 20-30 мин при РТ и перенос супернатанта в новую микроцентрифужную трубку.
7. Добавьте 30 мкл никелевой смолы к супернатанту и инкубируйте на ротаторе, установленном при 15 об/мин в течение 4 ч или на ночь при RT. Центрифуга при 1 500 х г в течение 2 мин при RT для сбора шариков.
8. Добавьте 1 мл UB-буфера 1, инкубируйте с вращением в шейкере в течение 10 мин при RT и центрифугу при 1,500 x g в течение 2 мин на RT для сбора шариков.
9. Добавьте 1 мл убиквитинового буфера 2 (UB-буфер 2; 8 М мочевины, 0,1 М Na₂HPO₄, 6,8 мМ₂PO₄, 10 мМ Tris-HCI (рН 8,0) и 0,2% Тритона X-100) в бусины, инкубируйте с вращением в шейкере в течение 10 мин при RT и центрифугу при 1,500 х г в течение 2 мин для сбора шариков. Повторите это еще раз.
10. К шарикам добавить 1 мл PBS, инкубировать с вращением в шейкере в течение 10 мин при RT и центрифугу при 1 500 x g в течение 2 мин на RT для сбора шариков. Повторите это еще раз.
11. Элюдируют связанные белки путем инкубации шариков с 40 мкл имидазола в конечной концентрации 0,5 М в течение 1 ч при RT. Центрифуга при 1,500 х г в течение 2 мин при RT.
12. Переложите супернатант в чистую микроцентрифужную трубку, добавьте 10 мкл 5x SDS нагрузочного буфера, прокипятите при 98 °C в течение 5 мин, охладите на льду в течение 2 мин и храните при -20 °C для вестерн-блоттинга. В качестве альтернативы можно хранить необработанный элюат при -80 °C для других последующих экспериментов.

6. Обнаружение очищенных убиквитинированных белков методом вестерн-блоттинга

1. Разрешите образцы из этапов 4.11 и 5.12 методом электрофореза полиакриламидного геля додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), а затем перенесите их на нитроцеллюлозную мембрану с помощью вестерн-блоттинга для обнаружения белков-мишеней с использованием соответствующих антител, как описано¹⁸.
2. Вкратце инкубируют мембрану путем погружения в 20 мл блокирующего раствора, содержащего 5% дефатное сухое молоко в буфер TBST (15 мМ Tris-HCI; рН = 7,6, 4,6 мМ Tris-основание, 150 мМ NaCI, только что дополненное 0,1% Tween-20 перед применением) на RT в течение 1 ч. Затем инкубируют мембрану с первичными антителами при RT в течение 2 ч или на ночь при 4 °C. Используйте следующие антитела для каждого набора. Все первичные антитела использовали в разведении 1:1000.
   1. Обнаружение общего белка p53, включая убиквитинированный p53, с анти-p53 моноклональным антителом после иммунопреципитации шариками агарозы Flag/M2.
   2. Обнаружение убиквитинированных белков р53 с антителом против ГК или антиубиквитиновым антителом после иммунопреципитации шариками агарозы Флага/М2.
   3. Обнаружение убиквитинированных белков p53 с моноклональным антителом против p53 после вытягивания заряженной никелем смолы.
   4. Обнаружение общего убиквитинированного белка с антителом против ГК или антиубиквитиновым антителом после вытягивания заряженной никелем смолы.
3. Инкубируют мембрану с пероксидазой хрена (HRP)-конъюгированными вторичными антителами на RT в течение 1 ч после промывки 3x с буфером TBST в течение 5 мин каждый. Все вторичные антитела использовали в разведении 1:3000. Затем промыть мембрану с буфером TBST 3x в течение 5 мин каждый с легким перемешиванием.
4. Запустите систему визуализации хемилюминесценции для обнаружения сигналов от вестерн-блоттинга. Готовят раствор субстрата для HRP путем смешивания растворов А и В в соотношении 1:1.
5. Поместите нитроцеллюлозную мембрану в камеру-обскуру лицевой стороной вверх и равномерно покройте раствор подложки на мембрану с помощью пипеточного пистолета. Выберите автоматическую процедуру экспозиции для захвата хемилюминесцентных сигналов и вручную отрегулируйте время экспозиции до получения идеального сигнала.

Результаты

На принципиальной схеме показаны помеченные флагом белки p53 (Flag-p53) и his/HA с двойными метками убиквитина (HH-Ub) (рисунок 1A). Процедуры, используемые для очистки убиквитинированных белков, обобщены на рисунке 1B. Убиквитин, помеченный поли-Гисом, может быть лиги...

Обсуждение

Убиквитинация играет важнейшую роль практически во всех физиологических и патологических клеточных процессах². В последние годы был достигнут большой прогресс в понимании молекулярной роли убиквитина в сигнальных путях и того, как изменения в системе убиквитина приводя?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-mercaptoethanol	Sangon Biotech	M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE healthcare	NA931	Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE healthcare	NA935	Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220	FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody	Santa cruz	sc-9996	Primary antibody
Anti-HA High Affinity	Roche	11867423001	Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)	Santa cruz	sc-965	Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)	Santa cruz	sc-126	Primary antibody
EDTA	Sigma-Alddich	E5134	solvent
Fetal Bovine Serum	VivaCell	C04001-500	FBS
FLAG Peptide	Sigma-Alddich	F3290	Prepare elution buffer
GlutaMAX	Gibco	35050-061	supplement
Guanidine-HCI	Sangon Biotech	A100287-0500	solvent
H1299	Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab	Bio-rad		software
Immidazole	Sangon Biotech	A500529-0100	solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents	Invitrogen	11668019	Transfection reagent
MG132	MedChemExpress	HY-13259	Proteasome inhibitor
Na2HPO4	Sangon Biotech	A501727-0500	solvent
NaCl	Sangon Biotech	A610476-0005	solvent
NaF	Sigma-Alddich	201154	solvent
NaH2PO4	Sangon Biotech	A501726-0500	solvent
Ni-NTA Agarose	QIAGEN	30230	nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane	GE healthcare	10600002	0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985-070	Transfection medium
PBS	Corning	21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution	Sangon Biotech	E607011-0100	antibiotic
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
RPMI 1640	Biological Industries	01-100-1ACS	medium
Sarkosyl	Sigma-Alddich	L5777	solvent
SDS Loading Buffer	Beyotime	P0015L
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	supplement
Tris-base	Sangon Biotech	A501492-0005	solvent
Tris-HCI	Sangon Biotech	A610103-0250	solvent
Triton X-100	Sangon Biotech	A110694-0500	reagent
Tween-20	Sangon Biotech	A100777-0500	supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System	Bio-rad		ChemiDoc XRS+
Urea	Sangon Biotech	A510907-0500	solvent