JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف التحسينات التي أدخلت على طريقة قياسية لقياس قوى الجر الخلوي ، استنادا إلى طباعة التلامس الدقيق مع خطوة نقش طرح واحدة من صفائف نقطية من بروتينات المصفوفة خارج الخلية على الهلاميات المائية اللينة. تسمح هذه الطريقة بتصنيع أبسط وأكثر اتساقا لأنماط الجزر ، وهو أمر ضروري للتحكم في شكل مجموعة الخلايا.

Abstract

يسمح الفحص المجهري للجر المجهري بالتحكم في شكل الخلايا المفردة ومجموعات الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على النمط على مقياس طول الميكرومتر تسمح باستخدام مناطق التلامس المنقوشة هذه لقياس قوى الجر ، حيث تسمح كل نقطة مجهرية بتكوين التصاق بؤري واحد يشوه بعد ذلك الهيدروجيل الناعم الأساسي. وقد استخدم هذا النهج لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء، والخلايا الليفية، والصفائح الدموية، والخلايا الظهارية.

تصف هذه المراجعة تطور التقنيات التي تسمح بطباعة بروتينات المصفوفة خارج الخلية على هيدروجيل بولي أكريلاميد في مجموعة منتظمة من النقاط ذات الحجم والتباعد المحددين مسبقا. نظرا لأنه من الصعب طباعة أنماط مقياس الميكرومتر مباشرة على ركائز ناعمة ، يتم إنشاء الأنماط أولا على أغطية زجاجية صلبة يتم استخدامها بعد ذلك لنقل النمط إلى الهيدروجيل أثناء الهلام. أولا ، يتم وصف نهج الطباعة microcontact الأصلي لإنشاء صفائف من النقاط الصغيرة على coverslip. هناك حاجة إلى خطوة ثانية تزيل معظم النمط لترك جزر من النقاط الصغيرة للتحكم في أشكال الخلايا ومجموعات الخلايا على هذه المصفوفات من النقاط المنقوشة.

بعد ذلك ، يتم وصف تطور هذا النهج الذي يسمح بتوليد جزر من النقاط باستخدام خطوة نمط طرح واحدة. يتم تبسيط هذا النهج إلى حد كبير للمستخدم ولكن له عيب انخفاض العمر الافتراضي للقالب الرئيسي اللازم لصنع الأنماط. وأخيرا، يتم وصف النهج الحسابية التي تم تطويرها لتحليل صور النقاط النازحة وحقول الجر اللاحقة التي تولدها الخلايا، ويتم توفير نسخ محدثة من حزم التحليل هذه.

Introduction

تمارس معظم الأنماط الظاهرية للخلايا قوى الجر على بيئتها. يتم توليد قوى الجر هذه بواسطة الهيكل الخلوي المتقلص للخلية ، وهو عبارة عن شبكة من الأكتين والميوسين ، والبوليمرات الحيوية الخيطية الأخرى والبروتينات المتقاطعة1،2،3،4. يمكن أن تنتقل القوى المتولدة داخل الخلية إلى البيئة خارج الخلية أو الخلايا المجاورة ، في المقام الأول عن طريق البروتينات عبر الغشاء مثل integrins و cadherins ، على التوالي 5,6. إن كيفية انتشار الخلية أو انكماشها - وأحجام قوى الجر المرتبطة بتلك الحركات - هي نتيجة لمحادثة حميمة مع بيئتها ، والتي تعتمد إلى حد كبير على نوع وكمية البروتين الموجود في المصفوفة خارج الخلية (ECM) 7,8 وصلابة ECM. في الواقع ، أصبح الفحص المجهري لقوة الجر أداة لا تقدر بثمن لفهم استجابة الخلايا للمحفزات المحلية مثل صلابة الركيزة ، أو الضغوط الميكانيكية المفروضة والسلالات ، أو الاتصال بالخلايا الأخرى. هذه المعلومات ذات صلة مباشرة بفهم أمراض مثل السرطان والربو9،10،11،12.

مطلوب نظام يمكن استخدامه لقياس التشوه الناجم عن القوة لركيزة من خصائص المواد المعروفة لحساب قوى الجر. يجب تتبع هذه التغييرات بمرور الوقت ، مما يتطلب تقنيات التصوير ومعالجة الصور. كانت إحدى الطرق الأولى المستخدمة لتحديد قوى الجر الخلوي هي مراقبة وتحليل تقلص هيدروجيل الكولاجين المزروع بالخلايا ، على الرغم من أن هذه الطريقة كانت شبه كميةفقط 13. طريقة أخرى أكثر دقة هي قياس قوى الجر التي تمارسها الخلايا المفردة عن طريق تحديد القوى الناتجة عن تشوه ورقة رقيقة من السيليكون14. في وقت لاحق ، تم تطوير المزيد من تقنيات القياس الكمي ، وسمحت هذه الطرق أيضا باستخدام الهلاميات المائية اللينة مثل polyacrylamide (PAA) 12،15،16. عند استخدام هذه المواد اللينة ، يمكن تحديد قوى الجر من الإزاحة الناجمة عن القوة للخرز النازح عشوائيا المضمن في الهيدروجيل والخواص الميكانيكية للهلام16,17. وجاء تقدم آخر مع تطوير صفائف micropost مصنوعة من البولي ديميثيل سيلوكسان الناعم (PDMS) بحيث يمكن قياس انحرافها وتحويله إلى قوة باستخدام نظرية الحزمة18.

وأخيرا ، تم تطوير طرق للتنميط الدقيق للهيدروجيل اللينة لأن هذه الأساليب تسمح بالتحكم في مناطق التلامس للالتصاق الخلايا. من خلال قياس تشوه النمط المجهري داخل منطقة ملامسة الخلية ، يمكن بسهولة حساب قوى الجر لأن الصورة المرجعية الخالية من القوة ليست مطلوبة19. تم اعتماد هذه الطريقة على نطاق واسع لأنها تسمح بالتنميط غير المباشر لمجموعة منتظمة من نقاط التصاق البروتين الفلوري المنفصلة بحجم ميكرون على المواد الهلامية PAA لقياس قوى الجر الخلوي20. لحساب هذه القوى ، تم تطوير خوارزمية معالجة الصور ، والتي يمكنها تتبع حركات كل نقطة دقيقة دون الحاجة إلى إدخال المستخدم ،21.

في حين أن هذه الطريقة بسيطة لإنشاء شبكات كاملة من أنماط النقاط ، إلا أنها أكثر تعقيدا عندما تكون أنماط البقع المعزولة (أو الجزر) من النقاط مطلوبة. الجزر ذات الأنماط الدقيقة مفيدة عندما تكون هناك حاجة إلى التحكم في شكل مجموعات الخلايا ، وإلى حد ما من حيث الحجم. لإنشاء هذه الجزر ، تتطلب الطريقة المذكورة أعلاه للطباعة microcontact خطوتين متميزتين: i) استخدام ختم PDMS واحد لإنشاء نمط عالي الدقة من النقاط على غطاء ، ثم ii) استخدام ختم PDMS مختلف ثان لإزالة معظم تلك النقاط ، تاركا وراءه جزرا معزولة من النقاط21. وتتفاقم صعوبة إنشاء الجزر بهذه الطريقة الأصلية بسبب حقيقة أن إنشاء أنماط شبكة متسقة في الخطوة الأولى من العملية يمثل تحديا من تلقاء نفسه. تتكون طوابع الطباعة الدقيقة من مجموعة من الأعمدة الدقيقة الدائرية ، التي يتوافق قطرها مع حجم النقطة المطلوب. ثم يتم طلاء هذه الطوابع بطبقة متساوية من البروتين ثم يتم ختمها بكمية دقيقة من الضغط على الأغطية المعالجة لإنشاء النمط المطلوب. من ناحية ، يمكن أن يؤدي تطبيق الكثير من الضغط على الختم إلى نقل البروتين بشكل غير متساو وضعف دقة النمط بسبب التواء العمود أو ترهله بين الأعمدة ، مما يؤدي إلى ملامسة الزجاج. من ناحية أخرى ، يؤدي تطبيق ضغط قليل جدا إلى نقل البروتين أو عدم نقله على الإطلاق وضعف دقة الأنماط. لهذه الأسباب ، من المرغوب فيه إجراء عملية نقل يمكن استخدامها لإنشاء أنماط دقيقة عالية الجودة باستمرار لجزر النقاط المعزولة في خطوة واحدة فقط.

هنا ، يتم وصف طريقة للتنميط الدقيق غير المباشر لجزر من نقاط التصاق البروتين الفلوري بحجم ميكرون على هلام PAA أكثر اتساقا وتنوعا من الطرق التي تم تطويرها سابقا. في حين أن طرق التنميط المجهري غير المباشرة القديمة تعتمد على نقل أنماط البروتين من ختم PDMS إلى ركيزة وسيطة ، فإن الطريقة المقدمة هنا تستخدم طوابع PDMS بدلا من ذلك كوعاء لإزالة البروتين ، وليس الإضافة. يتم ذلك عن طريق تغيير هيكل طوابع PDMS المستخدمة بشكل أساسي. بدلا من صنع الطوابع التي تتكون من نمط من الأعمدة الدائرية المتباعدة بالتساوي ، تتكون الطوابع من نمط من الثقوب الدائرية المتباعدة بالتساوي في هذه الطريقة.

مع هذا الهيكل الجديد ، يمكن بعد ذلك معالجة سطح طوابع PDMS هذه باستخدام glutaraldehyde كما هو موضح سابقا20,29,30 ، مما يجعل الطابع قادرا على الارتباط تساهميا مع البروتين. عند استخدامها على غطاء زجاجي مطلي بالتساوي بالبروتين الفلورسنت ، يتم استخدام طوابع PDMS المعالجة بالغوتارالدهيد لإزالة معظم البروتين الموجود على سطح الغطاء ، تاركة وراءها فقط النمط المطلوب من النقاط المحددة مسبقا من خلال موقع الثقوب بحجم ميكرون على الختم. يزيد هذا التغيير من معدل النجاح لتوليد أنماط تتكون من شبكة شبه مستمرة من النقاط وإنشاء جزر معزولة من النقاط من خلال خطوة واحدة فقط.

Protocol

1. إنشاء سادة السيليكون

ملاحظة: تمت تغطية معظم عملية تصميم وإنشاء واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لسادة السيليكون للصب المتكرر لطوابع PDMS سابقا21 ، لذلك سيتم وصف الاختلافات الرئيسية فقط في هذا النهج الجديد هنا.

  1. قم بإنشاء تصميم قناع الصور باستخدام AutoCAD أو برنامج تصميم مشابه. قم بتغطية جانب واحد من القناع الضوئي ، وهو قطعة رقيقة من الزجاج ، بطبقة رقيقة من الكروم للتحكم في تشتت الأشعة فوق البنفسجية. صمم القناع الضوئي بحيث يؤدي تسليط ضوء الأشعة فوق البنفسجية من خلاله على مقاومة الضوء المختارة إلى إنشاء سيد سيليكون مع عكس الميزات المطلوبة على طوابع PDMS النهائية. انظر الشكل 1 لتصميم هذا القناع.
    ملاحظة: ما إذا كان ينبغي جعل الميزات المطلوبة أو المنطقة الموجودة خارجها شفافة على القناع الضوئي يعتمد على مقاومة الضوء المختارة. مقاومة الضوء المستخدمة هنا هي SU-8 2005 (تحذير: مهيجة للجلد والعين قابلة للاشتعال ؛ الابتعاد عن الحرارة / اللهب / الشرر واستخدام قفازات واقية ونظارات عند التعامل) ، وهي مقاومة سلبية للضوء قادرة على جعل ميزات طولها 5 ميكرومتر مع جدران جانبية شبه عمودية.
    1. علاج مقاومة الضوء السلبية عن طريق تعريضها للأشعة فوق البنفسجية وإزالة SU-8 غير المعالج بمذيب كيميائي. لذلك ، صمم الميزات الأساسية للقناع لتكون شفافة بينما تكون المنطقة المحيطة بالقناع غير شفافة.
    2. بالنسبة لطريقة الإزالة الجديدة هذه ، صمم القناع الضوئي بحيث يتكون من مربعين بحجم 1.5 × 1.5 سم (الشكل 1A) ، أحدهما مليء بشبكة متساوية من دوائر 2 ميكرومتر متباعدة من 6 ميكرومتر إلى الوسط ، والآخر يتكون من العديد من الجزر المربعة التي هي إصدارات أصغر ومعزولة من نفس نمط الشبكة (الشكل 1B). اصنع جزرا بالأحجام التالية: 6 × 6 نقاط ، 12 × 12 نقطة ، 25 × 25 نقطة ، و 42 × 42 نقطة.
      ملاحظة: تم اختيار قطر نقاط الالتصاق (2 ميكرومتر) بناء على دراسات سابقة قاست قوى الجر الخلوي22,23. القناع المستخدم هنا هو 101.6 × 101.6 مم وهو مطلي على جانب واحد بطبقة سميكة 0.06 ميكرومتر من الكروم ، وهو أمر موصى به بسبب الميزات الصغيرة للسيد. تم تكليف القناع الضوئي المستخدم هنا من شركة طباعة Photomask خارجية.
  2. داخل غرفة الأبحاث ، قم بتغطية رقاقة السيليكون المختارة بالتساوي بمقاومة للضوء. كخطوة اختيارية ، عالج الرقاقة السطحية في آشر البلازما قبل طلائها بالمقاومة.
    ملاحظة: هنا ، يتم استخدام رقائق قطرها 100 مم. العلاج في آشر البلازما يجعل الرقاقة أكثر قابلية للارتباط ب SU-8 ويساعد على منع إزالة SU-8 من الرقاقة.
  3. قم بتنفيذ الخطوات التالية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمقاومة للضوء:
    1. قم بتدوير الرقاقة المطلية لإنشاء سمك الميزة المطلوب ، مع تغيير وقت الدوران بناء على السمك المطلوب ونوع المقاومة. بالنسبة ل SU-8 2005 بسماكة 5 ميكرومتر ، قسم برنامج الدوران الموصى به إلى الخطوات الثلاث التالية:
      1. قم بتغطية الرقاقة بمقاومة للضوء عن طريق الدوران بسرعة 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان مع منحدر يبلغ 100 دورة في الدقيقة / ثانية.
      2. قلل سمك المقاومة إلى حوالي 5 ميكرومتر عن طريق تدوير الرقاقة عند 3000 دورة في الدقيقة مع منحدر يبلغ 300 دورة في الدقيقة / ثانية لمدة 30 ثانية.
      3. قم بإبطاء الرقاقة ببطء بعد الدوران عن طريق تقليل السرعة إلى 0 RMP مع منحدر يبلغ 500 دورة في الدقيقة / ثانية لمدة 1 ثانية.
    2. قم بإعداد المقاومة للتعرض للأشعة فوق البنفسجية عن طريق خبزها لفترة وجيزة على صفيحة ساخنة 95 درجة مئوية. تعديل الوقت المستغرق على السخان وفقا للسمك المطلوب للمقاومة ؛ وقت الخبز هو 2 دقيقة ل SU-8 2005 بسماكة 5 ميكرومتر.
    3. تعريض المقاومة للأشعة فوق البنفسجية لعلاج الميزات المطلوبة تماما. كن حذرا من التعرض المفرط ، لأن هذا يمكن أن يجعل SU-8 هشا ويؤثر على الجودة الشاملة للسيد الناتج.
      1. استخدم طاقة التعرض البالغة 105 مللي جول/سم2 لطائرة SU-8 2005 بسماكة 5 ميكرومتر. استنادا إلى قوة مصباح الأشعة فوق البنفسجية المتاح، احسب وقت التعرض عن طريق قسمة طاقة التعرض على قوة المصباح بالميجاوات.
        ملاحظة: نظرا لأن المصباح المستخدم هنا تبلغ قوته 8 ميجاوات، يجب أن يكون وقت التعرض 13.1 ثانية.
    4. لضبط ميزات SU-8 بعد التطوير ، اخبز مرة أخرى على صفيحة ساخنة 95 درجة مئوية ، هذه المرة لمدة 3 دقائق. انتظر حتى تظهر الميزات المطلوبة للسيد في غضون 1 دقيقة خلال خطوة الخبز هذه إذا تم الكشف عن المقاومة بشكل صحيح.
    5. قم بإزالة SU-8 غير المعالج من رقاقة السيليكون باستخدام مطور SU-8. كن دقيقا عند إزالة SU-8 غير المعالج ، حيث يمكن أن تتعثر بين الميزات بحجم ميكرون ومتباعدة على الرقاقة.
      تحذير: مطور SU-8 هو مهيج للجلد والعين قابل للاشتعال. احفظه بعيدا عن الحرارة / اللهب / الشرر واستخدم قفازات واقية ونظارات عند التعامل معه.
    6. بعد التطوير ، اشطف بالأسيتون لإزالة المطور الزائد على الرقاقة وتجفيفه تماما باستخدام مسدس رش النيتروجين.
      تحذير: الأسيتون هو مهيج للجلد والعين قابل للاشتعال. احفظه بعيدا عن اللهب / الشرر واستخدم قفازات واقية ونظارات عند التعامل معه.
    7. اختياريا ، بالنسبة ل SU-8 2005 ، اخبز على صفيحة ساخنة 200 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: يضيف هذا الخبز الصلب قوة ميكانيكية إلى مقاومة الضوء.
  4. بعد السماح لها بالتبريد، ضع الرقاقة في صينية حاملة للرقاقة ثم صبها في PDMS. أولا ، أكمل معالجة السيلانات على الرقاقة لجعل ميزات SU-8 لسيد السيليكون أقل عرضة للارتباط ب PDMS وبالتالي أقل عرضة للإزالة من سطح الرقاقة.
    1. لإكمال معالجة سطح السيلان، ضع السيلان وغطاء زجاجي صغير داخل مجفف مخصص للاستخدام مع السيلانات فقط. ضع 1-2 قطرات صغيرة من Trichloro (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane على الغطاء ، وأغلق المجفف ، وقم بتشغيله تحت الفراغ لمدة 30 دقيقة عند ضغط 4500 باسكال24.
      تحذير: تريكلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane هو مهيج للجلد والعين قابل للاشتعال. احفظه بعيدا عن الحرارة / اللهب / الشرر ، واستخدم قفازات واقية ونظارات عند التعامل معها ، واعمل تحت غطاء الدخان.
    2. أطفئ الفراغ واترك المفتاح والغطاء في المجفف لمدة 30 دقيقة أخرى.
      ملاحظة: الرئيسي جاهز الآن للصب في PDMS.

2. طرح الطباعة microcontact

  1. امزج PDMS في النسبة الصحيحة لعامل المعالجة إلى القاعدة بناء على تعليمات الشركة المصنعة. اتركه في درجة حرارة الغرفة والضغط لمدة 15 دقيقة ؛ ثم ، degas تحت فراغ لمدة 15 دقيقة.
  2. صب PDMS في السيد ووضعها في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للعلاج.
  3. قم بإزالة المعلم من الحاضنة واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  4. بينما يبرد المعلم ، يقوم بتغطية سونيكات 25 مم في الإيثانول لمدة 10 دقائق. استخدم أكبر عدد ممكن من الأغطية مثل عدد الطوابع التي يتم إعدادها.
  5. اشطف الأغطية مقاس 25 مم جيدا بالماء منزوع الأيونات (DI) وجففها باستخدام مسدس هواء مفلتر.
  6. تعالج البلازما الأغطية لمدة 1 دقيقة باستخدام مكنسة بلازما تحت المكنسة الكهربائية على ارتفاع (قوة تردد لاسلكي تبلغ 30 واط). تأكد من تحرير الفراغ ببطء بعد العلاج لمنع انزلاقات الغطاء من التحرك داخل الغرفة.
    ملاحظة: تخدم المعالجة البلازمية لسطح الزجاج غرضين: فهي تنظف سطح الزجاج لإزالة الملوثات وتولد مجموعات قطبية قائمة على الأكسجين على سطح الزجاج لجعله كارها للماء25. هذا الكارهة للماء يجعل سطح الزجاج أكثر قابلية لربط البروتين.
  7. في غرفة خالية من أشعة الشمس المباشرة / الإضاءة العلوية ، قم بتغطية كل غطاء ب 100 ميكرولتر من محلول البروتين المسمى بالفلورسنت بتركيز لا يقل عن 100 ميكروغرام / مل ، وقم بتغطيته لحماية إضافية من الضوء واتركه لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: هنا ، يتم استخدام الفيبرونيكتين المعزول من البلازما البشرية والمصبوغ باستخدام AlexaFluor 488.
    1. لصبغ الفيبرونيكتين ، اجمع بين الفيبرونيكتين غير المسمى بالتركيز والحجم المعروفين مع الكمية المناسبة من صبغة الفلورسنت في أنبوب 1.5 مل. قم بتغطية الأنبوب بورق الألومنيوم لحماية الصبغة من الضوء واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، مع خلطها بلطف كل 10 دقائق عن طريق قلب الأنبوب رأسا على عقب 5-10 مرات.
      ملاحظة: تختلف كمية الصبغة المطلوبة بناء على الصبغة المستخدمة وكتلة البروتين المستخدمة. راجع الملف التكميلي 1 للاطلاع على الآلة الحاسبة المستخدمة لتحديد الكمية المناسبة من صبغة الفيبرونيكتين الموسومة ب Alexa 488. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، يمكن تصفية الصبغة الزائدة باستخدام أعمدة تحلية المياه (انظر جدول المواد).
  8. اشطف كل غطاء جيدا بماء DI ، وأزل الماء الزائد من السطح عن طريق النقر بلطف على جانبي كل غطاء على منشفة ورقية أو مادة ماصة مماثلة. اترك الأغطية مكشوفة في الظلام لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح لها بالجفاف تماما.
  9. بينما تجف الأغطية المغلفة بالبروتين ، قم بإزالة ختم PDMS من المعلم عن طريق قطعه بمشرط أو شفرة حادة أخرى.
    ملاحظة: من الأفضل عدم محاولة قطع PDMS في المحاولة الأولى ، لأن تطبيق هذا الضغط الكبير سيؤدي إلى كسر رقاقة السيليكون وإتلاف السيد.
  10. تعالج البلازما طوابع PDMS لمدة 2 دقيقة تحت الفراغ على ارتفاع (قوة تردد لاسلكي تبلغ 30 واط).
  11. داخل غطاء الدخان ، ضع الطوابع في حاوية ذات غطاء وقم بتغطية كل ختم بطبقة رقيقة جدا (<100 ميكرولتر) من 10٪ (3-aminopropyl) trimethoxysilane (3-APTMS) مخففة في الإيثانول بنسبة 100٪.
    تحذير: 3-APTMS هو مهيج للجلد والعين قابل للاشتعال. احفظه بعيدا عن اللهب / الشرر ، واستخدم قفازات واقية ونظارات عند التعامل معها ، واعمل تحت غطاء الدخان. سيؤدي الطلاء المفرط لمحلول 3-APTMS إلى تكوين فيلم برتقالي لاحقا في هذه العملية. تتضمن هذه المعالجة السطحية 3-APTMS وظيفة الأمين في سطح ختم PDMS ، مما سيسمح بمزيد من الاشتقاق لسطح الختم لاحقا في26.
  12. قم بتغطية الحاوية بالطوابع واسمح لها بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  13. باستخدام ماء DI ، اشطف جيدا كل ختم على كلا الجانبين.
  14. ضع الطوابع في وعاء نظيف وقم بتغطيتها بحرية بنسبة 2.5٪ glutaraldehyde في ماء DI.
    تحذير: الجلوتارالدهيد سام. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل والعمل تحت غطاء الدخان). يوفر علاج الجلوتارالدهيد هذا إلى جانب علاج 3-APTMS السابق وظائف الألدهيد على سطح طوابع PDMS ، والتي يمكن أن تتفاعل مع مجموعات الأمين في البروتينات لإنشاء رابط أمين ثانوي ، وهو أمر بالغ الأهمية لعملية إزالة البروتين27.
  15. قم بتغطية الطوابع ، واتركها تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم اشطفها جيدا بماء DI مرة أخرى. قم بإزالة الماء الزائد من سطح الطوابع بنفس طريقة الأغطية ، واسمح للطوابع بالجفاف غير المغطاة لمدة 30 دقيقة تقريبا.
  16. بعد 30 دقيقة ، تحقق مما إذا كانت كل من الأغطية المغلفة بالبروتين والطوابع جافة. إذا لم يكن أي منهما جافا تماما ، فاستخدم مسدس هواء مصفى لتجفيفه تماما ، مما يضمن عدم تعرض أغطية الغطاء للضوء لفترة طويلة.
  17. بمجرد أن تجف كل من الأغطية والطوابع ، ادفع نمط الطوابع جانبا لأسفل على الأغطية مع ضغط كاف بحيث تتلامس الطوابع تماما مع سطح الغطاء. اترك الطوابع على اتصال مع الأغطية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: نظرا لرابطة الأميد التساهمية بين ختم الجلوتارالدهيد مع طبقة البروتين الموجودة على الغطاء الزجاجي - وهو أقوى بكثير من التفاعلات الضعيفة الكارهة للماء بين طبقة البروتين والغطاء الزجاجي - يجب أن تقشر البروتينات الزجاج وفقا للنمط الموجود على ختم PDMS بمجرد إزالته.
  18. بعد 15 دقيقة ، قشر بعناية طوابع PDMS من الأغطية.
    ملاحظة: إذا كانت عملية الإزالة تعمل بشكل صحيح ، فيجب ألا تخرج الطوابع من الأغطية دون مقاومة ولكن يجب أيضا ألا تكون عالقة بقوة في الأغطية بحيث لا يمكن إزالتها دون قوة مفرطة.
  19. تحقق من دقة الأغطية المنقوشة باستخدام المرشح المناسب على مجهر الفلورسنت (اعتمادا على صبغة الفلورسنت التي تتميز بها البروتينات).
  20. استخدم الأغطية المنقوشة على الفور أو احفظها وخزنها بعيدا عن الضوء المباشر.

3. الأغطية المنشطة

ملاحظة: يتم تصنيع الأغطية السفلية للاستخدام في الغرفة التجريبية للمواد الهلامية PAA في هذه الخطوة. تمت معالجة غطاء الغطاء السفلي هذا خصيصا للسماح لهلام PAA بالبقاء ملتصقا به بشكل آمن حيث تتم إزالة الغطاء العلوي المزخرف أثناء عملية النقش. كما يتم وصف تقنيات مماثلة في أماكن أخرى10،12،15،28.

  1. غطاء سونيكات 30 مم في الإيثانول 100٪ لمدة 10 دقائق ، وشطف بالماء DI ، ثم جفف تماما باستخدام مسدس هواء مصفى. قم بإعداد ما يصل إلى 6 أغطية في المرة الواحدة لكل دفعة في طبق من 6 آبار.
  2. تعالج البلازما الأغطية لمدة 1 دقيقة على ارتفاع (قوة تردد لاسلكي تبلغ 30 واط) ثم تضع كل غطاء في بئر من 6 ألواح بئر.
  3. قم بتغطية كل غطاء بطبقة رقيقة جدا من 5٪ APTMS في الإيثانول في غطاء الدخان.
    ملاحظة: سوف تتشكل بقايا برتقالية في حالة الطلاء المفرط في هذه العملية.
  4. قم بتغطية اللوحة المكونة من 6 آبار واترك الأغطية لمدة 5 دقائق.
  5. شطف الأغطية (كلا الجانبين) وداخل كل بئر جيدا بماء DI وإزالة المياه الزائدة داخل الآبار.
  6. ضع الغطاء مرة أخرى في الصفيحة المكونة من 6 آبار وأضف حوالي 2 مل من 0.5٪ glutaraldehyde في ماء DI.
  7. قم بتغطية اللوحة المكونة من 6 آبار واترك الأغطية تجلس في محلول glutaraldehyde لمدة 30 دقيقة ؛ ثم ، شطف جيدا كل من الأغطية وآبار كل طبق بماء DI.
  8. قم بتخزين الأغطية المعالجة في ماء DI داخل ألواح 6 آبار لمدة تصل إلى أسبوعين أو استخدمها على الفور. تأكد من أن الأغطية جافة تماما قبل الاستخدام.

4. تصنيع هلام PAA ونقل النمط

ملاحظة: بمجرد صنع أغطية منقوشة ، يجب استخدامها لنقل أنماط البروتين هذه إلى هيدروجيل PAA بعد فترة وجيزة (<24 ساعة) 1،29،30. الوصفة التالية هي لهلام PAA مع معامل يونغ من 3.6 كيلو باسكال. يمكن تنويع كميات ماء ثنائي الأكريلاميد والأكريلاميد و DI لضبط صلابة المواد الهلامية PAA12.

  1. قبل البدء في صنع سلائف هيدروجيل PAA ، قم بإزالة حمض الأكريليك N-hydroxysuccinimide (NHS)-ester من الثلاجة حتى يتمكن من الوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتحه. قم بإعداد طبق قابل للتبديل عن طريق تعقيمه بنسبة 70٪ من الإيثانول وتركه تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
    تحذير: NHS هو مهيج سام للجلد والعين. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل معها ، والعمل تحت غطاء الدخان.
    1. أضف 1.25 مل من 40٪ أكريلاميد في ماء DI إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
      تحذير: مادة الأكريلاميد هي مادة سامة مهيجة للجلد والعين. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل معها ، والعمل تحت غطاء الدخان.
    2. أضف 175 ميكرولتر من محلول ثنائي الأكريلاميد في ماء DI إلى نفس الأنبوب (الخطوة 4.1.1).
      تحذير: بيس أكريلاميد هو مهيج سام للجلد والعين. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل معها ، والعمل تحت غطاء الدخان.
    3. أضف 500 ميكرولتر من 10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
      تحذير: PBS هو مهيج للعين. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل.
    4. أضف 2.915 مل من ماء DI.
  2. ماصة 969 ميكرولتر من هذا السلائف في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ، وتخزين الباقي عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  3. قياس ~ 50-100 ملغ من كبريتات الأمونيوم (APS) في أنبوب آخر للطرد المركزي الدقيق وتخفيفه في ماء DI حتى 100 ملغ / مل ؛ ضعه جانبا للاستخدام لاحقا. افتح استر NHS (الآن في درجة حرارة الغرفة) في غطاء المحرك وقم بقياس ما يصل إلى 3 ملغ من NHS بعناية في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير. تمييع NHS-استر إلى 1 ملغ / مل في 1x PBS.
    تحذير: APS هو مهيج للجلد والعين. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل معها ، والعمل تحت غطاء الدخان. سوف تتحلل كل من APS و NHS-ester بمرور الوقت ، مما يتسبب في اختلاف نشاط المواد الكيميائية في محلول المخزون. لذلك ، يجب إعداد هذين الحلين طازجين في كل مرة (على عكس بقية السلائف).
  4. قم بتنفيذ الخطوات الثلاث التالية في غطاء الدخان:
    1. أضف 2 ميكرولتر من رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على أليكوت 969 ميكرولتر من سلائف PAA.
      تحذير: TEMED هو مهيج للجلد والعين قابل للاشتعال. احفظه بعيدا عن الحرارة / اللهب / الشرر ، واستخدم قفازات واقية ونظارات عند التعامل معها ، واعمل تحت غطاء الدخان. TEMED هو واحد من اثنين من عوامل الربط المتقاطعة الحاسمة لبلمرة هيدروجيل PAA ، والآخر هو APS.
    2. أضف 15 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 1 M لتقليل الرقم الهيدروجيني لمحلول الهيدروجيل وتجنب التحلل المائي لإستر NHS.
      تحذير: حمض الهيدروكلوريك هو مهيج للجلد والعين المسببة للتآكل. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل معها ، والعمل تحت غطاء الدخان.
    3. أضف 10 ميكرولتر من محلول NHS-ester إلى الأنبوب.
      ملاحظة: NHS أمر بالغ الأهمية لعملية النقش. سوف يتفاعل مع مجموعات الأمين في البروتينات الموجودة على الغطاء المزخرف لتشكيل رابطة أميد مستقرة ، مما سيسمح بنقل النمط من الغطاء الزجاجي إلى سطح هلام PAA أثناء بلمرته31.
  5. تنفيذ هذه الخطوات النهائية في خزانة السلامة الأحيائية:
    1. ضع الغطاء مقاس 30 مم بعناية داخل الجزء المعدني من مجموعة أطباق الغطاء (3-APTMS والجانب المعالج بالغلوتارالدهيد لأعلى) وقم بربط الحلقة البلاستيكية في الأعلى. قم بإعداد الغطاء المزخرف بحيث يمكن الوصول إليه بسهولة في الخطوة التالية ، مع الحفاظ على حمايته من الضوء قدر الإمكان.
    2. ماصة 5 ميكرولتر من محلول APS في بقية سلائف PAA في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، وقلبها للخلط ، ثم ماصة على الفور 35 ميكرولتر من هذا المحلول على غطاء 30 ملم.
    3. قم بإسقاط بروتين الغطاء المزخرف جانبا على المحلول ، مع الحرص على عدم إنشاء فقاعات هواء في الهيدروجيل. حماية الهيدروجيل من الضوء والسماح له بالبلمرة لمدة 90 دقيقة.
    4. بمجرد بلمرة الهيدروجيل ، استخدم شفرة حلاقة أو مشرط لإزالة الغطاء العلوي ، مما يضمن عدم انزلاق الغطاء عن الجل أو سقوطه مرة أخرى على الجل بمجرد إزالته ، لأن هذا سيدمر النمط الموجود على سطح الجل.
      ملاحظة: لا تترك الجل مكشوفا في منطقة ذات تدفق هواء كبير (مثل خزانة السلامة الأحيائية).
    5. لتخميل أي إستر NHS متبقي في الهيدروجيل ، أضف 2 مل من PBS المعقم إلى الجل واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. قم بإعداد المواد الهلامية على الفور للتجارب أو تخزينها بين عشية وضحاها في PBS معقمة عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

5. التصوير

  1. للتحضير للتجارب على الخلايا ، قم بتشغيل الحرارة (37 درجة مئوية) والرطوبة (70٪) في المجهر بعد ظهر اليوم السابق للتجربة المخطط لها للسماح للمعدات داخل غرفة المجهر بالتوازن مع درجة الحرارة الأعلى.
    ملاحظة: تقلل هذه الخطوة من الانجراف z الناجم عن تقلبات درجة الحرارة.
  2. قبل بدء التجربة مباشرة ، قم بتشغيل مصدر CO2 الخاص بالغرفة.
  3. لمنع الانجراف x-y الناجم عن الحركة المتكررة لمرحلة المجهر أثناء التجربة ، قم بإصلاح مجموعة أطباق الغطاء القابلة للتبديل التي تحمل الهيدروجيل المزروع ببذور الخلية إلى المرحلة بشريط على الوجهين.
  4. انظر إلى الجل للعثور على إطارات ذات أهمية للصورة ، مع حفظ كل موضع مرحلة من الأقسام المراد تصويرها.
  5. في كل من عرض brightfield وعرض الفلورسنت المقابل للبروتين المسمى ، اضبط برنامج المجهر على تصوير كل إطار مرة واحدة كل 5 دقائق لمدة 2 ساعة.

6. تحليل الصور

ملاحظة: تم تطوير نظام يمكنه قياس تشوه المواد الهلامية PAA المنقوشة عن طريق تحديد موقع نقاط الجر ، واستيفاء المواقع الأولية للنقاط المشوهة ، ثم حساب قوى الجر الخلوية في كل موقع. يمكن استخدام أي نظام برمجي قادر على إجراء معالجة الصور والحسابات العددية. يهدف البرنامج إلى تحديد قوى الجر بسرعة ، والقضاء على مدخلات المستخدم وإجراءات المعالجة المسبقة التي من شأنها أن تسهم في الأخطاء المتعلقة بالمستخدم. يتوفر الرمز المستخدم هنا كملفات تكميلية 2-10 ، ويمكن الوصول إلى هذه الملفات ، إلى جانب زوج من صور الممارسة ، في www.bu.edu/mml/downloads.

  1. في برنامج معالجة الصور، افتح جميع الصور الفردية التي تم التقاطها أثناء تجربة الفاصل الزمني من كل عرض مجهري مستخدم بالترتيب، من الصورة الأولى إلى الأخيرة التي تم التقاطها، وقم بتحويلها إلى مكدس صور واحد (النقر فوق الصورة | مكدسات | الصور إلى مكدس). تأكد من وجود مكدسين منفصلين للصور: أحدهما لعرض المجال الساطع للخلايا والآخر لعرض الفلورسنت للنمط الذي يتم إرفاقهما به.
    1. إذا كان هناك انجراف في الصور الفلورية (أي أن جزيرة الاهتمام تتحرك في الاتجاه x و / أو y بين كل إطار بمقدار >1-2 ميكرومتر) ، فقم أولا بمعالجة مكدس الصور باستخدام المكون الإضافي StackReg (P. Thévenaz ، المعهد الفيدرالي السويسري للتكنولوجيا لوزان) لإعادة توسيط كل صورة في المكدس بناء على موضع الأول (النقر فوق المكونات الإضافية | | ستاك ريج | الترجمة حسنا).
      ملاحظة: هذا أمر بالغ الأهمية لأنه حتى الانجراف دون μm يمكن أن يؤثر بشكل كبير على الحساب النهائي لقوى الجر ، خاصة على المواد الهلامية الأكثر صلابة حيث يكون هذا الانجراف x-y خارج نطاق الضوضاء المتوقعة. سيحفظ هذا الرمز الصور بعد إزالة الانجراف ، والتي يمكن بعد ذلك تحويلها إلى مكدس صور جديد لتحليلها.
  2. أدخل مكدسات الصور الساطعة والفلورسنت في CTFTimelapse.m (الملف التكميلي 2).
    1. حدد دليل الملفات حيث توجد مكدسات الصور على السطر 7.
    2. في السطرين 8 و9، حدد اسمي مكدس الصور الفلورية ومكدس الفلورسنت الساطع المقابل على التوالي.
    3. حدد صلابة هلام PAA (Pa):
      1. في الأسطر 11-14 ، والتي تتضمن بعض النماذج المرنة المختلفة من الهلاميات المائية PAA المستخدمة في معظم الأحيان ، قم بالتعليق (اكتب ٪ في بداية الخط) كل شيء باستثناء معامل مرونة الجل في الصور التي يتم تحليلها. بدلا من ذلك ، أضف معامل المرونة إذا لم يكن موجودا بالفعل على الباقي (3658.19 باسكال لصور الاختبار).
    4. حدد نصف قطر النقطة (م) على السطر 15 (1 × 10-6 م لصور الاختبار).
    5. حدد أقصى قطر نقطي ممكن (ميكرومتر) على السطر 16 (2.5 ميكرومتر لصور الاختبار).
    6. حدد نسبة البكسل (ميكرومتر/بكسل):
      1. في الأسطر من 17 إلى 20 ، والتي تتضمن بعض نسب بكسل الصور المختلفة بناء على إعدادات التصوير المستخدمة سابقا ، قم بالتعليق (اكتب ٪ في بداية السطر) كل شيء باستثناء نسبة بكسل الصور التي يتم تحليلها. بدلا من ذلك ، أضف نسبة البكسل المستخدمة إذا لم تكن موجودة بالفعل على الباقي (0.1613 ميكرومتر / بكسل لصور الاختبار).
    7. في السطرين 35 و 87 ، حدد دليل الملفات حيث توجد ملفات معالجة الصور الضرورية.
      ملاحظة: من مكدس الصور الفلورية، تحدد التعليمة البرمجية موقع كل نقطة فلورسنت وتتعقب حركة كل نقطة بين كل صورة في المكدس20. يعرف الموضع الأولي لنقاط الاتصال الدقيقة المطبوعة لأنها لا تتشوه عند نقلها بشكل صحيح إلى الهيدروجيل32.
  3. انتظر حتى يظهر شكلان ومربع حوار واحد بمجرد أن يعثر البرنامج على النقاط. استخدم الشكل 1 للتأكد من أن البرنامج قد وجد النقاط الصحيحة ولم يجد العديد من النقاط حيث لم يكن هناك أي نقاط. استخدم الشكل 2 لاختيار الشبكة المستطيلة التي تساعد البرنامج على تحديد موقع قوى الجر الخلوية وحسابها.
    ملاحظة: الشكل 1 هو صورة الحقل الساطع للخلية مع النقاط التي وجدها البرنامج (والتي ستكون حمراء) متراكبة فوقها (انظر الشكل 3A). الشكل 2 هو صورة تعرض نفس النقاط الموضحة في الشكل 1 ولكن بدون صورة الحقل الساطع في الخلفية.
    1. انتظر حتى يطالب مربع الحوار بالضغط على Enter بعد تحديد النقطة - حيث تكون كل نقطة واحدة من النقاط الحمراء التي وجدها البرنامج - وتحتوي على زر كبير واحد بداخلها يسمى Enter.
    2. اختر أربع نقاط مختلفة في الشكل 2 لإنشاء شبكة مستطيلة حول الخلية/المجموعة على هذا النمط وتضمينها. حدد كل نقطة واحدة تلو الأخرى بنقرة بزر الماوس الأيسر وقم بتأكيدها بالضغط على Enter على الزر الموجود في مربع الحوار المذكور أعلاه. احتفظ بعدد النقاط الموجودة بين النقطة الأولى والثانية بالإضافة إلى النقطة الأولى والثالثة ، حيث سيطلب البرنامج هذه القيم بمجرد تحديد جميع النقاط ذات الزوايا الأربع. أدخل هذه القيم في نافذة الأوامر (اكتب عدد النقاط وانقر فوق الزر Enter على لوحة المفاتيح عند مطالبتك بذلك).
  4. بمجرد اختيار الشبكة المستطيلة ، انتظر حتى يقوم البرنامج النصي بحساب قوى الجر التي يجدها داخل الشبكة بناء على مواقع نقاط الفلورسنت. لاحظ أن البرنامج النصي يجد أولا متجه الإزاحة (u) للمركز الهندسي لكل نقطة ثم يحسب متجه قوة الجر المقابل (F) باستخدام Eq (1):
    figure-protocol-23195(1)
    حيث E هو معامل يونغ لركيزة PAA ، a هو نصف قطر علامات نقطة الفلورسنت ، و ν هو نسبة بواسون من الركيزة PAA32. يفترض Eq (1) أن الركيزة هي نصف مساحة مرنة لا نهائية ، وأن قوى الجر يتم تطبيقها في مركز كل علامة نقطية دائرية ، وأن التباعد بين علامات النقاط كبير بما فيه الكفاية بحيث لا تتفاعل إزاحات كل منها مع بعضها البعض23.
    ملاحظة: في التجارب الموضحة هنا، يتم استخدام علامات نقطية نصف قطرها a = 1 ميكرومتر و 6 ميكرومتر من مركز إلى مركز. يجب أن تكون أسهم قوة الجر داخل الخلية / الكتلة التي تشير إلى الداخل نحو مركز الخلية موجودة ، في حين يجب ألا تحتوي المنطقة خارج الخلية / الكتلة على أسهم جر موجودة (انظر الشكل 3C-E). تشير أسهم الجر التي تشير إلى الخارج من داخل الخلية / المجموعة أو العديد من أسهم الجر الكبيرة الموجودة خارج الخلية إلى شبكة مستطيلة سيئة الاختيار.
  5. بمجرد العثور على حقل الجر الصحيح، حدد منطقة اهتمام مناسبة (ROI) تحيط بالخلية/المجموعة، والتي تتضمن جميع أسهم الجر داخل الخلية باستخدام المؤشر.
    1. لرسم عائد الاستثمار، انقر بزر الماوس الأيسر عدة مرات حسب الضرورة لرسم شكل مضلع بأكبر عدد ممكن من الجوانب حسب الرغبة أو ضبط الشكل أو تحريك عائد الاستثمار بعد رسمه بالنقر بزر الماوس الأيسر على الزوايا أو الحواف، على التوالي. بمجرد سحب عائد الاستثمار ، انقر نقرا مزدوجا بزر الماوس الأيسر للانتقال إلى الصورة التالية في المكدس. كرر ذلك لجميع الصور الموجودة في مكدس الحقل الساطع.
      ملاحظة: ستوفر التعليمة البرمجية بيانات قوة الجر والإزاحة لكل نقطة زمنية في نفس المجلد مثل مكدسات الصور الأصلية، والتي يمكن تحليلها بعد ذلك بشكل أكبر.

النتائج

تم استخدام الهلاميات المائية PAA مع معامل يونغ E = 3.6 kPa ونسبة Poisson البالغة ν = 0.445 بواسطة طريقة التنميط الدقيق المطروحة هذه. تم تصنيع الهلاميات المائية ليكون سمكها ~ 100 ميكرومتر ، مما يسمح بتصويرها باستخدام إعداد التصوير المستخدم هنا مع منع الخلايا أيضا من استشعار الغطاء الصلب أسفل ال...

Discussion

يتم وصف طريقة محسنة لنمط المواد الهلامية المائية PAA بشكل غير مباشر في هذه الورقة. يعتمد هذا النهج على الأساليب التي تم استخدامها سابقا 20,35,36,37,38,39,40,41,42.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور بول باربون من قسم الهندسة الميكانيكية بجامعة بوسطن على المناقشات المفيدة والمساعدة في تحليل البيانات. تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة NSF CMMI-1910401.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-aminopropyl)trimethoxysilaneSigma Aldrich#281778
1.5 mL Microcentrifuge tubeFisher Scientific#05-408-129
15 mL conical tubeFisher Scientific#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome PhotomaskAdvance Reproductions CorporationN/ACustom-designed mask
6 Well PlatesFisher Scientific#07-200-83
AcetoneFisher Scientific#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%Sigma Aldrich#A4058
AlexaFluor 488Thermo Fisher#A20000
Aminonium PersulfateFisher Scientific#BP179-25
BisacrylamideFisher Scientific#PR-V3141
EthanolGreenfield Global#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm roundFisher Scientifc#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm roundWarner#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 CameraHamamatsu#C10600-10B
Human PlasmaValley Biomedical#HP1051PUsed to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 NMillipore Sigma#1.09057
ImageJWayne Rasband#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish SetBioptechs#190310-35
Kim WipesFisher Scientific#06-666-11C
Mask AlingerKarl Suss#MA6
Matlab 2021Mathworks#R2021a
MetaMorph BasicMolecular Devices#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide esterSigma Aldrich#130672-5G
NucBlue Live Cell StainThermo Fisher#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted MicroscopeOlympus#IX81
PD-10 Desalting ColumnsGE Healthcare#52-1308-00
Photoresist Spinner HoodHeadway Research#PWM32
Plasma CleanerHarrick#PDC-001
Plasma EtcherTePla#M4L
Prior Lumen 200Pro Light SourcePrior Scientific#L200
Silicon Wafers, 100 mmUniversity Wafer#809
SU-8 2005Kayaku Advanced Materials Inc.#NC9463827
SU-8 DeveloperKayaku Advanced Materials Inc.#NC9901158
Sylgard 184 Silicone ElastomerEssex Brownell#DC-184-1.1
TetramethylethylenediamineFisher Scientific#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneSigma Aldrich#448931
UAPON-40XW340 ObjectiveOlympus#N2709300
UV Flood ExposureNewport#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mmTed Pella, Inc.#19395-40

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), 041923 (2008).
  24. . Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249 Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007)
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved