Geração de Padrões para Microscopia de Tração de Micropattern

Resumo

Descrevemos melhorias em um método padrão para medir forças de tração celular, baseado na impressão de microcontatos com uma única etapa de padronização subtrativa de matrizes de pontos de proteínas de matriz extracelular em hidrogéis macios. Este método permite uma fabricação mais simples e consistente dos padrões da ilha, essenciais para controlar a forma do aglomerado celular.

Resumo

Microscopia de tração de micropattern permite o controle da forma de células únicas e aglomerados celulares. Além disso, a capacidade de padronizar na escala de comprimento de micrômetro permite o uso dessas zonas de contato padronizadas para a medição de forças de tração, uma vez que cada ponto micropatterado permite a formação de uma única adesão focal que, em seguida, deforma o hidrogel macio e subjacente. Esta abordagem tem sido usada para uma ampla gama de tipos de células, incluindo células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos, plaquetas e células epiteliais.

Esta revisão descreve a evolução de técnicas que permitem a impressão de proteínas de matriz extracelular em hidrugas de poliacrilamida em uma matriz regular de pontos de tamanho e espaçamento pré-especificados. Como padrões de escala de micrômetros são difíceis de imprimir diretamente em substratos macios, os padrões são primeiro gerados em tampas de vidro rígidas que são então usados para transferir o padrão para o hidrogel durante a gelação. Primeiro, descreve-se a abordagem original de impressão de microcontatos para gerar matrizes de pequenos pontos no deslizamento de tampas. Um segundo passo que remove a maior parte do padrão para deixar ilhas de pequenos pontos é necessário para controlar as formas de células e aglomerados celulares em tais matrizes de pontos padronizados.

Em seguida, uma evolução dessa abordagem que permite a geração de ilhas de pontos usando um único passo de padronização subtrativa é descrita. Essa abordagem é muito simplificada para o usuário, mas tem a desvantagem de uma vida útil reduzida para o molde mestre necessário para fazer os padrões. Finalmente, são descritas as abordagens computacionais desenvolvidas para a análise de imagens de pontos deslocados e campos de tração gerados por células subsequentes, e são fornecidas versões atualizadas desses pacotes de análise.

Introdução

A maioria dos fenótipos celulares exercem forças de tração em seu ambiente. Essas forças de tração são geradas pelo citoesqueleto contractil de uma célula, que é uma rede de actina e miosina, e outros biopolímeros filamentosos e proteínas de crosslinking 1,2,3,4. As forças geradas dentro da célula podem ser transmitidas para o ambiente extracelular ou células adjacentes, principalmente através de proteínas transmembranas, como integrins e cadherinas, respectivamente ^5,6. Como uma célula se espalha ou contrai - e as magnitudes das forças de tração associadas a esses movimentos - é o resultado de uma conversa íntima com seu ambiente, que depende em grande parte do tipo e quantidade de proteína presente na matriz extracelular (ECM)^7,8 e da rigidez do ECM. De fato, a microscopia de força de tração tornou-se uma ferramenta inestimável para entender a resposta celular a estímulos locais, como rigidez de substrato, tensões mecânicas impostas e cepas, ou contato com outras células. Essas informações são diretamente relevantes para a compreensão de doenças como câncer e asma 9,10,11,12.

Um sistema que pode ser usado para medir a deformação induzida pela força de um substrato de propriedades materiais conhecidas é necessário para calcular forças de tração. Essas mudanças devem ser acompanhadas ao longo do tempo, exigindo técnicas de imagem e processamento de imagens. Um dos primeiros métodos utilizados para determinar as forças de tração celular foi a observação e análise da contração de hidrogéis de colágeno semeados com células, embora este método fosse apenas semiquantitativo¹³. Outro método mais refinado foi medir as forças de tração exercidas por células únicas, determinando as forças resultantes da deformação de uma fina folha de silicone¹⁴. Posteriormente, foram desenvolvidas técnicas de medição mais quantitativas, e esses métodos também permitiram o uso de hidrogéis macios, como poliacrilamida (PAA)12,15,16. Ao utilizar esses materiais macios, as forças de tração poderiam ser determinadas a partir do deslocamento induzido pela força de contas deslocadas aleatoriamente embutidas no hidrogel e nas propriedades mecânicas do gel^16,17. Outro avanço veio com o desenvolvimento de matrizes de micropostos feitas de polidimimetilsiloxano macio (PDMS) para que sua deflexão pudesse ser medida e convertida em força usando a teoria do feixe¹⁸.

Finalmente, métodos para micropatterning hidrogéis macios foram desenvolvidos à medida que essas abordagens permitem o controle das áreas de contato para adesão celular. Medindo a deformação do micropattern dentro da área de contato de uma célula, as forças de tração poderiam facilmente ser calculadas porque uma imagem de referência livre de força não é necessária¹⁹. Este método tem sido amplamente adotado, pois permite a padronização indireta de uma matriz regular de pontos de adesão de proteína fluorescente do tamanho de mícrons e discretos em géis PAA para a medição das forças de tração celular²⁰. Para calcular essas forças, um algoritmo de processamento de imagem, que pode rastrear os movimentos de cada ponto micropatterado sem exigir a entrada do usuário, foi desenvolvido²¹.

Embora este método seja simples para criar grades inteiras de padrões de pontos, é mais complicado quando padrões de manchas isoladas (ou ilhas) de pontos são desejados. Ilhas micropatteradas são úteis quando o controle da forma, e até certo ponto do tamanho, de aglomerados de células é necessário. Para criar essas ilhas, o método acima mencionado de impressão de microcontatos requer dois passos distintos: i) usar um selo PDMS para criar um padrão de alta fidelidade de pontos em um deslizamento de cobertura, e então ii) usando um segundo selo PDMS diferente para remover a maioria desses pontos, deixando para trás ilhas isoladas de pontos²¹. A dificuldade em criar ilhas com este método original é agravada pelo fato de que fazer padrões de grade consistentes na primeira etapa do processo é desafiador por si só. Os selos de microimpressão são compostos por uma matriz de micropostos circulares, do qual o diâmetro corresponde ao tamanho do ponto desejado. Esses selos são então revestidos com uma camada uniforme de proteína e, em seguida, estampados com uma quantidade precisa de pressão sobre tampas tratadas para criar o padrão desejado. Por um lado, aplicar muita pressão ao carimbo pode resultar em transferência de proteínas irregulares e má fidelidade de padrões devido à fivela de pilares ou flacidez entre pilares, levando ao contato com o vidro. Por outro lado, aplicar pouca pressão resulta em pouca ou nenhuma transferência de proteínas e má fidelidade padrão. Por essas razões, um processo de transferência que pode ser usado para criar consistentemente micropatters de alta qualidade de ilhas isoladas de pontos em apenas um passo é desejado.

Aqui, um método é descrito para o micropatterning indireto de ilhas de proteína fluorescente do tamanho de mícrons pontos de adesão em um gel PAA que é mais consistente e versátil do que os métodos previamente desenvolvidos. Considerando que os métodos de micropatterning indiretos mais antigos dependem da transferência de padrões proteicos de um selo PDMS para um substrato intermediário, o método introduzido aqui usa selos PDMS em vez disso como um vaso para remoção de proteínas, não adição. Isso é feito primeiro alterando fundamentalmente a estrutura dos selos PDMS utilizados. Em vez de fazer selos compostos de um padrão de pilares circulares espaçados uniformemente, os selos são compostos por um padrão de buracos circulares espaçados uniformemente neste método.

Com esta nova estrutura, a superfície desses selos PDMS pode então ser tratada com glutaraldeído como descrito anteriormente ^20,29,30, tornando o selo capaz de se unir covalentemente com proteína. Quando usados em uma mancha de vidro revestida uniformemente com proteína fluorescente, esses selos PDMS tratados com glutaraldeído são usados para remover a maior parte da proteína na superfície do deslizamento de cobertura, deixando para trás apenas o padrão desejado de pontos pré-determinados pela localização de orifícios do tamanho de mícrons no selo. Essa mudança aumenta a taxa de sucesso para gerar padrões compostos por uma grade quase contínua de pontos e para a criação de ilhas isoladas de pontos em apenas um passo.

Protocolo

1. Criação de mestres do silicone

NOTA: A maior parte do processo de concepção, criação e solução de problemas dos mestres do silício para a repetida moldagem dos selos PDMS foi coberta anteriormente²¹, de modo que apenas diferenças fundamentais nesta nova abordagem serão descritas aqui.

1. Crie o design para a máscara fotográfica usando AutoCAD ou software de design similar. Cubra um lado da máscara fotográfica, um fino pedaço de vidro, com uma fina camada de cromo para controlar a dispersão da luz UV. Desenhe a máscara fotográfica para que a luz UV brilhante através dele até o fotoresist escolhido crie um mestre de silicone com o inverso das características desejadas nos selos PDMS finais. Veja a Figura 1 para o desenho desta máscara.
   NOTA: Se as características desejadas ou a área fora delas devem ser transparentes na máscara de fotomassão depende do fotoresist escolhido. O fotoresist usado aqui é SU-8 2005 (ATENÇÃO: inflamável, irritante de pele e olhos; mantenha-se longe do calor/chamas/faíscas e use luvas de proteção e óculos durante o manuseio), um fotoresist negativo que é capaz de fazer características de 5 μm de altura com paredes laterais quase verticais.
   1. Cure o fotoresist negativo expondo-o à luz UV e removendo o SU-8 não curado com um solvente químico. Portanto, desenhe as características primárias da máscara para ser transparente enquanto a área circundante da máscara é opaca.
   2. Para este novo método de remoção, projete a máscara fotográfica para que seja composta por dois quadrados de 1,5 x 1,5 cm (Figura 1A), um cheio de uma grade uniforme de 2 círculos de 2 μm espaçados 6 μm centro a centro, e outro composto por muitas ilhas quadradas que são versões menores e isoladas desse mesmo padrão de grade (Figura 1B). Faça ilhas dos seguintes tamanhos: 6 x 6 pontos, 12 x 12 pontos, 25 x 25 pontos e 42 x 42 pontos.
      NOTA: O diâmetro dos pontos de adesão (2 μm) foi escolhido com base em estudos anteriores que mediram as forças de tração celular^22,23. A máscara usada aqui é de 101,6 x 101,6 mm e é revestida de um lado com uma camada de 0,06 μm de espessura de cromo, o que é recomendado por causa das pequenas características do mestre. A máscara usada aqui foi encomendada por uma empresa externa de impressão de máscaras.
2. Dentro de uma sala de limpeza, cubra o wafer de silicone escolhido uniformemente com fotoresist. Como um passo opcional, trate a superfície do wafer em um asher de plasma antes de cobri-lo com resistência.
   NOTA: Aqui, são utilizados wafers de 100 mm de diâmetro. O tratamento em um asher de plasma torna o wafer mais favorável à ligação ao SU-8 e ajuda a evitar a delaminação do SU-8 do wafer.
3. Execute as seguintes etapas de acordo com as instruções do fabricante fotoresistista:
   1. Gire o wafer revestido para criar a espessura desejada, variando o tempo de rotação com base na espessura desejada e no tipo de resistência. Para um SU-8 2005 de 5 μm de espessura, divida o programa de spin recomendado nas três etapas seguintes:
      1. Cubra o wafer com fotoresist ao girar a 500 RPM por 10 s com uma rampa de 100 RPM/s.
      2. Reduza a espessura de resistência para cerca de 5 μm girando o wafer a 3.000 RPM com uma rampa de 300 RPM/s para 30 s.
      3. Desacelere lentamente o wafer depois de girar reduzindo a velocidade para 0 RMP com uma rampa de 500 RPM/s para 1 s.
   2. Prepare a resistência para exposição uv, assando-a brevemente em uma placa quente de 95 °C. Modificar o tempo gasto na placa de aquecimento de acordo com a espessura desejada da resistência; O tempo de cozimento é de 2 min para um SU-8 2005 de 5 μm de espessura.
   3. Exponha a resistência à luz UV para curar totalmente as características desejadas. Tenha cuidado com a superexposição, pois isso pode tornar o SU-8 frágil e afetar a qualidade geral do mestre resultante.
      1. Use energia de exposição de 105 mJ/cm² para um SU-8 2005 de 5 μm de espessura. Com base na potência da lâmpada UV disponível, calcule o tempo de exposição dividindo a energia de exposição pela potência da lâmpada em mW.
         NOTA: Como a lâmpada usada aqui tem potência de 8 mW, o tempo de exposição deve ser de 13,1 s.
   4. Para definir as características SU-8 após o desenvolvimento, asse novamente em uma placa quente de 95 °C, desta vez por 3 min. Aguarde que as características desejadas do mestre apareçam dentro de 1 min durante esta etapa de cozimento se a resistência foi exposta corretamente.
   5. Remova o SU-8 nãocurado do wafer de silício usando o desenvolvedor SU-8. Seja minucioso ao remover o SU-8 nãocurado, pois ele pode ficar preso entre as características do tamanho de míccro e espaçadas no wafer.
      ATENÇÃO: O desenvolvedor SU-8 é um irritante de pele e olhos inflamáveis; mantenha-o longe do calor/chamas/faíscas e use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo.
   6. Após o desenvolvimento, enxágue com acetona para remover o excesso do desenvolvedor no wafer e secá-lo completamente com uma pistola de spray de nitrogênio.
      ATENÇÃO: A acetona é uma pele inflamável e irritante para os olhos; mantenha-o longe das chamas/faíscas e use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo.
   7. Opcionalmente, para SU-8 2005, asse em uma placa quente de 200 °C por 10 minutos.
      NOTA: Este cozimento duro adiciona força mecânica ao fotoresist.
4. Depois de ser permitido esfriar, coloque o wafer em uma bandeja de porta-wafers e, em seguida, lançá-lo em PDMS. Primeiro, complete um tratamento de silanização no wafer para tornar as características SU-8 do mestre de silício menos propensas a se ligar ao PDMS e, portanto, menos propensas a serem removidas da superfície do wafer.
   1. Para completar o tratamento de superfície de silanização, coloque o mestre e uma pequena mancha de vidro dentro de um desiccador designado apenas para uso com silanes. Coloque 1-2 pequenas gotas de Trichloro (1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silane no deslizamento de tampa, feche o desiccador e execute-o sob vácuo por 30 minutos a uma pressão de 4.500 Pa²⁴.
      ATENÇÃO: Trichloro (1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silane é uma pele inflamável e irritante para os olhos; mantenha-o longe do calor/chamas/faíscas, use luvas de proteção e óculos durante o manuseio e trabalhe sob um capô de fumaça.
   2. Desligue o vácuo e deixe o mestre e cubra o desiccador por mais 30 minutos.
      NOTA: O mestre está pronto para o casting em PDMS.

2. Impressão subtraída de microcontatos

1. Misture PDMS na razão correta de agente de cura para base com base nas instruções do fabricante. Deixe-o sentar à temperatura ambiente e pressão por 15 minutos; então, degas sob vácuo por 15 minutos.
2. Despeje o PDMS no mestre e coloque-o em uma incubadora definida para 37 °C durante a noite para curar.
3. Remova o mestre da incubadora e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
4. Enquanto o mestre está esfriando, sonicate 25 mm cobre manchas no etanol por 10 minutos. Use tantas tampas quanto o número de selos que estão sendo preparados.
5. Enxágue completamente as tampas de 25 mm com água desionizada (DI) e seque usando uma pistola de ar filtrada.
6. O plasma trata as tampas por 1 min usando um limpador de plasma sob vácuo em alta (potência de radiofrequência de 30 W). Certifique-se de liberar o vácuo lentamente após o tratamento para evitar que as tampas se movam dentro da câmara.
   NOTA: O tratamento plasmátrico da superfície do vidro serve a dois propósitos: limpa a superfície do vidro para remover contaminantes e gera grupos polares à base de oxigênio na superfície do vidro para torná-lo hidrofóbico²⁵. Esta hidroofobidade torna a superfície do vidro mais agradável à ligação proteica.
7. Em uma sala desprovida de luz solar direta/iluminação aérea, cubra cada tampa com 100 μL de solução proteica com rótulo fluorescente a uma concentração de pelo menos 100 μg/mL, cubra para proteção extra contra a luz e deixe-a sentar por 20 minutos.
   NOTA: Aqui, a fibronectina isolada do plasma humano e tingida com AlexaFluor 488 é usada.
   1. Para tingir fibronectina, combine fibronectina sem rótulo de concentração e volume conhecidos com a quantidade apropriada de corante fluorescente em um tubo de 1,5 mL. Cubra o tubo com papel alumínio para proteger o corante da luz e incuba-o à temperatura ambiente por 1h, misturando suavemente a cada 10 minutos girando o tubo de cabeça para baixo 5-10 vezes.
      NOTA: A quantidade de corante necessária varia de acordo com o corante utilizado e a massa de proteína que está sendo utilizada. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para a calculadora usada para determinar a quantidade apropriada de corante para fibronectina rotulada com Alexa 488. De acordo com as instruções do fabricante, o excesso de corante pode ser filtrado com o uso de colunas de desalhante (veja a Tabela de Materiais).
8. Enxágüe cada tampa completamente com água DI, e remova o excesso de água da superfície, tocando suavemente as laterais de cada folha de papel em uma toalha de papel ou material absorvente similarmente. Deixe as tampas descobertas no escuro por pelo menos 30 minutos para permitir que sequem completamente.
9. Enquanto as tampas revestidas de proteína secam, remova o carimbo PDMS do mestre cortando-o com um bisturi ou outra lâmina afiada.
   NOTA: É melhor não tentar cortar o PDMS na primeira tentativa, pois aplicar tanta pressão vai quebrar o wafer de silício e danificar o mestre.
10. O plasma trata os selos PDMS por 2 minutos sob vácuo em alta (potência de radiofrequência de 30 W).
11. Dentro de um capô de fumaça, coloque os selos em um recipiente com tampa e cubra cada carimbo com uma camada muito fina (<100 μL) de 10% (3-aminopropil)trimexisilano (3-APTMS) diluído em 100% etanol.
    ATENÇÃO: 3-APTMS é uma pele inflamável e irritante para os olhos; mantenha-o longe das chamas/faíscas, use luvas de proteção e óculos durante o manuseio e trabalhe sob um capô de fumaça. O revestimento excessivo da solução 3-APTMS fará com que uma filme laranja se forme mais tarde neste processo. Este tratamento de superfície 3-APTMS incorpora a funcionalidade de amina na superfície do selo PDMS, o que permitirá uma maior derivação da superfície do selo mais tarde no^{dia 26}.
12. Cubra o recipiente com os selos e deixe-os sentar em temperatura ambiente por 5 minutos.
13. Usando água DI, enxágue bem cada carimbo em ambos os lados.
14. Coloque os selos em um recipiente limpo e cubra-os liberalmente com 2,5% de glutaraldeído em água DI.
    ATENÇÃO: Glutaraldeído é tóxico; usar luvas de proteção e óculos ao manusear e trabalhar sob um capô de fumaça). Este tratamento de glutaraldeído ao lado do tratamento 3-APTMS anterior fornece funcionalidades de aldeído na superfície dos selos PDMS, que podem reagir com os grupos de amina nas proteínas para criar uma ligação secundária de amina, que é fundamental para o processo de remoção de proteínas²⁷.
15. Cubra os selos, deixe-os sentar em temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, enxágue bem com água DI novamente. Remova o excesso de água da superfície dos selos da mesma forma que as tampas, e permita que os selos sequem descobertos por ~30 min.
16. Depois de 30 min, verifique se as tampas revestidas de proteína e os selos estão secos. Se ambos não estiverem completamente secos, use uma pistola de ar filtrada para secá-las completamente, garantindo que as tampas não sejam expostas à luz por um período prolongado.
17. Uma vez que as tampas e os selos estejam secos, empurre o padrão de selos para baixo nas tampas com pressão suficiente para que os selos entrem em contato total com a superfície do deslizamento de tampas. Deixe os selos em contato com as tampas por 15 minutos.
    NOTA: Devido à ligação covalente entre o carimbo de glutaraldeído com a camada proteica na tampa de vidro - que é muito mais forte do que as fracas interações hidrofóbicas entre a camada proteica e a tampa de vidro - as proteínas devem descascar o vidro de acordo com o padrão no selo PDMS uma vez que ele é removido.
18. Depois de 15 min, descasque cuidadosamente os selos PDMS das tampas.
    NOTA: Se o processo de remoção funcionou corretamente, os selos não devem sair das tampas sem resistência, mas também não devem ser tão firmemente grudado nas tampas que não podem ser removidos sem força excessiva.
19. Verifique a fidelidade das tampas padronizadas usando o filtro apropriado em um microscópio fluorescente (dependendo de qual corante fluorescente as proteínas são marcadas).
20. Use as tampas padronizadas imediatamente ou salve-as e armazene-as longe da luz direta.

3. Deslizamentos de cobertura ativados

NOTA: As tampas inferiores para uso na câmara experimental para géis PAA são feitas nesta etapa. Esta mancha inferior é especialmente tratada para permitir que o gel PAA permaneça firmemente aderido à medida que o deslizamento de cobertura padrão superior é removido durante o processo de padronização. Técnicas semelhantes também são descritas em outros lugares 10,12,15,28.

1. Sonicate 30 mm cobre manchas em 100% etanol por 10 minutos, enxaguar com água DI e, em seguida, completamente seco com uma pistola de ar filtrada. Prepare até 6 tampas por vez por lote em uma placa de 6 poços.
2. O plasma trata as tampas por 1 min no alto (poder de radiofrequência de 30 W) e, em seguida, coloque cada tampa em um poço de uma placa de 6 poços.
3. Cubra cada tampa com uma camada muito fina de 5% de APTMS em etanol em um capô de fumaça.
   NOTA: Um resíduo de laranja se formará em caso de revestimento excessivo neste processo.
4. Cubra a placa de 6 poços e deixe as tampas sentarem por 5 minutos.
5. Enxágüe as tampas (ambos os lados) e o interior de cada poço completamente com água DI e remova o excesso de água dentro dos poços.
6. Coloque as tampas de volta na placa de 6 poços e adicione aproximadamente 2 mL de glutaraldeído de 0,5% em água DI.
7. Cubra a placa de 6 poços e deixe as tampas sentarem-se na solução de glutaraldeído por 30 minutos; em seguida, enxágue bem as tampas e os poços de cada placa com água DI.
8. Armazene as tampas tratadas em água DI dentro das placas de 6 poços por até duas semanas ou use-as imediatamente. Certifique-se de que as tampas estão completamente secas antes de usar.

4. Fabricação de gel PAA e transferência de padrão

NOTA: Uma vez feitas coberturas padronizadas, elas devem ser usadas para transferir esses padrões proteicos para o hidrogel PAA logo depois (<24 h)^1,29,30. A seguinte receita é para um gel PAA com um módulo young de 3,6 kPa. As quantidades de bis-acrilamida, acrilamida e dI podem ser variadas para ajustar a rigidez dos géis PAA¹².

1. Pouco antes de começar a fazer o precursor do hidrogel PAA, remova o ácido acrílico N-hidroxisuccinimida (NHS)-éster da geladeira para que possa atingir a temperatura ambiente antes de ser aberto. Prepare um prato de deslizamento intercambiável, esterilizando-o com 70% de etanol e deixando-o sentar sob luz UV em um armário de biossegurança por pelo menos 30 minutos antes do uso.
   ATENÇÃO: O NHS é uma pele tóxica e irritante para os olhos; use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo, e trabalhe sob um capô de fumaça.
   1. Adicione 1,25 mL de 40% de acrilamida em água DI a um tubo cônico de 15 mL.
      ATENÇÃO: A crilamida é uma pele tóxica e irritante para os olhos; use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo, e trabalhe sob um capô de fumaça.
   2. Adicione 175 μL de solução de bis-acrilamida em água DI ao mesmo tubo (passo 4.1.1).
      ATENÇÃO: Bis-acrilamida é uma pele tóxica e irritante para os olhos; use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo, e trabalhe sob um capô de fumaça.
   3. Adicione 500 μL de salina tamponada com fosfato de 10x (PBS).
      ATENÇÃO: A PBS é um irritante para os olhos; use luvas de proteção e óculos durante o manuseio.
   4. Adicione 2.915 mL de água DI.
2. Pipeta 969 μL deste precursor em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, e armazene o resto a 4 °C por até duas semanas.
3. Meça ~50-100 mg de persulfato de amônio (APS) em outro tubo de microcentrifuuagem e dilui-o em água DI até 100 mg/mL; reserve-o para uso mais tarde. Abra o éster NHS (agora em temperatura ambiente) no capô e meça cuidadosamente até 3 mg de NHS em um tubo de microcentrifuuagem. Diluir o NHS-éster para 1 mg/mL em 1x PBS.
   ATENÇÃO: APS é um irritante de pele e olhos; use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo, e trabalhe sob um capô de fumaça. Tanto o APS quanto o NHS-éster se hidrizarão ao longo do tempo, fazendo com que a atividade dos produtos químicos na solução de estoque varie. Portanto, ambas as soluções devem ser preparadas frescas o tempo todo (ao contrário do resto do precursor).
4. Execute os próximos três passos em um capô de fumaça:
   1. Adicione 2 μL de tetrametetilenodiamina (TEMED) ao tubo de microcentrifusagem contendo a alíquota de 969 μL do precursor de PAA.
      ATENÇÃO: TEMED é uma pele inflamável e irritante para os olhos; mantenha-o longe do calor/chama/faíscas, use luvas de proteção e óculos durante o manuseio e trabalhe sob um capô de fumaça. TEMED é um dos dois agentes de crosslinking críticos para a polimerização do hidrogel PAA, sendo o outro APS.
   2. Adicione 15 μL de ácido clorídrico de 1 M para diminuir o pH da solução de hidrogel e evitar a hidrólise do NHS-éster.
      ATENÇÃO: O ácido clorídrico é uma pele corrosiva e irritante para os olhos; use luvas de proteção e óculos ao manuseá-lo, e trabalhe sob um capô de fumaça.
   3. Adicione 10 μL da solução NHS-ér ao tubo.
      NOTA: O NHS é fundamental para o processo de padronização. Ele reagirá com grupos de amina nas proteínas na tampa padronizada para formar uma ligação de amida estável, o que permitirá que o padrão seja transferido do deslizamento de tampa de vidro para a superfície do gel PAA à medida que polimeriza³¹.
5. Execute estas etapas finais em um gabinete de biossegurança:
   1. Coloque cuidadosamente a tampa de 30 mm dentro da parte metálica do conjunto de pratos de deslizamento (3-APTMS e lado tratado com glutaraldeído) e enrosque o anel de plástico por cima. Configure o deslizamento de cobertura padronizado para que possa ser facilmente alcançado na próxima etapa, ainda protegendo-o da luz tanto quanto possível.
   2. Pipeta 5 μL de solução APS no resto do precursor paa no tubo de microcentrifuuge, inverta-o para misturar e, em seguida, imediatamente pipeta 35 μL dessa solução para o deslizamento de tampa de 30 mm.
   3. Deixe cair o lado da proteína de deslizamento de cobertura padronizada para baixo na solução, tomando cuidado para não criar bolhas de ar no hidrogel. Proteja o hidrogel da luz e deixe polimerizar por 90 minutos.
   4. Uma vez que o hidrogel tenha polimerizado, use uma lâmina de barbear ou bisturi para remover o deslizamento superior, garantindo que o deslizamento não deslize do gel ou caia de volta no gel uma vez que tenha sido removido, pois isso arruinará o padrão na superfície do gel.
      NOTA: Não deixe o gel descoberto em uma área com fluxo de ar significativo (como um armário de biossegurança).
   5. Para passivar qualquer NHS-éster restante no hidrogel, adicione 2 mL de PBS estéril ao gel e incubar a 37 °C por 45 min. Prepare imediatamente os géis para experimentos ou armazene-os durante a noite em PBS estéril a 4 °C até o uso.

5. Imagem

1. Para se preparar para experimentos com células, ligue o calor (37 °C) e a umidade (70%) no microscópio à tarde antes de um experimento planejado para permitir que o equipamento dentro da câmara de microscópio se equilibre até a temperatura mais alta.
   NOTA: Esta etapa minimiza a deriva z causada por flutuações de temperatura.
2. Pouco antes do início do experimento, ligue a fonte de CO₂ da câmara.
3. Para evitar a deriva x-y causada pelo movimento repetido do estágio do microscópio durante o experimento, fixe o conjunto de pratos de deslizamento de cobertura intercambiável segurando o hidrogel semeado por células para o palco com fita dupla face.
4. Olhe sobre o gel para encontrar quadros de interesse para a imagem, salvando cada posição de estágio das seções a serem imagens.
5. Tanto na visão brightfield quanto na visão fluorescente correspondente à proteína rotulada, defina o software de microscópio para visualizar cada quadro uma vez a cada 5 minutos por 2 h.

6. Análise de imagem

NOTA: Foi desenvolvido um sistema que pode medir a deformação dos géis PAA padronizados, determinando a localização dos pontos de tração, interpolando os locais iniciais dos pontos deformados e, em seguida, calculando as forças de tração celular em cada local. Qualquer sistema de software capaz de realizar processamento de imagens e cálculos numéricos pode ser usado. O programa visa determinar rapidamente as forças de tração, eliminando os procedimentos de entrada e pré-processamento do usuário que contribuam para erros relacionados ao usuário. O código usado aqui está disponível aqui como Arquivos Suplementares 2-10, e esses arquivos, juntamente com um par de imagens de prática, podem ser acessados em www.bu.edu/mml/downloads.

1. Em um software de processamento de imagens, abra todas as imagens individuais tiradas durante um experimento timelapse de cada visualização de microscópio usada em ordem, da primeira à última imagem capturada, e transforme-as em uma única pilha de imagens (clicando em Imagem | Pilhas | Imagens para Stack). Certifique-se de que há duas pilhas de imagens separadas: uma da visão de campo brilhante das células e uma da visão fluorescente do padrão ao qual elas estão anexadas.
   1. Se houver deriva nas imagens fluorescentes (ou seja, a ilha de interesse se move na x- e/ou y-direção entre cada quadro por >1-2 μm), primeiro processe a pilha de imagens com o plugin StackReg (P. Thévenaz, Instituto Federal Suíço de Tecnologia lausanne) para recenter cada imagem na pilha com base na posição do primeiro (clicando em Plugins | | StackReg | de tradução OK).
      NOTA: Isso é crítico porque mesmo a deriva sub-μm pode afetar significativamente o cálculo final das forças de tração, especialmente em géis mais rígidos onde esta deriva x-y está fora da faixa de ruído esperado. Este código salvará as imagens após a retirada de deriva, que pode então ser transformada em uma nova pilha de imagens a ser analisada.
2. Insira as pilhas de imagens brilhantes e fluorescentes no CTFTimelapse.m (Arquivo Suplementar 2).
   1. Especifique o diretório de arquivos onde as pilhas de imagens estão localizadas na linha 7.
   2. Nas linhas 8 e 9, especifique os nomes da pilha de imagens fluorescentes e da pilha fluorescente de campo brilhante correspondente, respectivamente.
   3. Especificar rigidez do gel PAA (Pa):
      1. Nas linhas 11-14, que incluem alguns moduli elásticos diferentes de hidrogéis PAA usados com mais frequência, comente (tipo % no início da linha) todos, exceto o módulo elástico do gel nas imagens que estão sendo analisadas. Alternativamente, adicione o módulo elástico se ainda não estiver presente e comente o resto (3658.19 Pa para imagens de teste).
   4. Especifique o raio de ponto (m) na linha 15 (1 × ^10-6 m para imagens de teste).
   5. Especifique o diâmetro máximo possível do ponto (μm) na linha 16 (2,5 μm para imagens de teste).
   6. Especificar a proporção de pixels (μm/pixel):
      1. Nas linhas 17-20, que incluem algumas proporções diferentes de pixels de imagem baseadas em configurações de imagem usadas anteriormente, comente (tipo % no início da linha) todos, exceto a razão de pixels das imagens que estão sendo analisadas. Alternativamente, adicione a relação de pixels usada se ainda não estiver presente e comente o resto (0,1613 μm/pixel para imagens de teste).
   7. Nas linhas 35 e 87, especifique o diretório de arquivos onde estão localizados os arquivos necessários de processamento de imagens.
      NOTA: A partir da pilha de imagens fluorescentes, o código determina a localização de cada ponto fluorescente e rastreia o movimento de cada ponto entre cada imagem na pilha²⁰. A posição inicial dos pontos impressos do microcontato é conhecida porque eles não se deformam quando devidamente transferidos para o hidrogel³².
3. Aguarde que dois números e uma caixa de diálogo apareçam assim que o programa encontrar os pontos. Use a Figura 1 para garantir que o programa tenha encontrado os pontos corretos e não encontrou muitos pontos onde não havia nenhum. Use a Figura 2 para escolher a grade retangular que ajuda o programa a localizar e calcular as forças de tração celular.
   NOTA: A Figura 1 é a imagem de campo brilhante da célula com os pontos encontrados pelo programa (que será vermelho) sobreposto sobre ele (ver Figura 3A). Figura 2 é uma imagem que exibe os mesmos pontos mostrados na Figura 1 , mas sem a imagem de campo brilhante no fundo.
   1. Aguarde que a caixa de diálogo pressione "Enter" após a seleção do ponto- em que cada ponto é um dos pontos vermelhos encontrados pelo programa e tem um botão grande dentro do seu rótulo Enter.
   2. Escolha quatro pontos diferentes na Figura 2 para criar uma grade retangular ao redor e incluindo a célula/cluster nesse padrão. Selecione cada ponto um por um com um clique esquerdo do mouse e confirme-o pressionando Enter on the button in thementionedmentioned dialog box. Mantenha a contagem de quantos pontos estão entre o primeiro e o segundo ponto, bem como o primeiro e o terceiro ponto, pois o programa pedirá esses valores uma vez que todos os pontos de quatro cantos tenham sido selecionados. Digite esses valores na janela de comando (digite o número de pontos e clique no botão enter no teclado quando solicitado).
4. Uma vez escolhida a grade retangular, aguarde que o script calcule as forças de tração que ele encontra dentro da grade com base nos locais dos pontos fluorescentes. Observe que o script primeiro encontra o vetor de deslocamento (u) do centro geométrico de cada ponto e, em seguida, calcula o vetor de força de tração correspondente (F) usando Eq (1):
   (1)
   Onde E é o módulo do Young do substrato PAA, um é o raio dos marcadores de ponto fluorescente, e ν é a razão de Poisson do substrato PAA³². Eq (1) assume que o substrato é um infinito meio espaço elástico elástico, que as forças de tração são aplicadas no centro de cada marcador de ponto circular, e que o espaçamento entre os marcadores de ponto é suficientemente grande para que seus respectivos deslocamentos não interajam entre si²³.
   NOTA: Nos experimentos aqui descritos, são utilizados marcadores de ponto de raio a = 1 μm e espaçamento de 6 μm centro-centro. As setas de força de tração dentro da célula/aglomerado apontando para dentro em direção ao centro da célula devem estar presentes, enquanto a área fora da célula/cluster não deve ter setas de tração presentes (ver Figura 3C-E). Setas de tração apontando para fora de dentro da célula/cluster ou muitas grandes setas de tração presentes fora da célula são indicativas de uma grade retangular mal escolhida.
5. Uma vez que o campo de tração correto seja encontrado, selecione uma região de interesse apropriada (ROI) ao redor da célula/cluster, que inclui todas as setas de tração dentro da célula usando o cursor.
   1. Para desenhar o ROI, clique à esquerda quantas vezes for necessário para desenhar uma forma de polígono com o máximo de lados desejado, ajuste a forma ou mova o ROI depois de desenhado pelo clique esquerdo nos cantos ou bordas, respectivamente. Uma vez que o ROI é desenhado, clique duplo à esquerda para passar para a próxima imagem na pilha. Repita isso para todas as imagens na pilha brightfield.
      NOTA: O código economizará dados de força de tração e deslocamento para cada ponto de tempo na mesma pasta que as pilhas de imagens originais, que podem então ser analisadas mais adiante.

Resultados

Os hidrogéis PAA com o módulo young de E = 3,6 kPa e a razão de Poisson de ν = 0,445 foram feitos para uso por este método de micropatterning subtrativo. Os hidrogéis foram feitos para ter ~100 μm de espessura, o que permite que eles sejam imagens com a configuração de imagem usada aqui, ao mesmo tempo em que impedem que as células desenham o deslizamento rígido abaixo do gel, o que causaria problemas em estudos focados na rigidez celular dessensibilizando^23,33

Discussão

Um método aprimorado de padronização indireta de hidrogéis PAA é descrito neste artigo. Essa abordagem baseia-se em métodos que já foram utilizados anteriormente 20,35,36,37,38,39,40,41,42. A principal mudança é q...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40