A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
إن عدوى Caenorhabditis elegans بواسطة الطفيلي المجهري Nematocida parisii تمكن الديدان من إنتاج ذرية شديدة المقاومة لنفس العامل الممرض. هذا مثال على المناعة الموروثة ، وهي ظاهرة جينية غير مفهومة جيدا. يصف هذا البروتوكول دراسة المناعة الموروثة في نموذج دودة قابلة للسحب وراثيا.
تصف المناعة الموروثة كيف يمكن لبعض الحيوانات أن تنقل "ذاكرة" عدوى سابقة إلى ذريتها. هذا يمكن أن يعزز مقاومة مسببات الأمراض في ذريتهم ويعزز البقاء على قيد الحياة. في حين تم الإبلاغ عن المناعة الموروثة في العديد من اللافقاريات ، فإن الآليات الكامنة وراء هذه الظاهرة اللاجينية غير معروفة إلى حد كبير. تؤدي عدوى Caenorhabditis elegans بواسطة العامل الممرض الطبيعي Nematocida parisii إلى إنتاج الديدان ذرية مقاومة بقوة ل microsporidia. يصف هذا البروتوكول دراسة المناعة بين الأجيال في نموذج عدوى N. parisii -C. elegans البسيط والوراثي. تصف المقالة الحالية طرق إصابة C. elegans وتوليد ذرية مناعية. يتم إعطاء طرق أيضا لفحص مقاومة عدوى microsporidia عن طريق تلطيخ microsporidia وتصور العدوى عن طريق الفحص المجهري. على وجه الخصوص ، تمنع المناعة الموروثة غزو الخلايا المضيفة بواسطة microsporidia ، ويمكن استخدام التهجين الفلوري في الموقع (FISH) لتحديد أحداث الغزو. يمكن تحديد الكمية النسبية من جراثيم microsporidia المنتجة في النسل المناعي عن طريق تلطيخ الجراثيم بصبغة ملزمة للكيتين. حتى الآن ، ألقت هذه الطرق الضوء على الحركية وخصوصية مسببات الأمراض للمناعة الموروثة ، وكذلك الآليات الجزيئية الكامنة وراءها. هذه التقنيات ، إلى جانب الأدوات الواسعة المتاحة لأبحاث C. elegans ، ستمكن من اكتشافات مهمة في مجال المناعة الموروثة.
المناعة الموروثة هي ظاهرة جينية حيث يمكن أن يؤدي تعرض الوالدين لمسببات الأمراض إلى تمكين إنتاج ذرية مقاومة للعدوى. وقد ظهر هذا النوع من الذاكرة المناعية في العديد من اللافقاريات التي تفتقر إلى أجهزة المناعة التكيفية ويمكن أن تحمي من الأمراض الفيروسية والبكتيرية والفطرية1. في حين أن المناعة الموروثة لها آثار مهمة على فهم كل من الصحة والتطور ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الحماية غير معروفة إلى حد كبير. ويرجع ذلك جزئيا إلى أن العديد من الحيوانات التي وصفت فيها المناعة الموروثة ليست كائنات حية نموذجية راسخة للبحث. وعلى النقيض من ذلك، تستفيد الدراسات التي أجريت على الديدان الخيطية الشفافة Caenorhabditis elegans من مجموعة أدوات وراثية وكيميائية حيوية واسعة النطاق2،3، وجينوم مشروح للغاية4،5، ووقت جيل قصير. في الواقع ، مكنت الأبحاث في C. elegans من تحقيق تقدم أساسي في مجالات علم الوراثة اللاجينية والمناعة الفطرية 6,7 ، وهي الآن نموذج راسخ لدراسة الذاكرة المناعية 8,9.
Microsporidia هي مسببات الأمراض الفطرية التي تصيب جميع الحيوانات تقريبا وتسبب التهابات قاتلة في البشر الذين يعانون من نقص المناعة10. تبدأ العدوى عندما يحقن بوغ microsporidia أو "يطلق" محتوياته الخلوية (sporoplasm) في خلية مضيفة باستخدام بنية تسمى الأنبوب القطبي. يؤدي التكرار داخل الخلايا للطفيلي إلى تكوين ميرونتس ، والتي تتمايز في النهاية إلى جراثيم ناضجة يمكنها الخروج من الخلية11,12. في حين أن هذه الطفيليات ضارة بصحة الإنسان والأمن الغذائي ، لا يزال هناك الكثير لتعلمه عن بيولوجيا العدوى12. Nematocida parisii هو طفيلي ميكروسبوريديان طبيعي يتكاثر حصريا في الخلايا المعوية للديدان ، مما يؤدي إلى انخفاض الخصوبة ، وفي النهاية ، الموت. تم استخدام نموذج عدوى N. parisii -C. elegans لإظهار: (1) دور الالتهام الذاتي في إزالة مسببات الأمراض13 ، (2) كيف يمكن ل microsporidia الخروج من الخلايا المصابة بشكل غير منطقي 14 ، (3) كيف يمكن لمسببات الأمراض أن تنتشر من خلية إلى أخرى عن طريق تشكيل syncytia 15 ، (4) البروتينات N. parisii تستخدمها للتفاعل مع مضيفها 16 ، و (5) تنظيم استجابة مسببات الأمراض داخل الخلايا النسخية (IPR) 17 ، 18.
يتم وصف بروتوكولات عدوى C. elegans في العمل الحالي ويمكن استخدامها للكشف عن بيولوجيا microsporidia الفريدة وتشريح استجابة المضيف للعدوى. يظهر الفحص المجهري للديدان الثابتة الملطخة بصبغة ربط الكيتين Direct Yellow 96 (DY96) انتشار العدوى لجراثيم microsporidia المحتوية على الكيتين في جميع أنحاء الأمعاء. كما يتيح تلطيخ DY96 تصور أجنة الدودة المحتوية على الكيتين للتقييم المتزامن لجاذبية الدودة (القدرة على إنتاج الأجنة) كقراءة للياقة البدنية للمضيف.
وقد كشفت الأبحاث الحديثة أن C. elegans المصابة ب N. parisii تنتج ذرية مقاومة بقوة لنفس العدوى19. تستمر هذه المناعة الموروثة جيلا واحدا وتعتمد على الجرعة ، حيث أن النسل من الآباء المصابين بشدة أكثر مقاومة للميكروسبوريديا. ومن المثير للاهتمام ، أن النسل الجاهز ل N. parisii هو أيضا أكثر مقاومة لمسببات الأمراض المعوية البكتيرية Pseudomonas aeruginosa ، على الرغم من أنها ليست محمية ضد الممرض الطبيعي Orsay virus19. يظهر العمل الحالي أيضا أن النسل المناعي يحد من غزو الخلايا المضيفة بواسطة microsporidia. تصف الطريقة أيضا جمع النسل المناعي وكيف يمكن استخدام FISH للكشف عن الحمض النووي الريبي N. parisii في الخلايا المعوية لفحص غزو الخلايا المضيفة وإطلاق الجراثيم20.
معا ، توفر هذه البروتوكولات أساسا متينا لدراسة microsporidia والمناعة الموروثة في C. elegans. ومن المأمول فيه أن يتيح العمل المستقبلي في هذا النظام النموذجي اكتشافات هامة في مجال المناعة الموروثة الوليد. ومن المرجح أيضا أن تكون هذه التقنيات نقاط انطلاق للتحقيق في المناعة الموروثة التي يسببها الميكروسبوريديا في الكائنات الحية المضيفة الأخرى.
تستخدم هذه الدراسة سلالة C. elegans Bristol من النوع البري N2 التي تزرع عند 21 درجة مئوية.
1. إعداد وسائل الإعلام
2. صيانة C. elegans
3. تزامن مجموعات C. elegans باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم (التبييض)
ملاحظة: هذه الخطوة حساسة جدا للوقت، لذا تأكد من توفر جهاز الطرد المركزي قبل البدء. تتوفر بروتوكولات تبييض بديلة أقل سرعة في الأدبيات ويمكن استخدامها إذا كنت تفضل ذلك. لمنع 6٪ هيبوكلوريت الصوديوم من فقدان النشاط مع مرور الوقت ، قم بتخزين الكاشف في الظلام عند 4 درجات مئوية واحتفظ به لمدة تصل إلى 1 سنة.
4. إعداد جراثيم N. parisii
5. عدوى C. elegans مع N. parisii لإنتاج ذرية مهيأة للمناعة
6. اختبار المناعة الموروثة ضد N. parisii في C. elegans
7. DY96 تلطيخ C. elegans لتصور الأجنة وجراثيم microsporidia
ملاحظة: DY96 عبارة عن صبغة فلورسنت خضراء ملزمة بالكيتين تلطخ أجنة الدودة وجدران بوغ microsporidia19،15،25. هذا يسمح بالمراقبة المتزامنة للياقة البدنية وحالة العدوى للديدان.
8. تصوير وتحليل الديدان الملطخة ب DY96 لتقييم لياقة الدودة وحالة العدوى
9. فحص FISH لتقييم غزو C. elegans بواسطة microsporidia وإطلاق بوغ
ملاحظة: يتعرف مسبار MicroB FISH على منطقة محفوظة من الحمض النووي الريبوزي المرسال 18s ويمكن استخدامه لتسمية الجراثيم داخل الخلايا (أي الخلايا المضيفة الغازية) والمادة الوراثية داخل الجراثيم.
في هذه الدراسة ، أصيب السكان الأبوون من C. elegans (P0) في مرحلة L1 بجرعة منخفضة من جراثيم N. parisii. عادة ما تستخدم حالات العدوى هذه للحصول على أعداد كبيرة من ذرية F1 المقاومة للميكروسبوريديا من خلال تبييض الوالدين. تم تثبيت السكان الأبوين المصابين والضوابط غير المصابة عند 72 hpi وملطخة ب DY96 ل?...
يصف هذا البروتوكول دراسة microsporidia والمناعة الموروثة في نموذج عدوى N. parisii -C. elegans بسيط وقابل للسحب وراثيا.
إعداد بوغ هو بروتوكول مكثف ينتج عادة ما يكفي من الجراثيم لمدة 6 أشهر من التجارب ، اعتمادا على الإنتاجية24. الأهم من ذلك ، يجب تحديد العدوى لكل "الكثير" ...
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
نحن ممتنون لويني جاو وين تشن وان لتقديمهما تعليقات مفيدة على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (المنحة رقم 522691522691).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
Axio Imager 2 | Zeiss | - | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | - | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | - | |
Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | - | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | - | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved