Studio dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da microsporidi di Caenorhabditis elegans

Riepilogo

L'infezione di Caenorhabditis elegans da parte del parassita microsporidiano Nematocida parisii consente ai vermi di produrre prole altamente resistente allo stesso agente patogeno. Questo è un esempio di immunità ereditaria, un fenomeno epigenetico poco compreso. Il presente protocollo descrive lo studio dell'immunità ereditaria in un modello di verme geneticamente trattabile.

Abstract

L'immunità ereditaria descrive come alcuni animali possono trasmettere la "memoria" di una precedente infezione alla loro prole. Questo può aumentare la resistenza agli agenti patogeni nella loro progenie e promuovere la sopravvivenza. Mentre l'immunità ereditaria è stata riportata in molti invertebrati, i meccanismi alla base di questo fenomeno epigenetico sono in gran parte sconosciuti. L'infezione di Caenorhabditis elegans da parte del patogeno microsporidico naturale Nematocida parisii provoca la produzione di vermi che sono robustamente resistenti ai microsporidi. Il presente protocollo descrive lo studio dell'immunità intergenerazionale nel modello di infezione da N. parisii -C. elegans semplice e geneticamente trattabile. L'articolo attuale descrive i metodi per infettare C. elegans e generare prole immuno-innescata. Vengono inoltre forniti metodi per valutare la resistenza all'infezione da microsporidi mediante colorazione per microsporidi e visualizzazione dell'infezione al microscopio. In particolare, l'immunità ereditaria previene l'invasione delle cellule ospiti da parte dei microsporidi e l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) può essere utilizzata per quantificare gli eventi di invasione. La quantità relativa di spore di microsporidi prodotte nella prole immuno-innescata può essere quantificata colorando le spore con un colorante che lega la chitina. Ad oggi, questi metodi hanno fatto luce sulla cinetica e sulla specificità patogena dell'immunità ereditaria, nonché sui meccanismi molecolari alla base. Queste tecniche, insieme agli ampi strumenti disponibili per la ricerca su C. elegans , consentiranno importanti scoperte nel campo dell'immunità ereditaria.

Introduzione

L'immunità ereditaria è un fenomeno epigenetico in cui l'esposizione dei genitori agli agenti patogeni può consentire la produzione di prole resistente alle infezioni. Questo tipo di memoria immunitaria è stato dimostrato in molti invertebrati che mancano di sistema immunitario adattativo e possono proteggere dalle malattie virali, batteriche e fungine¹. Mentre l'immunità ereditaria ha importanti implicazioni per la comprensione sia della salute che dell'evoluzione, i meccanismi molecolari alla base di questa protezione sono in gran parte sconosciuti. Ciò è in parte dovuto al fatto che molti degli animali in cui è stata descritta l'immunità ere....

Protocollo

Il presente studio utilizza il ceppo N2 wild-type C. elegans Bristol coltivato a 21 °C.

1. Preparazione dei media

1. Preparare i media M9 come da rapporto precedente^21,22.
2. Preparare il mezzo di crescita dei nematodi (NGM) come da precedente rapporto^21,22. Versare 12 ml di NGM per piastra da 6 cm o 30 ml per piastra da 10 cm.
3. Preparare il ceppo di Escherichia coli OP50-1 come da un precedente rapporto²³.
4. Preparare le piastre NGM co....

Risultati

Nel presente studio, le popolazioni parentali di C. elegans (P0) sono state infettate allo stadio L1 con una bassa dose di spore di N. parisii . Queste condizioni di infezione sono tipicamente utilizzate per ottenere un numero elevato di progenie F1 resistente ai microsporidi attraverso lo sbiancamento dei genitori. Le popolazioni parentali infette e i controlli non infetti sono stati fissati a 72 hpi e colorati con DY96 per visualizzare gli embrioni di vermi e le spore di microsporidi (

Discussione

Il presente protocollo descrive lo studio dei microsporidi e dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da N. parisii -C. elegans semplice e geneticamente trattabile.

La preparazione delle spore è un protocollo intensivo che in genere produce abbastanza spore per 6 mesi di esperimenti, a seconda della produttività²⁴. È importante sottolineare che l'infettività deve essere determinata per ogni nuovo "lotto" di spore prima di utilizzarlo pe.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0 mm zirconia beads	Biospec Products Inc.	11079124ZX
10 mL syringe	Fisher Scientific	1482613
5 μm filter	Millipore Sigma	SLSV025LS
Axio Imager 2	Zeiss	-	Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides
Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope	Zeiss	-	For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench	Baker	-
Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V	Global Industrial	T9FB893150
Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers	Fisher Scientific	DRM600
Direct Yellow 96	Sigma-Aldrich	S472409-1G
EverBrite Mounting Medium with DAPI	Biotium	23001
EverBrite Mounting Medium without DAPI	Biotium	23002
Fiji/ImageJ software	ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Mechanical rotor	Thermo Sceintific	415110 / 1834090806873	Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching
MicroB FISH probe	Biosearch Technologies Inc.	-	Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2	Wild-type, Bristol strain	Default strain	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771-100G
Sodium hydroxide solution (5 N)	Fisher Chemical	FLSS256500
Sodium hypochlorite solution (6%)	Fisher Chemical	SS290-1
Stemi 508 Stereo Microscope	Zeiss	-	For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379-100ML
Vectashield + A16	Biolynx	VECTH1500