تقييم الحساسية الميكانيكية للظهر في الفئران للتحقيق الميكانيكي لآلام الظهر المزمنة

Summary

لتطوير تدخلات علاجية جديدة للوقاية من آلام الظهر وإدارتها ، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية لفحص آليات وفعالية هذه العلاجات من منظور متعدي. يصف هذا البروتوكول اختبار BMS ، وهي طريقة موحدة لتقييم الحساسية الميكانيكية للظهر في الفئران.

Abstract

آلام أسفل الظهر هي السبب الرئيسي للإعاقة في جميع أنحاء العالم ، مع عواقب شخصية واقتصادية واجتماعية دراماتيكية. لتطوير علاجات جديدة ، هناك حاجة إلى نماذج حيوانية لدراسة آليات وفعالية العلاجات الجديدة من منظور متعدي. يتم استخدام العديد من نماذج القوارض من آلام الظهر في التحقيقات الحالية. ومع ذلك ، من المثير للدهشة أنه لم يتم التحقق من صحة أي اختبار سلوكي موحد لتقييم الحساسية الميكانيكية في نماذج آلام الظهر. هذا أمر بالغ الأهمية لتأكيد أن الحيوانات التي تعاني من آلام الظهر المفترضة تقدم فرط الحساسية المحلية لمحفزات مسبب للألم ، ولمراقبة الحساسية أثناء التدخلات المصممة لتخفيف آلام الظهر. الهدف من هذه الدراسة هو وضع اختبار بسيط ويمكن الوصول إليه لتقييم الحساسية الميكانيكية في الجزء الخلفي من الفئران. تم تصنيع قفص اختبار خصيصا لهذه الطريقة. الطول × العرض × الارتفاع: 50 × 20 × 7 سم ، مع وجود شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ في الأعلى. يسمح قفص الاختبار هذا بتطبيق المحفزات الميكانيكية على الظهر. لإجراء الاختبار ، يتم حلق الجزء الخلفي من الحيوان في المنطقة محل الاهتمام ، ويتم وضع علامة على منطقة الاختبار لتكرار الاختبار في أيام مختلفة ، حسب الحاجة. يتم تحديد العتبة الميكانيكية باستخدام خيوط Von Frey المطبقة على العضلات المجاورة للعمود الفقري ، باستخدام طريقة أعلى لأسفل الموضحة سابقا. تشمل الاستجابات الإيجابية (1) ارتعاش العضلات ، (2) التقوس (تمديد الظهر) ، (3) دوران الرقبة (4) خدش أو لعق الظهر ، و (5) الهروب. هذا الاختبار السلوكي (اختبار الحساسية الميكانيكية للظهر (BMS)) مفيد للبحث الميكانيكي مع نماذج القوارض لآلام الظهر لتطوير التدخلات العلاجية للوقاية من آلام الظهر وإدارتها.

Introduction

آلام أسفل الظهر (LBP) هي السبب الرئيسي للإعاقة في جميع أنحاء العالم ، والتي لها عواقب شخصية واقتصادية واجتماعية دراماتيكية¹،^2،3،4. كل عام ، يتأثر حوالي 37٪ من السكان ب⁵ ليرة لبنانية. عادة ما يتم حل LBP في غضون أسابيع قليلة ولكنه يتكرر في 24٪ -33٪ من الأفراد ، ويصبح مزمنا في 5٪ -10٪ من الحالات². لفهم آليات وتأثيرات LBP وكذلك آثار التدخلات العلاجية المختلفة ، تم استخدام العديد من النماذج الحيوانية من LBP ، تحاكي الحالات السريرية أو بعض مكونات LBP⁶. يمكن تصنيف نماذج الفئران والجرذان هذه في واحدة أو أكثر من الفئات التالية: (1) الليرة اللبنانية القرصية 7^،8،، (2) الليرة اللبنانية^{الجذرية 8}،⁹،10،11، (3) هشاشة العظام في مفصل الوجه 12، و (4)^الليرة اللبنانية^13،14 التي تسببها العضلات . نظرا لأنه لا يمكن قياس الألم مباشرة في الأنواع غير البشرية ، فقد تم تطوير العديد من الاختبارات لتحديد السلوكيات الشبيهة بالألم في هذه النماذج⁸. تقيم هذه الاختبارات السلوكيات التي يثيرها حافز ضار (القوة الميكانيكية 15،16،17 ، التحفيز الحراري 18،¹⁹،20،21،22،23،24،²⁵) أو تنتج تلقائيا ²⁶،²⁷،^28،29.

تشمل الطرق التي تستخدم المحفزات الميكانيكية اختبار Von Frey ^15,16 واختبار Randall-Selitto¹⁷. تشمل الطرق التي تستخدم المحفزات الحرارية اختبار نفض الغبار عن الذيل¹⁸ ، واختبار الصفيحة الساخنة¹⁹ ، واختبار هارجريفز²⁰ ، واختبار المسبار الحراري²¹. تشمل الطرق التي تستخدم المنبهات الباردة اختبار اللوحة الباردة²² ، واختبار تبخر الأسيتون 23 ، والفحص الأخمصي البارد²⁴. تشمل طرق السلوكيات العفوية مقاييس التجهم 26 ، والحفر²⁷ ، وتحليل حمل الوزن والمشي 28 ، بالإضافة إلى التحليل السلوكي الآلي²⁹. على الرغم من هذه الاختبارات العديدة المتاحة ، لم يتم تصميم أي منها خصيصا لنماذج آلام الظهر.

الهدف من هذه الدراسة هو وضع اختبار بسيط ويمكن الوصول إليه لتقييم الحساسية الميكانيكية في الجزء الخلفي من الفئران. تعتمد هذه التقنية إلى حد كبير على اختبار Von Frey المطبق على السطح الأخمصي للمخلب الخلفي^15,16. المبدأ الأساسي لاختبار Von Frey هو استخدام سلسلة من الشعيرات الأحادية إلى المنطقة ذات الاهتمام ، مما يوفر قوى ثابتة محددة مسبقا. تعتبر الاستجابة إيجابية إذا أظهر الجرذ سلوكا مسببا. يمكن بعد ذلك حساب العتبة الميكانيكية بناء على الخيوط التي أثارت استجابات. في هذه الدراسة ، يتم توفير طريقة بسيطة ويمكن الوصول إليها مقتبسة من اختبار Von Frey لتحديد الحساسية الميكانيكية في الجزء الخلفي من الفئران.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل لجنة رعاية الحيوان بجامعة كيبيك في تروا ريفيير ويتوافق مع المبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوان والمبادئ التوجيهية للجنة البحوث والقضايا الأخلاقية التابعة للجمعية الدولية لدراسة الألم (IASP). استخدمت الدراسة الحالية ستة ذكور من فئران Wistar (وزن الجسم: 320-450 جم ؛ العمر: 18-22 أسبوعا). تم الحصول على الحيوانات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). البيانات من هذه الفئران مأخوذة من عينة أكبر من دراسة سابقة³⁰.

1. التحضير التجريبي

1. إيواء الحيوانات في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها في مرافق الحيوانات القياسية مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء حسب الطلب ودورة الضوء والظلام من 14 ساعة إلى 10 ساعات. تأكد من أن جميع الحيوانات بصحة جيدة في يوم التجارب.
2. قم بإنشاء نموذج حيواني لآلام الظهر المزمنة باتباع الخطوات أدناه.
   1. للحث على آلام الظهر المزمنة ، قم بإجراء الحقن العضلي لمساعد فرويند الكامل (CFA) في عضلات الظهر بعد التقارير السابقة¹⁴،^30،31.
   2. تخدير الحيوان باستخدام الأيزوفلوران (4٪ للحث و 2٪ -2.5٪ للصيانة).
   3. باستخدام إبرة 27 G ، قم بحقن 150 ميكرولتر من مستحلب الماء في الزيت الجاهز للاستخدام من CFA (انظر جدول المواد) في العضلات المجاورة للعمود الفقري من جانب واحد أو ثنائي ، اعتمادا على احتياجات البروتوكول.
   4. احتفظ بإبرة الحقن في مكانها لمدة 3 دقائق على الأقل بعد الانتهاء من الحقن. بالنسبة للحيوانات في المجموعة الضابطة ، استخدم نفس الإجراءات³⁰ ، ولكن حقن محلول ملحي فسيولوجي معقم (150 ميكرولتر ، 0.9٪) بدلا من CFA.
3. تلفيق قفص الاختبار.
   1. اصنع قفص اختبار لحيوانين يتكون من غرفة واحدة لكل.
      ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية، لكل غرفة الأبعاد التالية: الطول × العرض × الارتفاع: 50 × 20 × 7 سم (انظر جدول المواد).
   2. قم بتركيب الغرفتين المتجاورة على أربعة أرجل زجاجية بطول 33 سم. استخدم زجاج شبكي شفاف لجدران الغرف ، ولكن استخدم زجاج شبكي أسود لفصل الغرف لمنع الحيوانات من رؤية بعضها البعض.
   3. استخدم شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ مصنوعة من سلك 1 مم بمسافة 8 مم بين الأسلاك لعمل أرضية وسقف قفص الاختبار (الشكل 1).

2. اختبار الحساسية الميكانيكية الخلفية (BMS)

1. تعرف الحيوان على قفص الاختبار لمدة 30 دقيقة / يوم لمدة 5-7 أيام متتالية قبل الاختبار الأول. كرر الاختبار حسب الحاجة.
2. تخدير الحيوانات باستخدام 2٪ إيزوفلوران³¹ (انظر جدول المواد).
3. في وضعية الانبطاح تحت تخدير الأيزوفلوران ، احلق الشعر الخلفي للمنطقة محل الاهتمام (من مستويات العمود الفقري T6 إلى L6) باستخدام أداة تشذيب شعر الحيوان (انظر جدول المواد). للتدابير المتكررة ، احلق شعر الظهر كل 3 أيام في اليوم دون تقييم سلوكي لضمان تطبيق المحفزات دائما مباشرة على الجلد. ارسم علامة سوداء على الجلد بعلامة دائمة للتأكد من أن الخيوط يتم تطبيقها دائما على نفس المنطقة عند تكرار الاختبار في أيام مختلفة.
4. في يوم الاختبار ، ضع الحيوانات في قفص الاختبار لمدة 15-30 دقيقة قبل الاختبار حتى يهدأ الحيوان.
5. أثناء الاختبار ، ضع خيوط Von Frey (0.07 ، 0.16 ، 0.4 ، 0.6 ، 1 ، 2 ، 4 ، 6 ، 10 ، 15 ، و 26 جم) بشكل عمودي على الظهر ، مع البدء دائما بخيوط 2 g واستخدام طريقة أعلى لأسفل¹⁵ (انظر جدول المواد). اقترب من الجزء الخلفي من الحيوان ببطء مع خيوط من وراء الحيوان.
   1. ضع الفتيل فقط عندما يكون الحيوان مستيقظا ، ويقف على مخالبه الأربعة ، ولا يتحرك. ضع الفتيل لمدة 2 ثانية بشكل ثنائي على منطقة الاهتمام ، 10 مم من العملية الشائكة (الشكل 2) ، كل 15-30 ثانية.
      ملاحظة: تعتبر الاستجابة إيجابية إذا أظهر الحيوان واحدا أو أكثر من السلوكيات التالية أثناء أو بعد تطبيق الفتيل مباشرة: (1) ارتعاش العضلات ، (2) التقوس (تمديد الظهر) ، (3) دوران الرقبة للنظر إلى الظهر ، (4) خدش أو لعق الظهر ، و (5) الهروب.
6. كما هو موضح سابقا¹⁵ ، إذا لم يلاحظ أي استجابة مع تطبيق خيوط ، فقم بتطبيق الفتيل التالي بقوة أعلى في السلسلة. إذا لوحظت استجابة ، فاستخدم الفتيل التالي بقوة أقل في السلسلة. استمر في هذا الإجراء حتى يتم الحصول على أربع قراءات بعد التغيير السلوكي الأول (الاستجابة بعد سلسلة من "عدم الاستجابة" أو عدم الاستجابة بعد سلسلة من "الاستجابة").
7. بمجرد اكتمال جمع البيانات ، احسب القيمة التي تمثل 50٪ من العتبة الميكانيكية ، كما هو موضح بواسطة Chaplan et ^al.15 ، باستخدام هذه الصيغة:
   عتبة 50٪ (ز) = 10 ^{(Xf + kδ)} / 10000
   ملاحظة: في هذه الصيغة، "Xf" هي علامة المقبض لخيوط فون فراي الأخيرة التي تم استخدامها. "k" هي القيمة الجدولية بناء على نمط استجابة الحيوان¹⁵ ، و "δ" هو متوسط زيادات Handle Mark بين خيوط Von Frey. اعتمادا على التصميم التجريبي والاحتياجات التجريبية ، يمكن تقييم جانب واحد فقط من العمود الفقري للإبلاغ عن عتبة واحدة ، أو قد يتم تقييم جانبين ، ويتم الإبلاغ عن العتبات بشكل منفصل أو كمتوسط. راجع الجدول التكميلي 1 للاطلاع على نموذج الحساب³².

3. استعادة الحيوانات

1. بعد اكتمال الحقن العضلي ، توقف عن التخدير وضع الحيوان بمفرده في قفص سكني قياسي للتعافي.
2. خلال فترة الشفاء ، افحص سلوك الحيوان ولا تتركه دون مراقبة.
3. تأكد من أن الحيوان يتعافى من التخدير ويتحرك بشكل طبيعي في غضون 5 دقائق. ثم أعد الحيوان إلى قفصه السكني المعتاد مع الحيوانات الأخرى.
   ملاحظة: في نهاية التجربة ، يتم اختراق الحيوان من خلال القلب بمحلول فورمالين بنسبة 10٪ ، تحت تخدير إيزوفلوران عميق (5٪). ثم يتم استخراج عضلات الظهر في المنطقة المحقونة للأنسجة وتأكيد التغيرات الالتهابية.

النتائج

تم استخدام الطريقة في دراسة سابقة ، حيث تم تقديم بيانات وإحصاءات كاملة لمقارنة الحساسية الميكانيكية بين CFA والفئران^{الضابطة 30}. يتم عرض البيانات الفردية التمثيلية (متوسط العتبات اليسرى واليمنى) من ستة فئران مدرجة في الدراسة السابقة في الشكل 3 والجدول 1....

Discussion

خطوات حاسمة
اختبار BMS هو طريقة بسيطة لتقييم الحساسية الميكانيكية في الجزء الخلفي من الفئران ، إما في نقطة زمنية واحدة أو بشكل متكرر على مدار أيام أو أسابيع ، عندما يتوقع حدوث تغييرات (نماذج الألم) أو بعد التدخل الدوائي أو غير الدوائي. تشمل المشكلات الحرجة لهذه الطريقة قفص الاختب?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aerrane (isoflurane, USP) - Veterinary Use Only	Baxter	NDC 10019-773-60	Inhalation Anaesthetic ; DIN 02225875, for inducing anasthesia
Complete Freund Adjuvant (CFA)	Fisher Scientific	#77140	Water-in-oil emulsion of Complete Freund Adjuvant (CFA) with killed cells of Mycobacterium butyricum.
Male Wistar Rats	Charles River Laboratories		body weight: 320–450 g; age: 18-22 weeks.
Penlon Sigma Delta Vaporizer	Penlon	990-VI5K-SVEEK	Penlon Sigma Delta Vaporizer used for anasthesia
Sharpie Permanent Marker	Sharpie	BC23636	Permanent Marker, Fine Point, Black
Test cage	Custom-made		Width: 20 cm;  Length: 50 cm; Height from the bottom to the top: 40 cm; Height from the bottom mesh to the top of the cage: 7 cm; Wall thickness: 5 mm; Mesh: 1 mm wire with an 8 mm inter-wire distance
Von Frey Filaments	Aesthesio, Precise Tactile Sensory Evaluator	514000-20C	Filaments from 0.07 g to 26 g
Wahl Professional Animal, ARCO Cordless Pet Clipper, Trimmer Grooming	Wahl	Kit #8786-1201	Animal hair trimmer, for shaving purposes, zero blade