Avaliação da Sensibilidade Mecânica das Costas no Rato para Investigação Mecanicista da Dor Lombar Crônica

Resumo

Para desenvolver novas intervenções terapêuticas para a prevenção e manejo da dor nas costas, modelos animais são necessários para examinar os mecanismos e a eficácia dessas terapias a partir de uma perspectiva translacional. O presente protocolo descreve o teste BMS, um método padronizado para avaliar a sensibilidade mecânica de retorno no rato.

Resumo

A dor lombar é a principal causa de incapacidade em todo o mundo, com dramáticas consequências pessoais, econômicas e sociais. Para desenvolver novas terapêuticas, são necessários modelos animais para examinar os mecanismos e a eficácia de novas terapias a partir de uma perspectiva translacional. Vários modelos de roedores de dor nas costas são utilizados nas investigações atuais. Surpreendentemente, no entanto, nenhum teste comportamental padronizado foi validado para avaliar a sensibilidade mecânica em modelos de dor nas costas. Isso é fundamental para confirmar que animais com suposta dor nas costas apresentam hipersensibilidade local a estímulos nociceptivos e para monitorar a sensibilidade durante intervenções destinadas a aliviar a dor nas costas. O objetivo deste estudo é estabelecer um teste simples e acessível para avaliar a sensibilidade mecânica no dorso de ratos. Uma gaiola de teste foi fabricada especificamente para este método; comprimento x largura x altura: 50 x 20 x 7 cm, com uma malha de aço inoxidável na parte superior. Esta gaiola de teste permite a aplicação de estímulos mecânicos nas costas. Para realizar o teste, a parte de trás do animal é raspada na região de interesse, e a área de teste é marcada para repetir o teste em dias diferentes, conforme necessário. O limiar mecânico é determinado com filamentos de Von Frey aplicados aos músculos paraespinhais, utilizando o método up-down descrito anteriormente. As respostas positivas incluem (1) espasmos musculares, (2) arqueamento (extensão das costas), (3) rotação do pescoço (4) coçar ou lamber as costas e (5) escapar. Este teste comportamental (teste de Sensibilidade Mecânica das Costas (BMS)) é útil para pesquisas mecanicistas com modelos de roedores de dor nas costas para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas para a prevenção e manejo da dor nas costas.

Introdução

A lombalgia (lombalgia) é a principal causa de incapacidade em todo o mundo, o que tem dramáticas consequências pessoais, econômicas e sociais 1,2,3,4. Todos os anos, aproximadamente 37% da população é afetada pela lombalgia⁵. A lombalgia geralmente se resolve dentro de algumas semanas, mas se repete em 24%-33% dos indivíduos, tornando-se crônica em 5%-10% dos casos². Para compreender os mecanismos e impactos da lombalgia, bem como os efeitos de diferentes intervenções terapêuticas, vários modelos animais de lombalgia têm sido utilizados, mimetizando condições clínicas ou alguns componentes da lombalgia⁶. Esses modelos de camundongos e ratos podem ser classificados em uma ou mais das seguintes categorias: (1) lombalgia discogênica^7,8,, (2) lombalgia radicular 8,9,10,11, (3) osteoartrite articular facetária 12 e (4) lombalgia induzida por músculo ^13,14 . Como a dor não pode ser medida diretamente em espécies não humanas, inúmeros testes têm sido desenvolvidos para quantificar comportamentos semelhantes à dor nesses modelos⁸. Esses testes avaliam comportamentos evocados por um estímulo nocivo (força mecânica 15,16,17, estimulação térmica 18,19,20,21,22,23,24,25) ou produzidos espontaneamente ^26,27,28,29.

Os métodos que utilizam estímulos mecânicos incluem o teste de Von Frey ^15,16 e o teste de Randall-Selitto¹⁷. Os métodos que utilizam estímulos térmicos incluem o teste de movimento da cauda¹⁸, o teste de placa quente¹⁹, o teste de Hargreaves²⁰ e o teste de sonda térmica²¹. Os métodos que utilizam estímulos frios incluem o teste de placa fria²², o teste de evaporação de acetona²³ e o ensaio plantar frio²⁴. Os métodos para comportamentos espontâneos incluem as escalas de careta²⁶, escavação 27, levantamento de peso e análise de marcha 28, bem como uma análise comportamental automatizada²⁹. Apesar desses inúmeros testes disponíveis, nenhum deles é projetado especificamente para modelos de dor nas costas.

O objetivo deste estudo é estabelecer um teste simples e acessível para avaliar a sensibilidade mecânica no dorso de ratos. A técnica baseia-se, em grande parte, no teste de Von Frey aplicado à superfície plantar da pata traseira^15,16. O princípio básico do teste de Von Frey é usar uma série de monofilamentos para a região de interesse, fornecendo forças pré-determinadas constantes. Uma resposta é considerada positiva se o rato apresentar um comportamento nocifensivo. O limiar mecânico pode então ser calculado com base nos filamentos que evocaram respostas. No presente estudo, um método simples e acessível, adaptado do teste de Von Frey, é fornecido para determinar a sensibilidade mecânica no dorso de ratos.

Protocolo

O protocolo experimental foi aprovado pelo comitê de cuidados com animais da Université du Québec à Trois-Rivières e está em conformidade com as Diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com os Animais e as Diretrizes do Comitê de Pesquisa e Questões Éticas da Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP). O presente estudo utilizou seis ratos Wistar machos (peso corporal: 320-450 g; idade: 18-22 semanas). Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Os dados desses ratos são da amostra maior de um estudo anterior³⁰.

1. Preparação experimental

1. Hospede os animais em uma sala com temperatura controlada em instalações padrão para animais com acesso a comida e água ad libitum e um ciclo claro-escuro de 14 h-10 h. Certifique-se de que todos os animais estão em boa saúde no dia dos experimentos.
2. Gere o modelo animal de dor crônica nas costas seguindo os passos abaixo.
   1. Para induzir dor lombar crônica, realizar uma injeção intramuscular de Adjuvante de Freund Completo (CFA) nos músculos das costas, seguindo os relatos anteriores 14,30,31.
   2. Anestesiar o animal utilizando isoflurano (4% para indução e 2%-2,5% para manutenção).
   3. Usando uma agulha de 27 G, injete 150 μL de uma emulsão de CFA com água em óleo pronta para uso (ver Tabela de Materiais) nos músculos paraespinhais unilateral ou bilateralmente, dependendo das necessidades do protocolo.
   4. Mantenha a agulha de injeção no lugar por pelo menos 3 minutos após a conclusão da injeção. Para os animais do grupo controle, use os mesmos procedimentos³⁰, mas injete uma solução de solução salina fisiológica estéril (150 μL, 0,9%) em vez de CFA.
3. Fabrice a gaiola de teste.
   1. Faça uma gaiola de teste para dois animais que compreende uma câmara para cada animal.
      NOTA: Para o presente estudo, cada câmara possui as seguintes dimensões: comprimento x largura x altura: 50 x 20 x 7 cm (ver Tabela de Materiais).
   2. Monte as duas câmaras contíguas em quatro pernas de plexiglass de 33 cm de comprimento. Use plexiglass transparente para as paredes das câmaras, mas use plexiglass preto para separar as câmaras para evitar que os animais se vejam.
   3. Use malha de aço inoxidável feita de fio de 1 mm com uma distância entre fios de 8 mm para fazer o chão e o teto da gaiola de teste (Figura 1).

2. Teste de sensibilidade mecânica traseira (BMS)

1. Familiarize o animal com a gaiola de teste 30 min/dia por 5-7 dias consecutivos antes do primeiro teste. Repita o teste conforme necessário.
2. Anestesiar os animais utilizando isoflurano a 2%³¹ (ver Tabela de Materiais).
3. Em posição prona sob anestesia com isoflurano, raspe os pelos traseiros da área de interesse (dos níveis vertebrais T6 a L6) usando um aparador de pelos de animais (ver Tabela de Materiais). Para medidas repetidas, raspe o cabelo das costas a cada 3 dias em um dia sem avaliação comportamental para garantir que os estímulos sejam sempre aplicados diretamente na pele. Desenhe uma marca preta na pele com um marcador permanente para garantir que os filamentos são sempre aplicados na mesma área ao repetir o teste em dias diferentes.
4. No dia do teste, coloque os animais na gaiola de teste por 15-30 minutos antes do teste até que o animal esteja calmo.
5. Durante o ensaio, aplicar os filamentos de Von Frey (0,07, 0,16, 0,4, 0,6, 1, 2, 4, 6, 10, 15 e 26 g) perpendicularmente ao dorso, começando sempre com o filamento de 2 g e utilizando o método de cima para baixo¹⁵ (ver Tabela de Materiais). Aproxime-se das costas do animal lentamente com o filamento por trás do animal.
   1. Aplique o filamento somente quando o animal estiver acordado, de pé sobre suas quatro patas e sem se mover. Aplicar o filamento por 2 s bilateralmente na área de interesse, a 10 mm do processo espinhoso (Figura 2), a cada 15-30 s.
      NOTA: Uma resposta é considerada positiva se o animal apresentar um ou mais dos seguintes comportamentos durante ou imediatamente após a aplicação do filamento: (1) espasmos musculares, (2) arqueamento (extensão das costas), (3) rotação do pescoço para olhar para as costas, (4) coçar ou lamber as costas e (5) escapar.
6. Como descrito anteriormente¹⁵, se não for observada resposta com a aplicação de um filamento, aplique o próximo filamento com uma força maior na série. Se uma resposta for observada, use o próximo filamento com uma força menor na série. Continue este procedimento até que quatro leituras sejam obtidas após a primeira mudança comportamental (resposta após uma série de "sem resposta" ou sem resposta após uma série de "resposta").
7. Uma vez concluída a coleta de dados, calcule-se o valor que representa 50% do limiar mecânico, conforme descrito por Chaplan et ^al.15, utilizando esta fórmula:
   Limiar de 50% (g) = 10^(Xf+kδ)/10 000
   NOTA: Nesta fórmula, "Xf" é a marca de punho do último filamento de von Frey que foi usado. "k" é o valor tabular baseado no padrão de resposta do animal¹⁵, e "δ" é a média dos incrementos de Handle Mark entre filamentos de Von Frey. Dependendo do desenho experimental e das necessidades experimentais, apenas um lado da coluna vertebral pode ser avaliado para relatar um limiar, ou dois lados podem ser avaliados, e os limiares são relatados separadamente ou como uma média. Consulte a Tabela Suplementar 1 para o modelo de cálculo³².

3. Valorização dos animais

1. Após a conclusão da injeção intramuscular, interrompa a anestesia e coloque o animal sozinho em uma gaiola de alojamento padrão para recuperação.
2. Durante o período de recuperação, examine o comportamento do animal e não o deixe desacompanhado.
3. Confirme que o animal se recupera da anestesia e se move normalmente dentro de 5 minutos. Em seguida, devolva o animal à sua gaiola de alojamento habitual com os outros animais.
   NOTA: Ao final do experimento, o animal é perfundido através do coração com uma solução de formalina a 10%, sob anestesia profunda com isoflurano (5%). Os músculos das costas na área injetada são então extraídos para histologia e confirmação de alterações inflamatórias.

Resultados

O método foi utilizado em estudo anterior, no qual foram apresentados dados completos e estatísticas para comparar a sensibilidade mecânica entre CFA e ratos controle³⁰. Dados individuais representativos (média dos limiares esquerdo e direito) de seis ratos incluídos no estudo anterior são apresentados na Figura 3 e na Tabela 1. No início do estudo, a sensibilidade mecânica foi semelhante entre os grupos. A injeção intramuscular de CFA nos m...

Discussão

Etapas críticas
O teste BMS é um método simples para avaliar a sensibilidade mecânica no dorso de ratos, seja em um ponto de tempo ou repetidamente ao longo de dias ou semanas, quando se espera que ocorram mudanças (modelos de dor) ou após intervenção farmacológica ou não farmacológica. Questões críticas do método incluem a gaiola de teste, cujas dimensões devem garantir que o rato esteja confortável, mas não se mova demais. As costas do animal devem permanecer acessíveis através do...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aerrane (isoflurane, USP) - Veterinary Use Only	Baxter	NDC 10019-773-60	Inhalation Anaesthetic ; DIN 02225875, for inducing anasthesia
Complete Freund Adjuvant (CFA)	Fisher Scientific	#77140	Water-in-oil emulsion of Complete Freund Adjuvant (CFA) with killed cells of Mycobacterium butyricum.
Male Wistar Rats	Charles River Laboratories		body weight: 320–450 g; age: 18-22 weeks.
Penlon Sigma Delta Vaporizer	Penlon	990-VI5K-SVEEK	Penlon Sigma Delta Vaporizer used for anasthesia
Sharpie Permanent Marker	Sharpie	BC23636	Permanent Marker, Fine Point, Black
Test cage	Custom-made		Width: 20 cm;  Length: 50 cm; Height from the bottom to the top: 40 cm; Height from the bottom mesh to the top of the cage: 7 cm; Wall thickness: 5 mm; Mesh: 1 mm wire with an 8 mm inter-wire distance
Von Frey Filaments	Aesthesio, Precise Tactile Sensory Evaluator	514000-20C	Filaments from 0.07 g to 26 g
Wahl Professional Animal, ARCO Cordless Pet Clipper, Trimmer Grooming	Wahl	Kit #8786-1201	Animal hair trimmer, for shaving purposes, zero blade