АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Для разработки новых терапевтических вмешательств для профилактики и лечения болей в спине необходимы животные модели для изучения механизмов и эффективности этих методов лечения с трансляционной точки зрения. В настоящем протоколе описывается тест BMS, стандартизированный метод оценки механической чувствительности спины у крыс.

Аннотация

Боль в пояснице является основной причиной инвалидности во всем мире с драматическими личными, экономическими и социальными последствиями. Для разработки новых терапевтических средств необходимы модели на животных для изучения механизмов и эффективности новых методов лечения с трансляционной точки зрения. Несколько моделей боли в спине у грызунов используются в текущих исследованиях. Удивительно, однако, что стандартизированный поведенческий тест не был проверен для оценки механической чувствительности в моделях боли в спине. Это имеет решающее значение для подтверждения того, что животные с предполагаемой болью в спине проявляют локальную гиперчувствительность к ноцицептивным стимулам, и для мониторинга чувствительности во время вмешательств, направленных на облегчение боли в спине. Цель этого исследования состоит в том, чтобы создать простой и доступный тест для оценки механической чувствительности спины крыс. Специально для этого метода была изготовлена испытательная клетка; длина х ширина х высота: 50 х 20 х 7 см, с сеткой из нержавеющей стали сверху. Эта тестовая клетка позволяет применять механические стимулы к спине. Для проведения теста спина животного бреется в интересующей области, а тестовая область помечается для повторения теста в разные дни по мере необходимости. Механический порог определяется с помощью филаментов фон Фрея, приложенных к параспинальным мышцам, с использованием метода вверх-вниз, описанного ранее. Положительные реакции включают (1) подергивание мышц, (2) выгибание (разгибание спины), (3) вращение шеи, (4) почесывание или облизывание спины и (5) побег. Этот поведенческий тест (тест механической чувствительности спины (BMS)) полезен для механистических исследований с моделями боли в спине на грызунах для разработки терапевтических вмешательств для профилактики и лечения болей в спине.

Введение

Боль в пояснице (ББП) является основной причиной инвалидности во всем мире, что имеет драматические личные, экономические и социальные последствия 1,2,3,4. Каждый год примерно 37% населения страдает от LBP5. LBP обычно проходит в течение нескольких недель, но рецидивирует у 24-33% людей, становясь хроническим в 5-10% случаев2. Чтобы понять механизмы и эффекты LBP, а также эффекты различных терапевтических вмешательств, было использовано несколько животных моделей LBP, имитирующих клинические условия или некоторые компоненты LBP6. Эти модели мышей и крыс можно классифицировать по одной или нескольким из следующих категорий: (1) дискогенная LBP7,8, (2) корешковая LBP 8,9,10,11, (3) остеоартрит фасеточных суставов 12 и (4) мышечная LBP 13,14 . Поскольку боль не может быть измерена непосредственно у нечеловеческих видов, были разработаны многочисленные тесты для количественной оценки болевого поведения в этих моделях8. Эти тесты оценивают поведение, вызванное вредным стимулом (механическая сила 15,16,17, тепловая стимуляция 18,19,20,21,22,23,24,25) или вызванное спонтанно26,27,28,29.

Методы, использующие механические стимулы, включают критерий фон Фрея 15,16 и тест Рэндалла-Селитто17. Методы, использующие тепловые стимулы, включают испытание18 на щелчок хвостом, испытание19 на горячую плиту, испытание20 Харгривза и испытание21 на тепловом зонде. Способы, использующие холодовые стимулы, включают тест22 с холодной пластиной, тест 23 на испарение ацетона и холодный подошвенный анализ24. Методы спонтанного поведения включают шкалыгримас 26, закапывание 27, анализ нагрузки и походки28, а также автоматизированный поведенческий анализ29. Несмотря на эти многочисленные доступные тесты, ни один из них не разработан специально для моделей болей в спине.

Цель этого исследования состоит в том, чтобы создать простой и доступный тест для оценки механической чувствительности спины крыс. Методика во многом основана на тесте фон Фрея, нанесенном на подошвенную поверхность задней лапы15,16. Основной принцип теста фон Фрея состоит в том, чтобы использовать серию мононитей в интересующей области, доставляя постоянные заранее определенные силы. Реакция считается положительной, если крыса проявляет ноцифенсивное поведение. Затем механический порог может быть рассчитан на основе нитей, вызвавших отклики. В настоящем исследовании представлен простой и доступный метод, адаптированный из теста фон Фрея, для определения механической чувствительности спины крыс.

протокол

Экспериментальный протокол был одобрен комитетом по уходу за животными Университета Квебека в Труа-Ривьер и соответствовал Руководящим принципам Канадского совета по уходу за животными и Руководящим принципам Комитета по исследованиям и этическим вопросам Международной ассоциации по изучению боли (IASP). В настоящем исследовании использовались шесть крыс-самцов Вистар (масса тела: 320-450 г; возраст: 18-22 недели). Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Данные этих крыс взяты из большей выборки предыдущего исследования30.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Размещайте животных в помещении с регулируемой температурой в стандартных помещениях для животных с доступом к пище и воде ad libitum и циклом свет-темнота продолжительностью 14-10 часов. Убедитесь, что все животные находятся в добром здравии в день экспериментов.
  2. Создайте животную модель хронической боли в спине, выполнив следующие действия.
    1. Чтобы вызвать хроническую боль в спине, выполните внутримышечную инъекцию полного адъюванта Фройнда (CFA) в мышцы спины в соответствии с предыдущими отчетами 14,30,31.
    2. Обезболивают животное с помощью изофлурана (4% для индукции и 2%-2,5% для поддержания).
    3. С помощью иглы 27 г введите 150 мкл готовой к применению водомасляной эмульсии CFA (см. Таблицу материалов) в параспинальные мышцы в одностороннем или двустороннем порядке, в зависимости от потребностей протокола.
    4. Удерживайте инъекционную иглу на месте не менее 3 минут после завершения инъекции. Для животных контрольной группы используют те жепроцедуры 30, но вводят раствор стерильного физиологического раствора физиологического раствора (150 мкл, 0,9%) вместо КФА.
  3. Изготовьте клетку для испытаний.
    1. Сделайте тестовую клетку для двух животных, которая состоит из одной камеры для каждого животного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования каждая камера имеет следующие размеры: длина х ширина х высота: 50 х 20 х 7 см (см. Таблицу материалов).
    2. Установите две смежные камеры на четырех ножках из плексигласа длиной 33 см. Используйте прозрачное оргстекло для стен камер, но используйте черное оргстекло для разделения камер, чтобы животные не видели друг друга.
    3. Используйте сетку из нержавеющей стали из проволоки диаметром 1 мм с межпроволочным расстоянием 8 мм, чтобы сделать пол и потолок испытательной клетки (рис. 1).

2. Тест на механическую чувствительность спины (BMS)

  1. Ознакомьте животное с клеткой для испытаний 30 мин/сут в течение 5-7 дней подряд до первого теста. Повторите тест по мере необходимости.
  2. Анестезируют животных, используя 2% изофлуран31 (см. Таблицу материалов).
  3. В положении лежа под изофлурановой анестезией сбривайте волосы на спине интересующей области (от уровня T6 до L6 позвонков) с помощью триммера для шерсти животных (см. Таблицу материалов). Для повторных измерений сбривайте волосы на спине каждые 3 дня в день без поведенческой оценки, чтобы гарантировать, что стимулы всегда наносятся непосредственно на кожу. Нарисуйте черную метку на коже перманентным маркером, чтобы гарантировать, что нити всегда наносятся на одну и ту же область при повторении теста в разные дни.
  4. В день тестирования поместите животных в клетку для испытаний на 15-30 минут до испытания, пока животное не успокоится.
  5. Во время испытания прикладывайте нити фон Фрея (0,07, 0,16, 0,4, 0,6, 1, 2, 4, 6, 10, 15 и 26 г) перпендикулярно спине, всегда начиная с нити 2 г и используя метод вверх-вниз15 (см. Таблицу материалов). Медленно подойдите к спине животного нитью сзади животного.
    1. Наносите нить только тогда, когда животное бодрствует, стоит на четырех лапах и не двигается. Наносите нить на 2 с двусторонне на интересующую область, на расстоянии 10 мм от остистого отростка (рис. 2), каждые 15-30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция считается положительной, если животное проявляет одно или несколько из следующих поведений во время или сразу после наложения нити: (1) подергивание мышц, (2) выгибание (разгибание спины), (3) вращение шеи, чтобы посмотреть на спину, (4) почесывание или облизывание спины и (5) побег.
  6. Как описано ранее15, если реакция не наблюдается при применении нити, нанесите следующую нить с более высокой силой в серии. Если наблюдается реакция, используйте следующую нить накаливания с меньшим усилием в серии. Продолжайте эту процедуру до тех пор, пока не будут получены четыре показания после первого изменения поведения (ответ после серии «нет ответа» или отсутствие ответа после серии «ответа»).
  7. После завершения сбора данных рассчитайте значение, представляющее 50% от механического порога, как описано Chaplan et al.15, используя следующую формулу:
    Порог 50% (g) = 10(Xf+kδ)/10 000
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой формуле "Xf" - это метка ручки последней использованной нити фон Фрея. «k» — это табличное значение, основанное на паттернереакции животного 15, а «δ» — среднее значение приращений Handle Mark между нитями фон Фрея. В зависимости от плана эксперимента и экспериментальных потребностей может быть оценена только одна сторона позвоночника, чтобы сообщить об одном пороге, или две стороны могут быть оценены, и пороговые значения сообщаются отдельно или как среднее значение. Образецрасчета 32 см. в Дополнительной таблице 1.

3. Восстановление животных

  1. После того, как внутримышечная инъекция будет завершена, прекратите анестезию и поместите животное одного в стандартную клетку для выздоровления.
  2. В период восстановления изучите поведение животного и не оставляйте его без внимания.
  3. Убедитесь, что животное оправилось от анестезии и нормально двигается в течение 5 минут. Затем верните животное в его обычную клетку с другими животными.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце эксперимента животному перфузируют через сердце 10% раствор формалина, под глубокой изофлурановой анестезией (5%). Затем мышцы спины в области инъекции извлекаются для гистологии и подтверждения воспалительных изменений.

Результаты

Этот метод был использован в предыдущем исследовании, в котором были представлены полные данные и статистика для сравнения механической чувствительности между CFA и контрольными крысами30. Репрезентативные индивидуальные данные (среднее значение левого и правого порогов) ...

Обсуждение

Критические шаги
Тест BMS - это простой метод оценки механической чувствительности в спине крыс, либо в один момент времени, либо неоднократно в течение нескольких дней или недель, когда ожидаются изменения (модели боли) или после фармакологического или нефармакологического в...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов или отношений, которые могут привести к каким-либо конфликтам интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Фонда хиропрактики Квебека и Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (MP: грант #06659). Вклад HK был поддержан Université du Québec à Trois-Rivières (программа PAIR). Вклад BP был поддержан Фондом научных исследований Квебека в области здравоохранения (FRQS) и Фондом хиропрактики Квебека. Вклад ТП был поддержан Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады. Вклад NE и EK был поддержан Фондом хиропрактики Квебека. Вклад МП был поддержан FRQS.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Aerrane (isoflurane, USP) - Veterinary Use OnlyBaxterNDC 10019-773-60Inhalation Anaesthetic ; DIN 02225875, for inducing anasthesia
Complete Freund Adjuvant (CFA)Fisher Scientific#77140Water-in-oil emulsion of Complete Freund Adjuvant (CFA) with killed cells of Mycobacterium butyricum.
Male Wistar RatsCharles River Laboratoriesbody weight: 320–450 g; age: 18-22 weeks.
Penlon Sigma Delta VaporizerPenlon990-VI5K-SVEEKPenlon Sigma Delta Vaporizer used for anasthesia
Sharpie Permanent MarkerSharpieBC23636Permanent Marker, Fine Point, Black
Test cageCustom-madeWidth: 20 cm;  Length: 50 cm; Height from the bottom to the top: 40 cm; Height from the bottom mesh to the top of the cage: 7 cm; Wall thickness: 5 mm; Mesh: 1 mm wire with an 8 mm inter-wire distance   
Von Frey FilamentsAesthesio, Precise Tactile Sensory Evaluator514000-20CFilaments from 0.07 g to 26 g
Wahl Professional Animal, ARCO Cordless Pet Clipper, Trimmer Grooming WahlKit #8786-1201Animal hair trimmer, for shaving purposes, zero blade 

Ссылки

  1. Hartvigsen, J., et al. What low back pain is and why we need to pay attention. Lancet. 391 (10137), 2356-2367 (2018).
  2. Manchikanti, L., Singh, V., Falco, F. J., Benyamin, R. M., Hirsch, J. A. Epidemiology of low back pain in adults. Neuromodulation. 17, 3-10 (2014).
  3. Urits, I., et al. Low back pain, a comprehensive review: Pathophysiology, diagnosis, and treatment. Current Pain and Headache Reports. 23 (3), 23 (2019).
  4. James, S. L., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  5. Hoy, D., et al. A systematic review of the global prevalence of low back pain. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 2028-2037 (2012).
  6. Shi, C., et al. Animal models for studying the etiology and treatment of low back pain. Journal of Orthopaedic Research. 36 (5), 1305-1312 (2018).
  7. Olmarker, K. Puncture of a lumbar intervertebral disc induces changes in spontaneous pain behavior: An experimental study in rats. Spine. 33 (8), 850-855 (2008).
  8. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  9. Kawakami, M., et al. Pathomechanism of pain-related behavior produced by allografts of intervertebral disc in the rat. Spine. 21 (18), 2101-2107 (1996).
  10. Hu, S. -. J., Xing, J. -. L. An experimental model for chronic compression of dorsal root ganglion produced by intervertebral foramen stenosis in the rat. Pain. 77 (1), 15-23 (1998).
  11. Xie, W. R., et al. Robust increase of cutaneous sensitivity, cytokine production and sympathetic sprouting in rats with localized inflammatory irritation of the spinal ganglia. Neuroscience. 142 (3), 809-822 (2006).
  12. Arthritis and Rheumatism. Characterization of a new animal model for evaluation and treatment of back pain due to lumbar facet joint osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 63 (10), 2966-2973 (2011).
  13. Kobayashi, Y., Sekiguchi, M., Konno, S. -. I., Kikuchi, S. -. I. Increased intramuscular pressure in lumbar paraspinal muscles and low back pain: Model development and expression of substance P in the dorsal root ganglion. Spine. 35 (15), 1423-1428 (2010).
  14. Touj, S., et al. Sympathetic regulation and anterior cingulate cortex volume are altered in a rat model of chronic back pain. Neuroscience. 352, 9-18 (2017).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  16. Deuis, J. R., et al. Analgesic effects of clinically used compounds in novel mouse models of polyneuropathy induced by oxaliplatin and cisplatin. Neuro-Oncology. 16 (10), 1324-1332 (2014).
  17. Randall, L. O., Selitto, J. J. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie. 111 (4), 409-419 (1957).
  18. D'Amour, F. E., Smith, D. L. A method for determining loss of pain sensation. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 72 (1), 74-79 (1941).
  19. Woolfe, G. The evaluation of the analgesic actions of pethidine hydrochlodide (Demerol). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 80 (3), 300-307 (1944).
  20. Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
  21. Deuis, J. R., Vetter, I. The thermal probe test: A novel behavioral assay to quantify thermal paw withdrawal thresholds in mice. Temperature. 3 (2), 199-207 (2016).
  22. Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats. Molecular Pain. 1, 36 (2005).
  23. Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate. Pain. 56 (2), 155-166 (1994).
  24. Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. I. V. A novel behavioral assay for measuring cold sensation in mice. PLoS One. 7 (6), 39765 (2012).
  25. Moqrich, A., et al. Impaired thermosensation in mice lacking TRPV3, a heat and camphor sensor in the skin. Science. 307 (5714), 1468-1472 (2005).
  26. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  27. Deacon, R. M. J. Burrowing in rodents: a sensitive method for detecting behavioral dysfunction. Nature Protocols. 1 (1), 118-121 (2006).
  28. Griffioen, M. A., et al. Evaluation of dynamic weight bearing for measuring nonevoked inflammatory hyperalgesia in mice. Nursing Research. 64 (2), 81-87 (2015).
  29. Brodkin, J., et al. Validation and implementation of a novel high-throughput behavioral phenotyping instrument for mice. Journal of Neuroscience Methods. 224, 48-57 (2014).
  30. Paquette, T., Eskandari, N., Leblond, H., Piché, M. Spinal neurovascular coupling is preserved despite time dependent alterations of spinal cord blood flow responses in a rat model of chronic back pain: implications for functional spinal cord imaging. Pain. , (2022).
  31. Tokunaga, R., et al. Attenuation of widespread hypersensitivity to noxious mechanical stimuli by inhibition of GABAergic neurons of the right amygdala in a rat model of chronic back pain. European Journal of Pain. 26 (4), 911-928 (2022).
  32. Dixon, W. J. Efficient analysis of experimental observations. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 20, 441-462 (1980).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены