JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نصف نظام تصوير قابل للتكرار ومؤتمت وغير متحيز لتوصيف وظيفة الوصلة العصبية العضلية باستخدام الأنسجة العضلية الهيكلية البشرية المهندسة والخلايا العصبية الضوئية الوراثية. يسمح هذا النظام بالقياس الكمي الوظيفي للاتصال العصبي العضلي بمرور الوقت ويكتشف تناقص الوظيفة العصبية العضلية الناجمة عن السموم العصبية والوهن العضلي الوبيل مصل المريض.

Abstract

ترتبط العديد من الأمراض العصبية العضلية ، مثل الوهن العضلي الوبيل (MG) ، بخلل وظيفي في الوصلة العصبية العضلية (NMJ) ، والتي يصعب توصيفها في النماذج الحيوانية بسبب الاختلافات الفسيولوجية بين الحيوانات والبشر. توفر هندسة الأنسجة فرصا لتوفير نماذج في المختبر من NMJs البشرية الوظيفية التي يمكن استخدامها لتشخيص والتحقيق في أمراض NMJ واختبار العلاجات المحتملة. من خلال دمج البروتينات البصرية الجينية في الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، قمنا بتوليد الخلايا العصبية التي يمكن تحفيزها بأطوال موجية محددة من الضوء. إذا كان NMJ صحيا ووظيفيا ، فإن الإشارة الكيميائية العصبية من motoneuron تؤدي إلى تقلص العضلات. من خلال دمج علم البصريات الوراثي والتصنيع الدقيق مع هندسة الأنسجة ، أنشأنا منهجية غير متحيزة وآلية لتوصيف وظيفة NMJ باستخدام تحليل الفيديو. تم تطوير بروتوكول موحد لتشكيل NMJ ، والتحفيز البصري مع تسجيل الفيديو في وقت واحد ، وتحليل الفيديو لانقباض الأنسجة. تحفيز الخلايا العصبية المتحركة البصرية الوراثية عن طريق الضوء للحث على تقلصات العضلات الهيكلية يلخص فسيولوجيا NMJ البشرية ويسمح بالقياسات الوظيفية المتكررة ل NMJ بمرور الوقت واستجابة للمدخلات المختلفة. نحن نظهر قدرة هذه المنصة على إظهار التحسينات الوظيفية في الاتصال العصبي العضلي بمرور الوقت وتوصيف الآثار الضارة للأجسام المضادة MG للمريض أو السموم العصبية على وظيفة NMJ.

Introduction

التقاطع العصبي العضلي (NMJ) هو المشبك الكيميائي بين الخلايا العصبية المتحركة (MNs) وخلايا العضلات الهيكلية (SkM) التي تسمح بتقلص العضلات. السموم ، مثل السموم العصبية α بونغاروتوكسين (BTX) ، أو الأمراض العصبية العضلية (NMD) مثل الوهن العضلي الوبيل (MG) يمكن أن تؤدي إلى انحطاط NMJ وانخفاض في السيطرة على العضلات1. تلخص نماذج الأنسجة البشرية المهندسة بيولوجيا بشكل أفضل الآليات الوظيفية والفسيولوجية ل NMJs البشرية وتوفر إمكانات انتقالية أكبر من النماذج الحيوانية.

في حين أن النماذج الحيوانية قد تقدمت في فهم تكوين ووظيفة NMJ ، هناك اختلافات كبيرة بين نقاط الاشتباك العصبي البشرية والحيوانية التي تحد من ترجمة النتائج إلى البشر وتجعل في الجسم الحي توصيف NMJ تحديا2،3،4. وقد أظهرت الدراسات اختلافات فسيولوجية متميزة بين NMJs الفئران والإنسان. الفئران لديها NMJs أكبر وكثافات منطقة نشطة أصغر بالمقارنة مع NMJs البشرية4. بالإضافة إلى ذلك ، لا تعكس دراسات الأدوية التي أجريت في النماذج الحيوانية دائما الآثار الموجودة في التجارب السريرية البشرية. توفر نماذج الأنسجة البشرية الهندسية الفرصة لدراسة التطور الصحي ل NMJ وأمراض الأمراض العصبية العضلية والسماح بإجراء فحوصات الأدوية. يمكن تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs)5 إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا العضلات الهيكلية 6,7 والخلايا العصبية المتحركة 8,9. يمكن توليد hiPSCs بسهولة من خلايا المريض ، مما يسمح بنمذجة أفضل للأمراض10 وفحص الأدوية11,12 من خلال نماذج الأنسجة الخاصة بالمريض.

تفتقر الثقافات المشتركة ثنائية الأبعاد (2D) أحادية الطبقة من SkMs و MNs إلى المورفولوجيا والنمط الظاهري والتنظيم والسلوك الوظيفي ل NMJs الفسيولوجية. NMJs تتشكل بشكل عشوائي في ثقافة ثنائية الأبعاد ، مما يمنع عزل الوحدات الحركية للتحليل ، ويحد من القياسات الوظيفية الدقيقة ، ويمنع استخدامها للتجارب المتكررة والمنهجية13 . تتغلب نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد (3D) من NMJs على العديد من هذه القيود ، وتلخص الخصائص المورفولوجية والوظيفية ل NMJs الفسيولوجية7،14،15،16،17. باستخدام هذا النموذج ، يتم تطوير نوعي الأنسجة بشكل منفصل ثم يتم دمجهما عن طريق توجيه النمو المحوري ، مما يسمح بتطوير NMJs أكثر تنظيما مقارنة بأنظمة زراعة 2D.

أظهرت دراستنا السابقة أن الجمع بين علم البصريات الوراثي وهندسة الأنسجة يمكن أن يسمح بالتحفيز الدقيق غير الغازي وتقييم وظيفة NMJ18,19. من خلال الهندسة الوراثية ، يمكن دمج البروتينات الحساسة للضوء في جينوم hiPSCs. إن دمج قناة رودوبسين-2 (ChR2) ، وهي قناة أيونية تفتح استجابة للضوء الأزرق ، في غشاء الخلايا القابلة للإثارة مثل الخلايا العصبية يسمح بالتحكم الزماني المكاني غير المتصل في تنشيط الخلية 20،21،22. يمكن تمييز hiPSCs التي تحمل ChR2 إلى خلايا عصبية حركية بصرية حساسة للضوء الأزرق ، مما يزيل الحاجة إلى أقطاب كهربائية غازية نموذجية تحفز الخلايا العصبية وتجنب التحفيز غير المرغوب فيه لخلايا العضلات بواسطة الأقطاب الكهربائية23. يستخدم هذا النظام الخلايا العصبية المتحركة البصرية الوراثية لتحفيز الانقباضات في خلايا العضلات الهيكلية غير البصرية الوراثية. يسمح الجمع بين الحصول على الفيديو وإضاءة الضوء الأزرق التي يتم التحكم فيها بتحفيز الأنسجة المستزرعة وتسجيلها في وقت واحد لوظيفة NMJ.

يحدث MG بسبب الأجسام المضادة الذاتية التي تستهدف مستقبلات أستيل كولين النيكوتينية (AChR) ، مما يؤدي إلى انخفاض وظيفة NMJ وضعف العضلات24. يتم تشخيصه بناء على الأعراض المقدمة والتشخيص الكهربائي والكشف عن الأجسام المضادة الذاتية عن طريق اختبارات الدم المصلية. ومع ذلك ، لم يتم تحديد جميع الأجسام المضادة الذاتية المشاركة في MG ، ويتم تشخيص بعض المرضى سلبيي المصل مع MG ولكن مع عدم وجود أجسام مضادة معترف بها25,26. يسمح نظامنا بإجراء تقييم وظيفي متكرر ل NMJ قبل وبعد إضافة المصل من مرضى MG ، مما يوفر نظرة ثاقبة لا تقدر بثمن على التغيرات الوظيفية والكيميائية الحيوية التي تسببها الأجسام المضادة MG18. يوضح بروتوكولنا كيفية إنتاج نماذج 3D في المختبر من NMJ البشري الوظيفي الذي يمكن استخدامه لتشخيص أمراض NMJ والتحقيق فيها واختبار العلاجات المحتملة. نحن نظهر براعة النظام في منصتين ، جهاز الموائع الدقيقة ، ومنصة مفاعل حيوي أكبر مفتوحة.

Protocol

تم إنشاء جميع خطوط الخلايا لهذا العمل واستخدامها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لجامعة كولومبيا ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية.

1. إعداد المفاعل الحيوي

  1. جعل قوالب المفاعلات الحيوية
    1. قم بتنزيل ملف CAD الخاص بالمفاعل الحيوي من ملف CAD التكميلي أو قم بإنشاء تصميم خاص مخصص.
    2. إنشاء مسار أدوات CNC من نموذج 3D باستخدام برنامج CAM.
    3. آلة قوالب الأسيتال باستخدام آلة طحن CNC.
  2. تصنيع المفاعلات الحيوية
    1. امزج قاعدة 10: 1 إلى خليط عامل المعالجة من polydimethylsiloxane (PDMS ، 77 جم من الخليط لكل 4 منصات / قوالب).
    2. ضع الخليط في غرفة فراغ ، وأغلق جميع الصمامات ، وقم بتشغيل الفراغ ، وقم بإزالة الغاز من الخليط لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى لا تبقى فقاعات الهواء. صب الخليط في قوالب وإزالة الغاز من القوالب في غرفة التفريغ لمدة 1 ساعة.
    3. أغلق القوالب مع النصف العلوي من القالب في الاتجاه الصحيح. ضع قضيبا سداسيا فولاذيا فوق المركز وقم بالمشبك على كلا الجانبين.
    4. أعد ملء الجزء العلوي باستخدام PDMS.
    5. عالج القوالب في فرن 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل.
    6. قم بإزالة المنصات من القوالب بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة.
    7. تنظيف الأجهزة في حمام بالموجات فوق الصوتية باستخدام دورات 1 ساعة من صابون الأطباق ، 400 مل من 100 ٪ isopropanol ، والماء المقطر.
    8. يجف طوال الليل عند 65 درجة مئوية.
    9. انقع الغطاء الزجاجي في 1٪ من البوليول غير الأيوني الفاعل بالسطح لمدة 30 دقيقة ، وتأكد من عدم تكديس الأغطية بحيث تكون جميعها مغلفة بشكل صحيح.
    10. شطف جيدا بالماء المقطر وجفف بين عشية وضحاها على حرارة 65 درجة مئوية.
    11. استخدم منظف البلازما على ارتفاع عال مع 6 لتر / دقيقة من الأكسجين لمدة 1-2 دقيقة لعلاج أغطية الزجاج ومنصة PDMS. بمجرد معالجتهما ، اربطا الاثنين معا عن طريق الضغط على PDMS لأسفل على الغطاء لمدة 30 ثانية على الأقل.
    12. قم بتعقيم الأجهزة المستعبدة قبل إضافة الخلايا.

2. بناء إعداد التحفيز البصري

  1. باستخدام نظام مكعب قفص 30 مم ، قم بإرفاق مرآة ثنائية اللون 573 نانومتر في الوسط. قم بإقران LED أحمر 627 نانومتر مع مرشح إثارة طويل التمرير 594 نانومتر وإرفاقه بالجانب العلوي من المكعب ، مع مواجهة LED للمرآة. ثم قم بتوصيل LED أزرق 488 نانومتر مع مرشح إثارة قصير 546 نانومتر إلى الجانب المجاور من المكعب ، مع مواجهة LED للمرآة كما هو موضح في المخطط في الشكل 3A.
  2. قم بتوصيل غشاء القزحية الذي يتم تشغيله بالحلقة إلى أسفل مكعب القفص للتحكم في حجم المنطقة المضاءة.
  3. قم بتشغيل كل مصباح LED بواسطة برنامج تشغيل T-Cube LED والتحكم فيه عبر لوحة Arduino Uno Rev3. قم بتوصيل الإدخال الجانبي لبرنامج تشغيل LED بقابس مصدر الطاقة ، وقم بتوصيل الإخراج الأوسط ب Arduino ، وقم بتوصيل الإخراج الجانبي مباشرة بمصابيح LED.
  4. قم بتوصيل Arduino Uno بجهاز كمبيوتر عن طريق كبل USB.
  5. قم بتنزيل الملفات من رابط GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
  6. افتح الملف "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" من مجلد GitHub.
  7. تعيين معلمات البداية: الخطوات = 30 ؛ startFrequency = 0.5; نهاية التردد = 3; نبض الطول = 100.
  8. تأكد من تعيين خرج الدبوس 4 لبرنامج تشغيل LED الأزرق وتعيين إخراج الدبوس 2 لبرنامج تشغيل LED الأحمر. تحقق من توصيل الأسلاك الوسطى لبرنامج تشغيل LED بالأرض وبمخرج الدبوس المعني.
  9. قم بتجميع وتحميل برنامج "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" إلى Arduino.
  10. قم بتوصيل كل برنامج تشغيل LED بالقناة المقابلة له.

3. إعداد زراعة الخلايا (اليوم -21-0)

  1. خلايا العضلات الهيكلية الأولية
    1. قم بإذابة وتوسيع الأرومات العضلية الهيكلية الأولية (التي تم الحصول عليها من Cook Myosite) لمدة أقصاها ستة ممرات باستخدام وسط نمو Myotonic (+ ملحق). الحفاظ على الخلايا في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. تغيير وسائل الإعلام كل 2 أيام.
    3. بمجرد أن تلتقي الخلايا بنسبة 60٪ تقريبا ، قم بمرورها باستخدام 0.05٪ Trypsin-EDTA (1x ، لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية). جمع الخلايا المنفصلة وإضافة وسائط جديدة لتحييد التربسين.
    4. قم بتدوير الخلايا عند 300 × g وقم بشفط supernatant فوق حبيبة الخلية.
    5. أعد تعليق الخلايا باستخدام MGM والبذور 1: 3 مع 60 مل لكل قارورة ثلاثية الطبقات.
  2. ChR2-hiPSC
    ملاحظة: تم إنشاء جميع خطوط الخلايا لهذا العمل واستخدامها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لجامعة كولومبيا، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية. في هذا البروتوكول ، تم إنشاء hiPSCs المعبر عن ChR2 عبر تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 باستخدام الطرق الموصوفة سابقا18 ، ولكن يمكن استخدام أي خطوط خلايا بصرية وراثية مستقرة (lentiviral ، piggyBac ، إلخ) بنفس الطريقة. تم اختيار المروجين التأسيسيين الذين تم التعبير عنهم في كل من iPSCs و motoneurons (CAG). تم العثور على الخلايا لديها نمط نووي صحي ، كما لوحظ في المنشورات السابقة18,19.
    1. قم بتغطية ألواح 6 آبار ب 1 مل / بئر من مصفوفة الغشاء السفلي المذاب المخفف في DMEM / F12 (1:80) واحتضن الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
    2. بذور iPSCs على ألواح مغلفة من 6 آبار مع 2 مل من وسط زراعة الخلايا الخالية من التغذية (iPSC media) ، وتبادل 2 مل من الوسائط كل يومين ويمر كل 5-7 أيام. الحفاظ على الخلايا في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    3. المرور
      1. قم بفصل الخلايا الجذعية عن طريق الحضانة باستخدام 1 مل من كاشف إطلاق الخلايا الجذعية الخالية من الإنزيم لمدة 4 دقائق والقص ميكانيكيا باستخدام ماصة P1000 ذات الطرف العريض.
      2. خلايا البذور بنسبة 1:24 أو 1:48 في وسائط iPSC مع 2 ميكرومتر من Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد في 2 مل / بئر على ألواح 6 آبار مغلفة.

4. بذر الأنسجة العضلية الهيكلية (اليوم -3)

  1. عزل وحساب 30 × 106 myoblasts باستخدام عداد خلية آلي.
  2. أعد تعليق الأرومات العضلية في مزيج 4: 1 من 3 ملغم / مل من الكولاجين I ومصفوفة الغشاء السفلي المذاب (800 ميكرولتر من خليط الكولاجين + 200 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء السفلي للوصول إلى حجم نهائي قدره 1 مل). بالنسبة لمكون الكولاجين ، أضف عامل التحييد المصاحب (مزيج 9: 1 من الكولاجين إلى عامل تحييد) وقم بتخفيف الخليط باستخدام 1x PBS لتحقيق حجم 800 ميكرولتر.
  3. أضف 15 ميكرولتر من تعليق الكولاجين الخلوي إلى كل غرفة عضلية في المفاعل الحيوي ، مع التأكد من نشر التعليق عبر كلا العمودين باستخدام طرف الماصة (الشكل 2).
  4. دع خليط هلام الخلية يتبلمر عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم املأ كل مفاعل حيوي جيدا ب 450 ميكرولتر من وسائط النمو العضلي.
  5. بعد 3 أيام (بمجرد ضغط الجل) ، ابدأ في تمايز الأنبوب العضلي.

5. تمايز Myotube (أيام 0-14)

  1. ابدأ ضخ الأنبوب العضلي عن طريق تبديل الأنسجة إلى 450 ميكرولتر من الوسائط المحفزة للاندماج (FS ، الجدول 1) لمدة 7 أيام ، مع تغيير الوسائط كل يومين.
    ملاحظة: حاول أن تبدأ تمايز الأنبوب العضلي في نفس اليوم الذي يتم فيه تمايز موتونيورون من hiPSCs من أجل زرع الخلايا العصبية المتحركة في نهاية جداول تمايز كلا النوعين من الخلايا.
  2. في اليوم 7 ، قم بتغيير الوسائط إلى 450 ميكرولتر من وسائط النضج Ia (MMIa ، الجدول 1).
  3. في اليوم 9 ، قم بالتغيير إلى 450 ميكرولتر من وسائط النضج Ib (MMIb ، الجدول 1).
  4. في اليوم 11 ، قم بتغيير الوسائط إلى 450 ميكرولتر من NbActiv4. استمر في تغيير الوسائط كل 2 أيام حتى يتم زرع الخلايا العصبية المتحركة (الخطوة 7).

6. تمايز Motoneuron (أيام 0-14)

ملاحظة: تم تكييف بروتوكول التمايز motoneuron الخاص بنا من Maury et al8.

  1. في اليوم 0 ، انقل 4 × 106 ChR2- hiPSCs إلى طبق بتري منخفض للغاية مع 15 مل من وسط ثقافة تعليق موتونيورون (MSCM ، الجدول 1). تكملة MSCM مع 3 ميكرومتر CHIR99021 ، 0.2 ميكرومتر LDN193189 ، 40 ميكرومتر SB431542 هيدرات و 5 ميكرومتر Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد.
  2. في اليوم الثاني ، اعزل الأغلفة العصبية (NS) بمصفاة قابلة للانعكاس 37 ميكرومتر وقم بتكرارها في 15 مل من MSCM مع 3 ميكرومتر CHIR99021 ، 0.2 ميكرومتر LDN193189 ، 40 ميكرومتر SB431542 هيدرات ، و 0.1 ميكرومتر حمض الريتينويك. يجب أن يكون NS مرئيا في طبق Petri دون استخدام المجهر بعد اليوم 2.
  3. في اليوم 4 ، انقل الخلايا والوسائط إلى أنبوب 50 مل واسمح للغلاف العصبي بالاستقرار في القاع (5 دقائق). شفط supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 15 مل من MSCM تستكمل مع 0.5 ميكرومتر SAG ، 0.2 ميكرومتر LDN193189 ، 40 ميكرومتر SB431541 ، و 0.1 ميكرومتر حمض الريتينويك.
  4. في اليوم 7، كرر الخطوة 6.3. ولكن إعادة تعليق الخلايا في 15 مل من MSCM تستكمل مع 0.5 ميكرومتر SAG و 0.1μM حمض الريتينويك.
  5. في اليوم 9، كرر الخطوة 6.3. ولكن إعادة تعليق الخلايا في 15 مل من MSCM تستكمل مع 10 ميكرومتر DAPT.
  6. في اليوم 11، كرر الخطوة 6.3. ولكن إعادة تعليق الخلايا في 15 مل من MSCM تستكمل مع 20 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF.
  7. في اليوم 14 ، قم بزرع الخلايا العصبية المتحركة في المنصة.

7. بذر مجاميع الخلايا العصبية المتحركة في المفاعل الحيوي (اليوم 14)

  1. تحضير خليط هلام 4: 1 من 2 ملغ / مل من الكولاجين I و Matrigel (800 ميكرولتر من خليط الكولاجين + 200 ميكرولتر من Matrigel للوصول إلى حجم نهائي من 1 مل). بالنسبة لمكون الكولاجين ، أضف عامل التحييد المصاحب (مزيج 9: 1 من الكولاجين إلى عامل تحييد) وقم بتخفيف الخليط باستخدام 1x PBS لتحقيق حجم نهائي قدره 800 ميكرولتر.
  2. استخدم مصفاة خلايا 400 نانومتر لاختيار الأغلفة العصبية الكبيرة وإعادة تعليقها في خليط الهلام.
  3. استنشاق الوسائط من الخزان وبعناية من بئر الغلاف العصبي (الشكل 2).
  4. أضف 15 ميكرولتر من خليط الجل إلى قناة الغلاف العصبي.
  5. قم بتحميل ماصة 10 ميكرولتر مع 10 ميكرولتر من الجل ثم اختر غلافا عصبيا واحدا.
  6. قم بإيداع NS في قناة الغلاف العصبي وتأكد من أن NS في الغرفة. ارفع الماصة ببطء مع إطلاق الجل المتبقي بمجرد إيداع NS. إذا لم تكن متأكدا من أن NS قد تم إيداعه بشكل صحيح ، فتحقق من موقعه باستخدام المجهر.
  7. اسمح للهلام بالبلمرة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  8. أضف 450 ميكرولتر من NbActiv4 مكملة ب 20 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF إلى الخزانات.
  9. قم بتغيير الوسائط كل يومين للسماح بالنمو المحوري من NS إلى الأنسجة العضلية.

8. التحفيز البصري المتزامن وتسجيل الفيديو لوظيفة NMJ (اليوم 24+)

  1. للتصوير، استخدم مجهر فلورسنت مقلوب مع كاميرا علمية تكميلية لأشباه الموصلات المعدنية (sCMOS).
  2. اضبط مثبت برنامج الكاميرا على 2x2 ، والتعرض ل 20 مللي ثانية ، وتشغيل الغالق المتداول ، ومعدل القراءة إلى 540 ميجاهرتز ، والنطاق الديناميكي: 12 بت وكسب 1 ، ووضع المستشعر: التداخل.
  3. استخدم هدف 2x على المجهر لتصوير الأنسجة الدقيقة.
  4. قم بتوصيل غرفة خلية حية (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) بمرحلة المجهر.
  5. حدد منطقة الاهتمام (ROI) التي تحتوي على أنسجة الأنسجة الهيكلية المعصبة لتقليل حجم الملف ووقت المعالجة.
  6. ضع مرشح انبعاث طويل التمرير 594 نانومتر بين العينة وهدف التصوير لتصفية نبضات الضوء الأزرق من الكاميرا.
  7. ضع صفيحة مستطيلة من 4 آبار تحتوي على 4 مفاعلات حيوية (24 نسيج) في غرفة الخلايا الحية.
  8. انقر على طريقة العرض المباشر. قم بتوسيط الصورة وتركيزها باستخدام عائد الاستثمار المطلوب.
  9. قم بتحميل رمز الماكرو المخصص من مجلد GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) للتحكم في موضع المرحلة ولوحة Arduino واكتساب الفيديو.
  10. قم بتعيين فيلم الإخراج على النحو التالي: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
  11. قم بتشغيل رمز الماكرو باستخدام إحداثيات X و Y المطلوبة على المسرح واحصل على فاصل زمني سريع مع إطارات 1700 بمعدل 50 إطارا / ثانية.
  12. استبدال الوسائط بعد التصوير وإعادة العينات إلى الحاضنة. اسمح ب 24 ساعة على الأقل بين جلسات التقاط الصور لتجنب إرهاق الأنسجة.

9. معالجة وتحليل الدفعات (اليوم 24+)

  1. معالجة الأفلام
    1. استخدم رمز MATLAB المخصص لمعالجة مقاطع الفيديو في تحليل الدفعات. يمكن تنزيل الملفات من مجلد GitHub (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). وترد قائمة بالوظائف وشرحها في الجدول 2.
      ملاحظة: التعليمات البرمجية متوافقة مع تنسيقات .nd2 و .czi. يتطلب تنشيطه معالجة متوازية في MATLAB ويحتاج إلى حزمة التنسيقات الحيوية.
    2. قم بتشغيل البرنامج النصي recursiveOSAnalysis لتحليل الأفلام من خلال المعالجة المتوازية. اجعل جميع مقاطع الفيديو المكتسبة في نفس المجلد وحدد هذا المجلد عند تشغيل التعليمة البرمجية.
    3. اضبط معلمات ما بعد التحليل حسب الحاجة.
      1. تغيير وقت خط الأساس (الخيار 1) إذا تم التقاط الانقباض التلقائي في بداية التسجيل. سيظهر هذا طريقة قراءة أولية أعلى من 0 وسيحتاج إلى تغيير الإطار للتعويض.
      2. تغيير peakThreshold (الخيار 2) إذا لم يتم تسجيل الانقباضات. سيكتشف الرمز الانقباضات التي تزيد عن 25٪ من أعلى قمة بشكل افتراضي بحيث يمكن تغيير هذه القيمة.
      3. قم بتغيير minMinProminHighlight و minMinWidth لضبط الحساسية عند اكتشاف بداية كل ذروة.
    4. توليد إخراج الفيديو والرسم البياني.
      1. قم بتشغيل recursiveOSMovie لإنشاء ملف فيديو لكل نسيج مع تتبع الانقباض الخاص به.

10. اضطراب وظيفة NMJ (اليوم 24+)

  1. قم بإعداد وسائط العلاج عن طريق إضافة مستجيب خارجي إلى الوسائط القاعدية NbActiv4 المكملة ب 20 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF.
    1. بالنسبة لتجربة مصل MG ، استخدم 20٪ من أمصال مرضى MG في NbActiv4 + BDNF + GDNF.
    2. بالنسبة لتجربة BTX ، استخدم 5 ميكروغرام / مل BTX في NbActiv4 + BDNF + GDNF.
  2. التحفيز / الصورة باستخدام الخطوة 3.2. لتسجيل خط الأساس.
  3. استبدل الوسائط الموجودة في الأنسجة بوسائط العلاج (450 ميكرولتر / أنسجة).
  4. احتضان للوقت المطلوب (48 ساعة لمصل المريض ، 20 دقيقة ل BTX).
  5. التحفيز / الصورة مرة أخرى باستخدام الخطوة 3.2. لتسجيل الوظيفة بعد العلاج.
  6. إزالة وسائط العلاج والسماح للأنسجة بالراحة في الوقت المطلوب (48 ساعة بعد إزالة الأمصال)
    ملاحظة: اترك 24 ساعة على الأقل بين التحفيز والتصوير لتجنب إجهاد الأنسجة

النتائج

تم إنشاء التقاطعات العصبية العضلية عن طريق المشاركة في زراعة الخلايا العصبية الضوئية المشتقة من hiPSC مع أنسجة العضلات الهيكلية غير البصرية الوراثية. تم زرع الخلايا العضلية الهيكلية الأولية البشرية (SkM) في المنصات وتمييزها إلى أنابيب عضلية متعددة النوى باستخدام بروتوكول 2 أسبوع. تم تمييز ال...

Discussion

هذا النظام هو نموذج الأنسجة البشرية 3D هندسيا الذي يجمع بين علم البصريات ومعالجة الفيديو لتمكين التقييم الآلي وغير المتحيز لوظيفة NMJ. باستخدام بروتوكول موحد ، أثبتنا القدرة على قياس التغيرات في وظيفة NMJ أثناء التطور الفسيولوجي وتوصيف الآثار الضارة للأمراض مثل التعرض للسموم العصبية والوهن...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نحن نقدر بامتنان الدعم التمويلي المقدم من المعاهد الوطنية للصحة [أرقام المنح EB025765 و EB027062] ، ووزارة الدفاع [رقم الجائزة W81XWH-18-1-0095] ، و UCSF Health Innovation via Engineering (زمالة فيروس نقص المناعة البشرية). نحن نقدر بامتنان مركز الخلايا الجذعية بجامعة كولومبيا لمساعدته وتوجيهه في إعادة برمجة الخلايا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
SkMDCCook MyositeP01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12ThermoFisher Scientific12634-020
Bovine Serum Albumin solutionMillipore SigmaA9576-50ML
G-5 Supplement (100X)ThermoFisher Scientific17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)ThermoFisher Scientific10131-035
Insulin, Recombinant HumanMillipore Sigma91077C-100MG
MatrigelCorning354277
mTeSR PlusStem Cell Technologies100-0276
MyoTonic Growth Media KitCook MyositeMK-4444
N-2 SupplementThermoFisher Scientific17502-048
NbActiv4 500 mLBrainBits LLCNb4-500
Neurobasal MediumThermoFisher Scientific21103-049
Neurobasal-A MediumThermoFisher ScientificA13710-01
Pluronic F-127Sigma AldrichP2443
ReLeSRStem Cell Technologies5872
Plasticware
30 mm cage cube systemThorLabsCM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, largeStem Cell Technologies27250
546 nm short-pass excitation filterSemrockFF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirrorSemrockFF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filterSemrockBLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filterSemrockBLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated LegsLuxeonStarLEDs10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture DishCorning3261
Heat sinkLuxeonStarLEDsLPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterilePluriSelect43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterilePluriSelect43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mALuxeonStarLEDsSP-05-R5
ring-actuated iris diaphragmThorLabsSM1D12D
T-Cube LED driversThorLabsLEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"McMaster91920A046
Low-Profile C-ClampMcMaster1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphateMillipore SigmaA9501-1G
CHIR 99021, 10 mgTocris4423/10
DAPT 10 mgR&D Systems2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µgMiltenyl Biotec130-096-336
Human Vitronectin Protein, CFR&D Systems2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CFR&D Systems2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human ProteinThermoFisher ScientificPHG0078
Laminin mouse protein, naturalThermoFisher Scientific23017015
Recombinant Human Agrin ProteinR&D Systems6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ugR&D Systems212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ugCell SciencesCRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4Cell SciencesCRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-TerminusR&D Systems1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ugPeprotech450-02
Retinoic Acid, 50 mgMillipore SigmaR2625-50
SAG Smoothened AgonistMillipore Sigma566660
SB431542 10 mgStem Cell Technologies72234
StemMACS LDN-193189Miltenyl Biotec130-103-925
Vitronectin from human plasmaMillipore SigmaV8379-50UG
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)Abcamab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)MilliporeAB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)DakoM076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)DSHBMF20
Equipment
Arduino Uno R3ArduinoA000066
Automated stageApplied scientific instrumentationMS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell CounterMarshal ScientificI-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscopeOlympusIX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator SystemTokai Hit STXTOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS CameraAndor TechnologyZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)ArduinoIDE 1.8.19
MastercamMastercamMastercam for Solidworks
MatlabMatlabR2021b
NIS elementsNikonBasic Research
Solidworks 3D CADSolidworksSolidworks Standard

References

  1. Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
  2. Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G. In vitro models of neuromuscular junctions and their potential for novel drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (3), 307-317 (2020).
  3. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  4. Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  7. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature Biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Bianchi, F., et al. Rapid and efficient differentiation of functional motor neurons from human iPSC for neural injury modelling. Stem Cell Research. 32, 126-134 (2018).
  10. Turan, S., Farruggio, A. P., Srifa, W., Day, J. W., Calos, M. P. Precise correction of disease mutations in induced pluripotent stem cells derived from patients with limb girdle muscular dystrophy. Molecular Therapy. 24 (4), 685-696 (2016).
  11. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  12. Lin, C. -. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2021).
  13. Centeno, E. G. Z., Cimarosti, H., Bithell, A. 2D versus 3D human induced pluripotent stem cell-derived cultures for neurodegenerative disease modelling. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 27 (2018).
  14. Okano, T., Matsuda, T. Tissue engineered skeletal muscle: preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplantation. 7 (1), 71-82 (1998).
  15. Powell, C. A., Smiley, B. L., Mills, J., Vandenburgh, H. H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (5), 1557-1565 (2002).
  16. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  17. Guo, X., et al. A human-based functional NMJ system for personalized ALS modeling and drug testing. Advanced Therapeutics. 3 (11), 2000133 (2020).
  18. Vila, O. F., et al. Bioengineered optogenetic model of human neuromuscular junction. Biomaterials. 276, 121033 (2021).
  19. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  22. Steinbeck, J. A., et al. Functional connectivity under optogenetic control allows modeling of human neuromuscular disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
  23. Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
  24. Phillips Ii, L. H. The epidemiology of myasthenia gravis. Annals of the New York Academy of Sciences. 998 (1), 407-412 (2003).
  25. Sanders, D. B., et al. Does change in acetylcholine receptor antibody level correlate with clinical change in myasthenia gravis. Muscle & Nerve. 49 (4), 483-486 (2014).
  26. Vernino, S. Unraveling the enigma of seronegative myasthenia gravis. JAMA Neurology. 72 (6), 630-631 (2015).
  27. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons. Science Advances. , (2018).
  28. Paredes-Redondo, A., et al. Optogenetic modeling of human neuromuscular circuits in Duchenne muscular dystrophy with CRISPR and pharmacological corrections. Science Advances. 7 (37), (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved