İnsan Nöromüsküler Kavşağının Optogenetik Modelinin Mühendisliği ve Karakterizasyonu

Özet

İnsan mühendisliği iskelet kası dokusu ve optogenetik motonöronlar kullanarak nöromüsküler kavşak fonksiyonunu karakterize etmek için tekrarlanabilir, otomatik ve tarafsız bir görüntüleme sistemi tanımladık. Bu sistem, zaman içinde nöromüsküler bağlantının fonksiyonel olarak ölçülmesine izin verir ve nörotoksinlerin ve myastenia gravis hasta serumunun neden olduğu azalmış nöromüsküler fonksiyonu tespit eder.

Özet

Myastenia gravis (MG) gibi birçok nöromüsküler hastalık, hayvanlar ve insanlar arasındaki fizyolojik farklılıklar nedeniyle hayvan modellerinde karakterize edilmesi zor olan nöromüsküler kavşağın (NMJ) işlev bozukluğu ile ilişkilidir. Doku mühendisliği, NMJ patolojilerini teşhis etmek ve araştırmak ve potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilecek fonksiyonel insan NMJ'lerinin in vitro modellerini sağlama fırsatları sunar. Optogenetik proteinleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) dahil ederek, ışığın belirli dalga boylarıyla uyarılabilen nöronlar ürettik. NMJ sağlıklı ve işlevsel ise, motonörondan gelen nörokimyasal bir sinyal kas kasılmasıyla sonuçlanır. Optogenetik ve mikrofabrikasyonun doku mühendisliği ile entegrasyonu sayesinde, video analizi kullanarak NMJ fonksiyonunu karakterize etmek için tarafsız ve otomatik bir metodoloji oluşturduk. NMJ oluşumu, eşzamanlı video kaydı ile optik stimülasyon ve doku kontraktilitesinin video analizi için standartlaştırılmış bir protokol geliştirilmiştir. İskelet kası kasılmalarını indüklemek için optogenetik motonöronların ışıkla uyarılması, insan NMJ fizyolojisini özetler ve zaman içinde ve çeşitli girdilere yanıt olarak NMJ'nin tekrarlanan fonksiyonel ölçümlerine izin verir. Bu platformun zaman içinde nöromüsküler bağlantıda fonksiyonel iyileşmeler gösterme yeteneğini gösteriyoruz ve hasta MG antikorlarının veya nörotoksinlerin NMJ fonksiyonu üzerindeki zararlı etkilerini karakterize ediyoruz.

Giriş

Nöromüsküler kavşak (NMJ), kas kasılmasına izin veren motonöronlar (MN'ler) ve iskelet kası hücreleri (SkM) arasındaki kimyasal sinapstır. Nörotoksin α-bungarotoksin (BTX) gibi toksinler veya myastenia gravis (MG) gibi nöromüsküler hastalıklar (NMD) NMJ'nin dejenerasyonuna ve kas kontrolünde azalmaya neden olabilir¹. Biyomühendislik ürünü insan doku modelleri, insan NMJ'lerinin fonksiyonel ve fizyolojik mekanizmalarını daha iyi özetler ve hayvan modellerinden daha fazla translasyonel potansiyel sunar.

Hayvan modelleri, NMJ'nin oluşumu ve işlevinin anlaşılmasını ilerletirken, insan ve hayvan sinapsları arasında, sonuçların insanlara çevirisini sınırlayan ve NMJ'nin in vivo karakterizasyonunu^{zorlaştıran önemli} farklılıklar vardır. ^2,3,4. Fareler, insan NMJ'leri⁴ ile karşılaştırıldığında daha büyük NMJ'lere ve daha küçük aktif bölge yoğunluklarına sahiptir. Ek olarak, hayvan modellerinde yapılan ilaç çalışmaları her zaman insan klinik çalışmalarında bulunan etkileri yansıtmamaktadır. Tasarlanmış insan doku modelleri, NMJ'nin sağlıklı gelişimini ve nöromüsküler hastalıkların patolojisini inceleme fırsatı sunar ve ilaç taramalarına izin verir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler)⁵, iskelet kası hücreleri^6,7 ve motonöronlar ^8,9 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine ayrılabilir. hiPSC'ler hasta hücrelerinden kolayca üretilebilir, bu da hastaya özgü doku modelleri aracılığıyla daha iyi hastalık^{modellemesi 10} ve ilaç taraması ^11,12 sağlar.

SkM'lerin ve MN'lerin iki boyutlu (2B) tek katmanlı ortak kültürleri, fizyolojik NMJ'lerin morfolojisi, fenotipi, organizasyonu ve fonksiyonel davranışından yoksundur. NMJ'ler, analiz için motor birimlerin izolasyonunu engelleyen, doğru fonksiyonel ölçümleri sınırlayan ve tekrarlanan, sistematik deneyler için kullanımlarını önleyen 2D kültürde rastgele^oluşur13 . NMJ'lerin üç boyutlu (3D) doku modelleri, fizyolojik NMJ'lerin 7,14,15,16,17'nin morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini özetleyerek bu sınırlamaların çoğunun üstesinden ^gelir. Bu modeli kullanarak, iki doku tipi ayrı ayrı geliştirilir ve daha sonra aksonal büyümeyi yönlendirerek entegre edilir ve 2D kültür sistemlerine kıyasla daha organize NMJ'lerin gelişmesine izin verilir.

Önceki çalışmamız, optogenetiğin doku mühendisliği ile birleştirilmesinin doğru non-invaziv stimülasyona ve NMJ fonksiyonunun değerlendirilmesine izin verebileceğini göstermiştir^18,19. Genetik mühendisliği sayesinde, ışığa duyarlı proteinler hiPSC'lerin genomuna entegre edilebilir. Mavi ışığa tepki olarak açılan bir iyon kanalı olan channelrhodopsin-2'yi (ChR2), nöronlar gibi uyarılabilir hücrelerin zarına entegre etmek, hücre aktivasyonu^20,21,22 üzerinde temassız mekansal zamansal kontrol ^sağlar. ChR2 taşıyan hiPSC'ler, mavi ışığa duyarlı optogenetik motonöronlara ayrılabilir, nöronları uyaran tipik invaziv elektrotlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve kas hücrelerinin elektrotlar tarafından istenmeyen şekilde uyarılmasını önler²³. Bu sistem, optogenetik olmayan iskelet kası hücrelerinde kasılmaları uyarmak için optogenetik motonöronları kullanır. Video yakalama ve kontrollü mavi ışık aydınlatmasını birleştirmek, ko-kültürlü dokuların aynı anda uyarılmasını ve NMJ işlevi için kaydedilmesini sağlar.

MG, nikotinik asetilkolin reseptörlerini (AChR) hedef alan otoantikorlardan kaynaklanır ve bu da NMJ fonksiyonunun azalmasına ve kas güçsüzlüğüne neden olur²⁴. Sunulan semptomlara, elektro tanıya ve serolojik kan testleri ile otoantikorların saptanmasına dayanarak teşhis edilir. Bununla birlikte, MG'de rol oynayan tüm otoantikorlar tanımlanmamıştır ve bazı seronegatif hastalara MG tanısı konmuştur, ancak tanınmış antikorları yoktur^25,26. Sistemimiz, MG hastalarından serum eklenmesinden önce ve sonra NMJ'nin tekrarlanan fonksiyonel değerlendirmesine izin vererek, MG antikorlarının neden olduğu fonksiyonel ve biyokimyasal değişiklikler hakkında paha biçilmez bir fikir verir¹⁸. Protokolümüz, NMJ patolojilerini teşhis etmek ve araştırmak ve potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilecek fonksiyonel insan NMJ'nin 3D in vitro modellerinin nasıl üretileceğini göstermektedir. Sistemin çok yönlülüğünü iki platformda, bir mikroakışkan cihazda ve daha büyük bir açık kuyulu biyoreaktör platformunda gösteriyoruz.

Protokol

Bu çalışma için tüm hücre hatları, Columbia Üniversitesi, NY, ABD'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak oluşturulmuş ve kullanılmıştır.

1. Biyoreaktör hazırlığı

1. Biyoreaktör kalıpları yapın
   1. Ek CAD Dosyasından bir biyoreaktör CAD dosyası indirin veya özel bir tasarım oluşturun.
   2. CAM yazılımını kullanarak 3B modelden bir CNC takım yolu oluşturun.
   3. CNC freze makinesi kullanarak asetal kalıpları işleyin.
2. Biyoreaktörlerin imalatı
   1. Polidimetilsiloksanın kürleyici ajan karışımına 10: 1'lik bir baz karıştırın (PDMS, 4 platform / kalıp başına 77 g karışım).
   2. Karışımı bir vakum odasına yerleştirin, tüm vanaları kapatın, vakumu açın ve hava kabarcıkları kalmayana kadar karışımı en az 30 dakika boyunca gazdan arındırın. Karışımı kalıplara dökün ve kalıpları vakum odasında 1 saat boyunca gazdan arındırın.
   3. Kalıpları, kalıbın üst yarısı doğru yönde olacak şekilde kapatın. Merkeze çelik altıgen bir çubuk yerleştirin ve her iki tarafa da kelepçeleyin.
   4. Üst kısmı PDMS ile doldurun.
   5. Kalıpları 65 °C fırında en az 4 saat kürleyin.
   6. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra platformları kalıplardan çıkarın.
   7. Ultrasonik bir banyodaki cihazları 1 saatlik bulaşık sabunu döngüsü, 400 mL% 100 izopropanol ve damıtılmış su kullanarak temizleyin.
   8. 65 °C'de gece boyunca kurutun.
   9. Cam kapakları 30 dakika boyunca% 1 iyonik olmayan yüzey aktif madde polyoluna batırın ve örtülerin istiflenmediğinden emin olun, böylece hepsi düzgün bir şekilde kaplanır.
   10. Damıtılmış suyla iyice durulayın ve 65 ° C'de gece kurutun.
   11. Tedavi cam kapaklarına ve PDMS platformuna 1-2 dakika boyunca 6 L / dak oksijen içeren yüksek bir plazma temizleyici kullanın. Tedavi edildikten sonra, PDMS'yi en az 30 saniye boyunca kapak kapağına bastırarak ikisini birbirine bağlayın.
   12. Hücre eklemeden önce bağlı cihazları otoklav yapın.

2. Optik stimülasyon kurulumu oluşturma

1. 30 mm'lik bir kafes küp sistemi kullanarak, merkeze 573 nm dikroik ayna takın. Kırmızı bir 627 nm LED'i 594 nm uzun geçişli uyarma filtresi ile birleştirin ve LED aynaya bakacak şekilde küpün üst tarafına takın. Ardından, küpün bitişik tarafına 546 nm kısa geçişli uyarma filtreli mavi bir 488 nm LED takın ve LED, Şekil 3A'daki şemada gösterildiği gibi aynaya bakar.
2. Aydınlatılmış alanın boyutunu kontrol etmek için kafes küpünün altına halka tahrikli bir iris diyaframı takın.
3. Her LED'e bir T-Cube LED sürücüsü ile güç verin ve bir Arduino Uno Rev3 kartı ile kontrol edin. LED sürücüsünün yan girişini bir güç kaynağı fişine bağlayın, orta çıkışı Arduino'ya bağlayın ve yan çıkışı doğrudan LED'lere bağlayın.
4. Arduino Uno'yu bir USB kablosuyla bir PC'ye bağlayın.
5. GitHub bağlantısından dosya indirin (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).
6. GitHub klasöründen "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" dosyasını açın.
7. Başlangıç parametrelerini ayarlayın: Adımlar = 30; startFrequency = 0,5; endFrequency = 3; pulseLength = 100.
8. Pin çıkışı 4'ün Mavi LED sürücüsüne, pin çıkışının 2'nin Kırmızı LED sürücüsüne atandığından emin olun. LED sürücüsünün orta kablolarının toprağa ve ilgili pim çıkışına bağlı olduğunu kontrol edin.
9. "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" programını Arduino'ya derleyin ve yükleyin.
10. Her LED sürücüsünü karşılık gelen kanala bağlayın.

3. Hücre kültürü kurulumu (gün -21-0)

1. Birincil iskelet kası hücreleri
   1. Miyotonik büyüme ortamı (+ takviyesi) kullanılarak maksimum altı pasaj için birincil iskelet miyoblastlarını (Cook Miyozit'ten elde edilen) çözün ve genişletin. Hücreleri 37 ° C'ye ve% 5 CO_2'ye ayarlanmış bir inkübatörde tutun.
   2. Medyayı her 2 günde bir değiştirin.
   3. Hücreler yaklaşık% 60 birleştiğinde,% 0.05 Tripsin-EDTA (1x, 37 ° C'de 5 dakika boyunca) kullanarak bunları geçirin. Ayrışmış hücreleri toplayın ve tripsini nötralize etmek için taze medya ekleyin.
   4. Hücreleri 300 x g'da döndürün ve süpernatantı hücre peletinin üzerine aspire edin.
   5. MGM ve tohum 1: 3 ile hücreleri üç katmanlı şişe başına 60 mL ile yeniden askıya alın.
2. ChR2-hiPSC
   NOT: Bu çalışma için tüm hücre hatları, Columbia Üniversitesi, NY, ABD'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak oluşturulmuş ve kullanılmıştır. Bu protokolde, ChR2 eksprese eden hiPSC'ler, daha önce tarif edilen yöntemler¹⁸ kullanılarak CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi yoluyla üretildi, ancak herhangi bir kararlı optogenetik hücre hattı (lentiviral, piggyBac, vb.) aynı şekilde kullanılabilir. Hem iPSC'lerde hem de motonöronlarda eksprese edilen kurucu promotörler seçildi (CAG). Hücrelerin, önceki yayınlarda belirtildiği gibi sağlıklı karyotipe sahip olduğu bulundu^18,19.
   1. 6 delikli plakaları DMEM/F12'de (1:80) seyreltilmiş 1 mL/kuyucuk çözünür bazal membran matrisi ile kaplayın ve plakaları oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
   2. 2 mL besleyicisiz hücre kültürü ortamına (iPSC medya) sahip kaplamalı 6 delikli plakalar üzerinde tohum iPSC'leri, her gün 2 mL ortam alışverişi yapar ve her 5-7 günde bir geçer. Hücreleri 37 ^{° C'ye ve% 5 CO 2'ye} ayarlanmış bir inkübatörde tutun.
   3. Pasaj
      1. 1 mL enzimsiz kök hücre salgılayıcı reaktif ile 4 dakika boyunca inkübe ederek ve geniş uçlu P1000 pipetle mekanik olarak keserek kök hücreleri ayırın.
      2. Kaplanmış 6 delikli plakalar üzerine 2 mL/kuyucuk içinde 2 μM Y-27632 dihidroklorür ile iPSC ortamında 1:24 veya 1:48 oranında tohum hücreleri.

4. İskelet kası dokusu tohumlaması (gün -3)

1. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak 30 x 10⁶ miyoblastı izole edin ve sayın.
2. Miyoblastları 4:1 karışım 3 mg/mL kollajen I ve çözünür bazal membran matrisinde (800 μL kollajen karışımı + 200 μL bazal membran matrisi 1 mL'lik son hacme ulaşmak için) yeniden askıya alın. Kollajen bileşeni için, beraberindeki nötralize edici maddeyi (nötralize edici maddeye 9: 1 kollajen karışımı) ekleyin ve 800 μL'lik bir hacim elde etmek için karışımı 1x PBS ile seyreltin.
3. Biyoreaktörün her kas odasına 15 μL hücre-kollajen süspansiyonu ekleyin ve pipet ucunu kullanarak süspansiyonu her iki direğe de yaydığınızdan emin olun (Şekil 2).
4. Hücre-jel karışımının 30 dakika boyunca 37 ° C'de polimerize olmasına izin verin ve ardından her bir biyoreaktörü 450 μL Miyotonik büyüme ortamı ile iyice doldurun.
5. 3 gün sonra (jel sıkıştırıldıktan sonra), miyotüp farklılaşmasına başlayın.

5. Miyotüp farklılaşması (gün 0-14)

1. Dokuları 7 gün boyunca 450 μL füzyon indükleyici ortama (FS, Tablo 1) geçirerek ve medyayı her geçen gün değiştirerek miyotüp infüzyonuna başlayın.
   NOT: Her iki hücre tipinin farklılaşma programlarının sonunda motonöronları tohumlamak için hiPSC'lerden motonöron farklılaşması ile aynı gün miyotüp farklılaşmasına başlamaya çalışın.
2. 7. günde ortamı 450 μL olgunlaşma ortamı Ia olarak değiştirin (MMIa, Tablo 1).
3. 9. günde, 450 μL olgunlaşma ortamı Ib olarak değiştirin (MMIb, Tablo 1).
4. 11. günde, medyayı 450 μL NbActiv4 olarak değiştirin. Motonöronlar tohumlanana kadar her 2 günde bir medyayı değiştirmeye devam edin (Adım 7).

6. Motonöron farklılaşması (gün 0-14)

NOT: Motonöron farklılaşma protokolümüz Maury ve ark.^8'den uyarlanmıştır.

1. 0. günde, 4 x 10⁶ ChR2- hiPSC'leri, 15 mL motonöron süspansiyon kültürü ortamına sahip ultra düşük bağlantılı bir Petri kabına aktarın (MSCM, Tablo 1). 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrat ve 5 μM Y-27632 dihidroklorür ile MSCM takviyesi.
2. 2. günde, nörosferleri (NS) 37 μM geri dönüşümlü süzgeç ile izole edin ve 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 hidrat ve 0.1 μM retinoik asit ile 15 mL MSCM'de yeniden plakalayın. NS, 2. günden sonra mikroskop kullanmadan Petri kabında görünür olmalıdır.
3. 4. günde, hücreleri ve medyayı 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve nörosferlerin dibe çökmesine izin verin (5 dakika). Süpernatantı aspire edin ve hücreleri 0.5 μM SAG, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431541 ve 0.1 μM retinoik asit ile desteklenmiş 15 mL MSCM'de yeniden askıya alın.
4. 7. günde, Adım 6.3'ü tekrarlayın. ancak hücreleri 0.5 μM SAG ve 0.1μM retinoik asit ile desteklenmiş 15 mL MSCM'de yeniden askıya alın.
5. 9. günde, Adım 6.3'ü tekrarlayın. ancak 10 μM LAPT ile desteklenen 15 mL MSCM'deki hücreleri yeniden askıya alın.
6. 11. günde, Adım 6.3'ü tekrarlayın. ancak hücreleri 20 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ile desteklenmiş 15 mL MSCM'de yeniden askıya alın.
7. 14. günde, motonöronları platforma tohumlayın.

7. Biyoreaktörde motonöronların toplanması (14. gün)

1. 2 mg / mL kollajen I ve Matrigel'den oluşan 4: 1 jel karışımı hazırlayın (1 mL'lik bir son hacme ulaşmak için 800 μL kollajen karışımı + 200 μL Matrigel). Kollajen bileşeni için, beraberindeki nötralize edici maddeyi (nötralize edici maddeye 9: 1 kollajen karışımı) ekleyin ve 800 μL'lik bir son hacim elde etmek için karışımı 1x PBS ile seyreltin.
2. Büyük nörosferleri seçmek ve jel karışımında yeniden askıya almak için 400 nm hücre süzgeci kullanın.
3. Rezervuardan ve dikkatlice nörosferden gelen ortamları aspire edin (Şekil 2).
4. Nörosfer kanalına 15 μL jel karışımı ekleyin.
5. 10 μL'lik bir pipeti 10 μL jel ile doldurun ve ardından bir nörosfer seçin.
6. NS'yi nörosfer kanalına yatırın ve NS'nin odada olduğundan emin olun. NS biriktikten sonra kalan jeli serbest bırakırken pipeti yavaşça kaldırın. NS'nin doğru şekilde yatırıldığından emin değilseniz, bir mikroskop kullanarak yerini kontrol edin.
7. Jelin 37 °C'de 30 dakika polimerize olmasına izin verin.
8. Rezervuarlara 20 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ile desteklenmiş 450 μL NbActiv4 ekleyin.
9. NS'den kas dokusuna aksonal büyümeye izin vermek için medyayı her geçen gün değiştirin.

8. NMJ fonksiyonunun eşzamanlı optik stimülasyonu ve video kaydı (24+ gün)

1. Görüntüleme için, bilimsel bir tamamlayıcı metal-oksit-yarı iletken (sCMOS) kameraya sahip ters çevrilmiş bir floresan mikroskop kullanın.
2. Kamera yazılımı gruplamasını 2x2'ye, pozlamayı 20 ms'ye, panjuru AÇIK, okuma hızını 540 MHz'e, dinamik aralık: 12 bit ve kazanç 1'e ve sensör modu: üst üste binmeye ayarlayın.
3. Mikrodokuları görüntülemek için mikroskopta 2x objektif kullanın.
4. Mikroskop aşamasına bir canlı hücre odası (37 °C, % 5 CO₂) takın.
5. Dosya boyutunu ve işleme süresini en aza indirmek için innerve iskelet dokuları dokusunu içeren ilgili bölgeyi (ROI) seçin.
6. Fotoğraf makinesinden gelen mavi ışık darbelerini filtrelemek için numune ile görüntüleme hedefi arasına 594 nm uzunluğunda bir emisyon filtresi yerleştirin.
7. Canlı hücre odasına 4 biyoreaktör (24 doku) içeren dikdörtgen 4 delikli bir plaka yerleştirin.
8. Live View'ı (Canlı Görünüm) tıklayın. Görüntüyü istediğiniz yatırım getirisi ile ortalayın ve odaklayın.
9. Sahne alanı konumunu, Arduino panosunu ve video alımını denetlemek için GitHub klasöründen (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) özel makro kodunu yükleyin.
10. Çıkış filmini şu şekilde ayarlayın: day_tissue group_tissue name_experiment.nd2.
11. Makro kodunu sahne alanında ayarlanmış istenen X,Y koordinatlarıyla çalıştırın ve 50 kare/sn'de 1700 kare ile hızlı bir zaman atlaması elde edin.
12. Görüntülemeden sonra ortamı değiştirin ve numuneleri inkübatöre geri gönderin. Doku yorgunluğunu önlemek için görüntü yakalama oturumları arasında en az 24 saat bekleyin.

9. Toplu işleme ve analiz (24. gün)

1. Film işleme
   1. Toplu analizde videoları işlemek için özel MATLAB kodunu kullanın. Dosyalar GitHub klasöründen indirilebilir (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis). İşlevler Tablo 2'de listelenmiş ve açıklanmıştır.
      NOT: Kod .nd2 ve .czi biçimleriyle uyumludur. MATLAB'da paralel işlemenin etkinleştirilmesini gerektirir ve biyoformat paketine ihtiyaç duyar.
   2. Filmleri paralel işleme yoluyla analiz etmek için recursiveOSAnalysis komut dosyasını çalıştırın. Edinilen tüm videoları aynı klasörde bulundurun ve kodu çalıştırırken bu klasörü seçin.
   3. Analiz sonrası parametreleri gerektiği gibi ayarlayın.
      1. Kayıt başlangıcında kendiliğinden kasılma yakalanırsa taban çizgisini değiştirinTime (seçenek 1). Bu, 0'ın üzerinde bir ilk okuma yolu gösterecek ve telafi etmek için çerçevenin kaydırılmasını gerektirecektir.
      2. Kasılmalar kaydedilmiyorsa peakThreshold'i (seçenek 2) değiştirin. Kod, varsayılan olarak en yüksek tepe noktasının %25'inin üzerinde olan kasılmaları algılar, böylece bu değer değiştirilebilir.
      3. Her tepe noktasının başlangıcını algılarken hassasiyeti ayarlamak için minMinProminence ve minMinWidth değerlerini değiştirin.
   4. Video ve grafik çıktısı oluşturun.
      1. RecursiveOSMovie komutunu çalıştırarak her doku için kendi kontraktilitesi izine sahip bir video dosyası oluşturun.

10. NMJ fonksiyonunun bozulması (24. gün+)

1. 20 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ile desteklenen NbActiv4 bazal ortama harici efektör ekleyerek tedavi ortamı hazırlayın.
   1. MG sera deneyi için, NbActiv4 + BDNF + GDNF'de% 20 MG hasta serumunu kullanın.
   2. BTX deneyi için NbActiv4 + BDNF + GDNF'de 5 μg/mL BTX kullanın.
2. Adım 3.2'yi kullanarak uyarın/görüntüleyin. tıklayarak taban çizgisini kaydedin.
3. Dokulardaki ortamı tedavi ortamı (450 μL/doku) ile değiştirin.
4. İstenilen süre boyunca inkübe edin (hasta serumları için 48 saat, BTX için 20 dakika).
5. Adım 3.2'yi kullanarak tekrar uyarın/görüntüleyin. tedaviden sonra fonksiyonu kaydetmek için.
6. Tedavi ortamını çıkarın ve dokuların istenen süre dinlenmesine izin verin (serumların çıkarılmasından 48 saat sonra)
   NOT: Doku yorgunluğunu önlemek için stimülasyon ve görüntüleme arasında en az 24 saat bekleyin

Sonuçlar

Nöromüsküler kavşaklar, optogenetik hiPSC türevi motonöronların optogenetik olmayan iskelet kası dokusu ile birlikte kültürlenmesiyle oluşturuldu. İnsan primer iskelet miyoblastları (SkM) platformlara tohumlandı ve 2 haftalık protokol kullanılarak çok çekirdekli miyotüplere farklılaştırıldı. Optogenetik motonöronlar ayrı ayrı, ancak miyotüp farklılaşmasına paralel olarak farklılaştırıldı ve daha sonra platforma tohumlandı (Şekil 1). Dokular, MN tohumlama...

Tartışmalar

Bu sistem, NMJ fonksiyonunun otomatik ve tarafsız bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için optogenetik ve video işlemeyi birleştiren tasarlanmış bir 3D insan dokusu modelidir. Standartlaştırılmış bir protokol kullanarak, fizyolojik gelişim sırasında NMJ fonksiyonundaki değişiklikleri ölçme ve nörotoksin maruziyeti ve myastenia gravis hasta serumları gibi patolojilerin zararlı etkilerini karakterize etme yeteneğini gösterdik.

Önceki çalışmalar, MG hastası ser...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
SkMDC	Cook Myosite	P01059-14M
Media and Supplements
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	12634-020
Bovine Serum Albumin solution	Millipore Sigma	A9576-50ML
G-5 Supplement (100X)	ThermoFisher Scientific	17503-012
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	10131-035
Insulin, Recombinant Human	Millipore Sigma	91077C-100MG
Matrigel	Corning	354277
mTeSR Plus	Stem Cell Technologies	100-0276
MyoTonic Growth Media Kit	Cook Myosite	MK-4444
N-2 Supplement	ThermoFisher Scientific	17502-048
NbActiv4 500 mL	BrainBits LLC	Nb4-500
Neurobasal Medium	ThermoFisher Scientific	21103-049
Neurobasal-A Medium	ThermoFisher Scientific	A13710-01
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	P2443
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872
Plasticware
30 mm cage cube system	ThorLabs	CM1-DCH, CP33, ER1-P4 and ER2-P4
37 µm Reversible Strainer, large	Stem Cell Technologies	27250
546 nm short-pass excitation filter	Semrock	FF01-546/SP-25
573 nm dichroic mirror	Semrock	FF573-Di01–25x36
594 nm long- pass emission filter	Semrock	BLP01-594R-25
594 nm long-pass excitation filter	Semrock	BLP01-594R-25
Blue (470nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm Circular Beam Optic - Integrated Legs	LuxeonStarLEDs	10413
Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish	Corning	3261
Heat sink	LuxeonStarLEDs	LPD-19-10B
Optics
pluriStrainer 400 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50400-03
pluriStrainer 500 µm, 25 pack, sterile	PluriSelect	43-50500-03
Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm Square Base - 65 lm @ 700mA	LuxeonStarLEDs	SP-05-R5
ring-actuated iris diaphragm	ThorLabs	SM1D12D
T-Cube LED drivers	ThorLabs	LEDD1B, KPS101
Molds
Female Threaded Hex Standoffs,  3 1/2" 10-32, Partially Threaded 1/2"	McMaster	91920A046
Low-Profile C-Clamp	McMaster	1705A12
Growth Factors
Adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate	Millipore Sigma	A9501-1G
CHIR 99021, 10 mg	Tocris	4423/10
DAPT 10 mg	R&D Systems	2634/10
Human CNTF, research grade, 5 µg	Miltenyl Biotec	130-096-336
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
Human Vitronectin Protein, CF	R&D Systems	2349-VN-100
IGF1 Recombinant Human Protein	ThermoFisher Scientific	PHG0078
Laminin mouse protein, natural	ThermoFisher Scientific	23017015
Recombinant Human Agrin Protein	R&D Systems	6624-AG-050
Recombinant Human GDNF Protein, CF 50ug	R&D Systems	212-GD-050/CF
Recombinant Human Neurotrophin 3 100 ug	Cell Sciences	CRN500D
Recombinant Human Neurotrophin-4	Cell Sciences	CRN501B
Recombinant Human Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Terminus	R&D Systems	1845-SH-100
Recombinant Human/Murine/Rat BDNF 50 ug	Peprotech	450-02
Retinoic Acid, 50 mg	Millipore Sigma	R2625-50
SAG Smoothened Agonist	Millipore Sigma	566660
SB431542 10 mg	Stem Cell Technologies	72234
StemMACS LDN-193189	Miltenyl Biotec	130-103-925
Vitronectin from human plasma	Millipore Sigma	V8379-50UG
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
Antibodies
α-actinin mAb (Mouse IgG1)	Abcam	ab9465
Choline Acetyltransferase (ChAT) (Goat)	Millipore	AB144P
Desmin mAb (Mouse IgG1)	Dako	M076029-2
Myosin Heavy Chain (MHC) (Mouse IgG2b)	DSHB	MF20
Equipment
Arduino Uno R3	Arduino	A000066
Automated stage	Applied scientific instrumentation	MS- 2000 XYZ
Expanded plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess Automated Cell Counter	Marshal Scientific	I-CACC
IX-81 Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX-ILL100LH
Series Stage Top Incubator System	Tokai Hit STX	TOKAI-HIT-STXG
Zyla 4.2 sCOMS Camera	Andor Technology	ZYLA-4.2P-CL10
Software
Arduino Software (IDE)	Arduino	IDE 1.8.19
Mastercam	Mastercam	Mastercam for Solidworks
Matlab	Matlab	R2021b
NIS elements	Nikon	Basic Research
Solidworks 3D CAD	Solidworks	Solidworks Standard