جرعات البلعة الوريدية المتعددة وتقييم الدورة الدموية الغازية في نموذج ارتفاع ضغط الدم في الشريان الرئوي الناجم عن نقص الأكسجة في الفئران

Summary

يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لتنفيذ إعطاء جرعة بلعة متعددة عن طريق الوريد ومراقبة الدورة الدموية الغازية في الفئران. يمكن للباحثين استخدام هذا البروتوكول لفحص المركب العلاجي المستقبلي لارتفاع ضغط الدم في الشريان الرئوي.

Abstract

ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي (PAH) هو مرض تدريجي يهدد الحياة ، ويؤثر بشكل أساسي على الشرايين الرئوية الصغيرة في الرئة. حاليا ، لا يوجد علاج ل PAH. من المهم اكتشاف مركبات جديدة يمكن استخدامها لعلاج PAH. نموذج PAH الناجم عن نقص الأكسجة في الماوس هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لأبحاث PAH. يلخص هذا النموذج المظاهر السريرية البشرية لمرض PAH Group 3 وهو أداة بحثية مهمة لتقييم فعالية العلاجات التجريبية الجديدة ل PAH. غالبا ما يتطلب البحث باستخدام هذا النموذج إدارة المركبات في الفئران. بالنسبة للمركب الذي يجب إعطاؤه مباشرة في مجرى الدم ، يعد تحسين الإعطاء عن طريق الوريد (IV) جزءا أساسيا من الإجراءات التجريبية. من الناحية المثالية ، يجب أن يسمح نظام الحقن الوريدي بحقن متعددة خلال دورة زمنية محددة. على الرغم من أن نموذج PAH الناجم عن نقص الأكسجة في الفئران يحظى بشعبية كبيرة في العديد من المختبرات ، إلا أنه من الصعب تقنيا إجراء جرعات متعددة من البلعة الوريدية وتقييم الدورة الدموية الغازية في هذا النموذج. في هذا البروتوكول ، نقدم إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية إجراء جرعات متعددة من البلعة الوريدية عبر الوريد الوداجي للفأر وإجراء قسطرة البطين الشرياني والأيمن لتقييم الدورة الدموية في نموذج PAH الناجم عن نقص الأكسجة في الفئران.

Introduction

يتم تعريف ارتفاع ضغط الدم في الشريان الرئوي (PAH) من خلال متوسط الضغط الانقباضي للشريان الرئوي أكبر من 20 مم زئبق في الراحة ^1,2. إنه مرض تدريجي ومميت يتميز بارتفاع مستمر في الضغط الشرياني الرئوي ، مما يؤدي إلى الحمل الزائد للبطين الأيمن والموت في النهاية بسبب فشل البطين الأيمن¹. حاليا ، لا يوجد علاج ل PAH.

يعد استخدام النماذج الحيوانية لارتفاع ضغط الدم الرئوي أمرا مهما لاختبار فعالية علاجات PAH التجريبية. من بين هذه النماذج ، قدم نموذج PAH الناجم عن نقص الأكسجة في الفئران رؤى رئيسية حول تطور مرض PAH 3 البشري ^3,4. غالبا ما يتطلب البحث باستخدام هذا النموذج إدارة المركبات في الفئران لتقييم فعالية المركب الجديد وسلامته. لذلك ، يحتاج الباحثون إلى إجراء تجريبي مفصل للجرعات المركبة وقياسات الدورة الدموية لضمان اتساق الحقن واستنساخ قياس ضغط الدم من البداية إلى النهاية.

تم الإبلاغ عن طرق الحقن في الوريد (IV) وقياس ضغط الدم في الأدبيات ^5,6. ومع ذلك ، تفتقر المنهجية إلى التوضيح البصري والوصف التفصيلي. نوضح هنا الخطوات الرئيسية لحقن البلعة الوريدية الناجحة والقياس والتسجيل الدقيق لضغط الدم الجهازي والبطين الأيمن. تعد الإجراءات المعروضة هنا موردا مهما للباحثين المهتمين بالمسار الوريدي لمنصة الإدارة المركبة لتطوير علاج ل PAH.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل لجان رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة ييل.

1. تحضير والأدوات ومعدات قياس ضغط الدم وغرفة نقص الأكسجة

1. تأقلم.
   ملاحظة: كانت التجارب المستخدمة في هذه الدراسة من ذكور الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8 أسابيع والتي تزن 25-27 جم. يجب مراعاة عدة عوامل عند تقدير عدد المطلوبة للتجربة ، بما في ذلك الوفيات المرتبطة بالجراحة ، والمضاعفات الجراحية غير المتوقعة ، والموت المفاجئ غير المتوقع. استخدم ما لا يقل عن 10 فئران لكل مجموعة للوصول إلى القوة الإحصائية وتجنب الدراسات الضعيفة.
   1. عند الاستقبال ، قم بإيواء في أقفاص قوارض جيدة التهوية (مجموعات من خمسة لكل قفص) مزودة بفراش مناسب وتشاو القوارض والماء. دع تتأقلم مع البيئة الجديدة (دورة الضوء والظلام لمدة 12 ساعة عند 18-20 درجة مئوية) لمدة 3 أيام على الأقل.
   2. قم بتعيينهم عشوائيا إلى المجموعات التالية: Normoxia (المجموعة 1) ، نقص الأكسجة (المجموعة 2) ، ونقص الأكسجة + 7C1 / let-7 miRNA (المجموعة 3).
2. إعداد الأدوات الجراحية ومعدات قياس ضغط الدم.
   1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم (الشكل 1 أ).
   2. قم بإعداد منصة حقن مؤقتة مع مخروط أنف تخدير محلي الصنع (الشكل 1 ب) ، وحزم خياطة (الشكل 1 ج) ، ومعدات لإجراء PAH (الشكل 1D-F).
3. الإعداد التجريبي لتحريض ارتفاع ضغط الدم الرئوي (PAH).
   1. اضبط خزان N₂ ومستشعر الأكسجين وغرفة نقص الأكسجة شبه القابلة للإغلاق (الشكل 2 أ).
   2. قم بإنشاء نقطة ضبط بنسبة 10٪ O₂ في مستشعر الأكسجين ودع النظام يصل إلى الحالة المستقرة (الشكل 2B ، C).
   3. الحفاظ على نقص الأكسجة (المجموعة 2) ونقص الأكسجة + 7C1 / let-7 miRNA (المجموعة 3) في نقص الأكسجة (10٪ O₂) لمدة 3 أسابيع. بعد 3 أسابيع من نقص الأكسجة ، ضع تحت ظروف normoxic لمدة 1 أسبوع (الشكل 2D). تبقى مجموعة normoxic (المجموعة 1) في normoxia لمدة 4 أسابيع.
      ملاحظة: (1) 3 أسابيع من نقص الأكسجة تليها أسبوع واحد من normoxia هي طريقة راسخة لتطوير PAH وفشل القلب البطين الأيمن⁷. يكتشف مستشعر الأكسجين تركيز O₂ داخل غرفة نقص الأكسجة شبه القابلة للإغلاق ويصححها عن طريق ضخ غاز N₂ عبر أنبوب ضخ الغاز.
   4. فحص يوميا طوال مدة التجربة (3 أسابيع). استشر الطبيب البيطري إذا ظهرت على علامات الضيق مثل فقدان الوزن بشكل كبير وصعوبة التنفس. إذا كان القتل الرحيم ضروريا للحيوانات التي تعاني من ضائقة شديدة ، استبعد من الدراسة.
      ملاحظة: التعرض لنقص الأكسجة يسبب فقدان وزن جسم الفأر. عادة ما يتم استخدام فقدان 10٪ من وزن الجسم كمؤشر موثوق لتطور PAH.
   5. تجنب الفتح المكثف لغرفة نقص الأكسجة. لتنظيف القفص ، وتجديد الطعام ، وتغيير زجاجات المياه ، والإدارة المركبة ، افتح الغرف لمدة لا تزيد عن 1 ساعة في الأسبوع.

2. حقن البلعة الوريدية عن طريق الوريد الوداجي

1. إعداد الماوس والتخدير.
   1. أخرج نقص الأكسجة (المجموعة 2) ونقص الأكسجة + 7C1 / let-7 miRNA (المجموعة 3) أقفاص الماوس من غرفة نقص الأكسجة وقم بإزالة برفق من القفص.
      ملاحظة: نظام الجرعة ل 7C1 / let-7 miRNA (1.5 ملغ / كغ من الوريد / الجرعة) هو مرتين في الأسبوع لمدة 4 أسابيع من العلاج. يوصى بأن يأخذ الباحثون كلا من أقفاص نقص الأكسجة ونقص الأكسجة + العلاج المركب من غرفة نقص الأكسجة أثناء الحقن الوريدي للتأكد من أن جميع تتلقى نفس الحجم من التعرض لنقص الأكسجة في كل فترة زمنية.
   2. وزن الماوس باستخدام مقياس دقيق وتسجيل وزنه (الشكل 3 أ).
   3. ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير المتصلة بجهاز تبخير التخدير وأغلقه (الشكل 3 ب). توفير الدعم الحراري وتطبيق مزلق العين على كلتا العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير. تعريض الماوس ل 3٪ إيزوفلوران حتى يفقد الوعي (الشكل 3C-D).
   4. أخرج الماوس من الحجرة وحلق الفراء من الفك الجمجمة إلى منتصف القص الذيلي. أفقيا ، احلق الفراء من زوايا الفك ، من خلال جانبي الرقبة ، ونحو الكتفين (الشكل 3E).
   5. ضع الفأر المخدر بالإيزوفلوران في وضع ضعيف (جانب البطن لأعلى) على منصة حقن أسفل مجهر التشريح. حافظ على التخدير عن طريق مخروط الأنف بنسبة 1.5٪ إيزوفلوران وقم بتقييد الأرجل الأربعة برفق بشريط لاصق لشل حركة الجسم (الشكل 3F).
   6. ضع محفزا ضارا (أي قرصة إصبع القدم) باستخدام ملقط مستقيم لضمان مستوى مناسب من التخدير. يجب ألا يستجيب الفأر المخدر للتحفيز قبل وأثناء العملية الجراحية.
2. إعداد عامل الحقن.
   1. تحضير مركب حقن أحادي الجرعة بجرعة 1.5 ملغ/كغ تحت ظروف معقمة.
      ملاحظة: قم بتسخين مركب الحقن إلى درجة حرارة الغرفة (RT) لأن حقن المواد الباردة يمكن أن يسبب عدم الراحة وانخفاض درجة حرارة جسم الماوس (إذا كان هذا لا يضر المركب). تستند الجرعة المثلى ومدة المركب 7C1 / let-7 miRNA المستخدم في هذه الدراسة إلى المنشورات السابقة ^8,9.
   2. قم بتحميل المحقنة المعقمة ذات الاستخدام الواحد بالحجم المراد حقنه. امسك المحقنة في وضع مستقيم وادفع المكبس لطرد الهواء من المحقنة. لا تعيد استخدام المحقنة.
   3. الحد من حجم الحقن إلى 200 ميكرولتر في فأر 25 غرام للحد من حدوث تخفيف الدم والآثار القلبية غير الطبيعية على. إذا كانت هناك حاجة إلى حجم أكبر ، قسم مركب الحقن إلى حقنتين بفاصل 10 دقائق.
3. تحضير الماوس للحقن الوريدي.
   1. افرك المنطقة الجراحية برفق ثلاث مرات بثلاث جولات متناوبة من محلول البوفيدون واليود و 70٪ إيثانول. تطبيق البوبرينورفين (0.05 ملغ/ كغ، SQ) قبل 30 دقيقة من العملية الجراحية.
   2. قم بعمل قطع طولي 0.5 سم قليلا على يمين خط الوسط من الرقبة باستخدام شفرة مشرط (الشكل 3G).
   3. استخدم الملقط لفصل العضلات والأنسجة الدهنية لتحديد موقع الوريد الوداجي الخارجي الأيمن (الشكل 3H).
      ملاحظة: قم بتدوير مواقع الحقن في كل مرة لتجنب تكوين ندبة.
   4. استخدم عدسة موضوعية عالية الطاقة للسماح بتصور سهل لمنطقة الحقن (الشكل 3I).
4. الحقن الوريدي
   1. أدخل إبرة معقمة 28 جم في الوريد الوداجي مع توجيه شطبة الإبرة لأعلى (الشكل 3J ، K).
      ملاحظة: حقن الوريد الذيل هو بديل لحقن الوريد الوداجي. ومع ذلك ، يصعب تنفيذ هذه التقنية للجرعات المتكررة بسبب التباين في عمق الوريد ولون جلد ذيل الفئران وصلابة الجلد.
   2. اضغط ببطء على مكبس المحقنة لحقن المركب في الوريد. اترك الإبرة تبقى داخل الوريد لمدة 10 ثوان إضافية لمنع ارتجاع الحاقن (الشكل 3L).
      ملاحظة: تسمح الصبغة المزرقة بتصور سهل للحقن. لا تقم بتضمين الصبغة عند حقن مواد الاختبار. سيؤدي الحقن غير الدقيق إلى تراكم صبغة مزرقة حول موقع الحقن الوريدي.
   3. قم بإزالة الإبرة واستخدم قطعة قطن للضغط على موقع الحقن لمنع النزيف (الشكل 3M).
   4. خياطة الجلد مع خياطة 5-0 (الشكل 3N). بعد الجراحة ، انقل إلى منطقة دافئة ونظيفة وجافة وقدم ميلوكسيكام (1 مجم / كجم ، SQ، q24h). ضع في قفص استرداد نظيف بدون فراش ولكن الجزء السفلي مغطى بمنشفة ورقية.
      ملاحظة: يجب أن يكون الفأر مستيقظا من التخدير ويستعيد وعيه في غضون 5 دقائق بمجرد عودته إلى قفص التعافي. راقب الماوس بحثا عن علامات الضيق.
   5. أعد إلى قفص منزلها وأعد قفص الماوس إلى غرفة نقص الأكسجة.
      ملاحظة: يستغرق الإجراء بأكمله ، من تخدير الفأر إلى الانتهاء من حقن الوريد الوداجي ، حوالي 10-15 دقيقة بواسطة مجرب واحد. لتقصير التعرض للنورموكسيا في الفئران ، يوصى بأن يتعاون اثنان على الأقل من الباحثين لإنجاز إجراء حقن الوريد الوداجي.

3. قياس ضغط الدم

1. إعداد أدوات لقياس ضغط الدم.
   1. انقع طرف قسطرة 1.0 فهرنهايت في 37 درجة مئوية مسخنة مسبقا قبل 30 دقيقة على الأقل من قياس الدورة الدموية (الشكل 4 أ).
   2. قم بقياس المسافة من موقع إدخال القسطرة إلى موقع طرف القسطرة المطلوب. على سبيل المثال ، تبلغ المسافة بين الشريان الأورطي الصاعد للفأر إلى منتصف الرقبة حوالي 1-1.2 سم. المسافة بين البطين الأيمن للقلب إلى منتصف الرقبة حوالي 2.3-2.8 سم.
   3. ضع علامة على علامتين لمسافة القسطرة لتوفير مؤشر مرئي لعمق الإدخال (الشكل 4 ب).
   4. قم بتوصيل القسطرة بمحول الضغط ، وقم بتوصيل محول الضغط بقناة الإدخال 1 على جهاز الحصول على البيانات ، وقم بتشغيل وحدة التحكم في حجم الضغط ، وابدأ برنامج تحليل ضغط الدم للحصول على البيانات. قم بإنشاء مستند جديد لتحليل ضغط الدم واضبط القناة 1 للضغط.
   5. قم بإجراء معايرة الضغط وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. اسمح للإعداد بأكمله بالاستقرار لمدة 5 دقائق على الأقل (الشكل 4C).
   6. في برنامج تحليل ضغط الدم ، حدد تحويل الوحدات من القائمة المنسدلة للقناة 1 (الشكل 4D ، السهم الأحمر).
   7. قم بتعيين قيم تحويل الوحدات الافتراضية (الشكل 4E).
      ملاحظة: يتم تمثيل ضغط الدم كمليمترات من الزئبق (مم زئبق). خرج الضغط القياسي من وحدة التحكم في الضغط هو 1 فولت لكل 100 مم زئبق. 25 مم زئبق يتوافق مع إخراج 0.25 فولت ، و 100 مم زئبق يتوافق مع خرج 1 فولت.
2. تحضير الماوس لإجراء قياس ضغط الدم.
   1. تخدير الماوس مع استنشاق الأيزوفلوران بنسبة 3 ٪ من خلال مخروط الأنف.
   2. ضع المرهم البيطري مباشرة على سطح العين لعيون الفأر لمنع الجفاف ، حيث لا يستطيع الفأر إغلاق عينيه تحت التخدير. احلق الفراء من رقبة الفأر أثناء التخدير.
   3. افرك المنطقة المحلوقة بثلاث جولات متناوبة من محلول البوفيدون واليود ومسحة الإيثانول بنسبة 70٪. ضع الفأر المخدر في وضع ضعيف على منصة حقن أسفل مجهر التشريح. ضع أنف الفأر في مخروط الأنف للحفاظ على التخدير (1.5٪ إيزوفلوران) طوال العملية الجراحية.
   4. اختبر الاستجابة الحركية للفأر المخدر للتحفيز الضار. يجب ألا يستجيب الفأر المخدر لمحفز ضار قبل وأثناء الجراحة.
      ملاحظة: يمكن للمخدرات القابلة للاستنشاق (الأيزوفلوران) والحقن (الكيتامين / الزيلازين) أن تقلل من ضغط الدم. بشكل عام ، التخدير باستنشاق الأيزوفلوران له تأثير طفيف على خفض ضغط الدم من الكيتامين / الزيلازين. لذلك ، فإن الأيزوفلوران هو مخدر الاستنشاق المفضل على الكيتامين / الزيلازين. يعد تحقيق عمق التخدير المناسب أمرا بالغ الأهمية لإجراء قياسات الدورة الدموية الدقيقة والقابلة للتكرار. يحتاج المحقق إلى الحفاظ على عمق التخدير ثابتا لكل فأر.
3. قسطرة الشريان الأورطي الصاعد
   1. ضع محفزا ضارا (أي قرصة إصبع القدم) باستخدام ملقط مستقيم لضمان مستوى مناسب من التخدير. قم بعمل شق في خط الوسط للجلد من الفك السفلي إلى القص (الشكل 5 أ).
   2. افصل الغدد اللعابية وكشف القصبة الهوائية (الشكل 5 ب).
   3. استخدم الملقط لتنظيف الأنسجة الرخوة على طول الأوعية لكشف الشريان السباتي الأيمن والوريد الوداجي الخارجي الأيمن (الشكل 5C).
   4. ضع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في التجويف لإبطاء تطور التشنج الوعائي أثناء التلاعب بالشريان السباتي.
   5. اعزل بعناية قسما بحجم 5 مم من الشريان السباتي الأيمن. ضع قطعة من الورق الأبيض المعقم أسفل الوعاء كخلفية لجعل الشريان أكثر وضوحا (الشكل 5 د).
      ملاحظة: افصل بعناية العصب المبهم (الأبيض) عن الشريان وتأكد من عدم قطع أو إتلاف العصب أو الشريان.
   6. باستخدام 8-0 ربط خياطة عقدة دائمة لإغلاق نهاية الجمجمة من السفينة (الشكل 5E).
   7. اربط أول عقدة فضفاضة لعرقلة تدفق الدم مؤقتا من الشريان الأورطي. ثم اربط عقدة ثانية فضفاضة (# 3) بين أول خيطين (الشكل 5F). سيتم استخدام العقدة الثانية السائبة (# 3) لتأمين القسطرة بسرعة بعد وضعها.
   8. باستخدام إبرة 25 G ، قم بعمل ثقب صغير ، كبير بما يكفي لتمرير القسطرة ، بما يتماشى مع الوعاء بين الأحرف المركبة # 3 و # 1 (الشكل 5G).
      ملاحظة: تحمل الشرايين السباتية الدم المؤكسج من القلب ولها ضغط مرتفع للغاية. إذا تم قطع الشريان السباتي ، فإن هذا الضغط سيؤدي إلى تدفق الدم (الشكل 5H).
   9. أمسك القسطرة على بعد 1.5 بوصة من الطرف وأدخل طرف القسطرة برفق من خلال فتحة الشريان (علامة X). شد عقدة الخياطة الوسطى (# 3) حول القسطرة والوعاء الذي لا يزال يسمح بمرور القسطرة (الشكل 5I-J).
      ملاحظة: هذه الخطوة تتطلب الممارسة. تشمل المضاعفات المحتملة لهذه الخطوة النزيف في موقع إدخال القسطرة والتشنج الوعائي. عند حدوث النزيف ، يقلل فقدان الدم من الشريان النازف من حجم الدم ، مما يؤدي إلى انخفاض حاد في ضغط الدم النظامي. بسبب الشدة ، وصل إلى نقطة نهاية إنسانية ويجب القتل الرحيم. بالنسبة للتشنج الوعائي المستحث ميكانيكيا ، يحدث عادة أثناء إدخال القسطرة الناجم عن الانقباض المستمر للأوعية الدموية. هذا يجعل فتحة الأوعية الدموية أصغر ويمنع تقدم القسطرة إلى الشريان السباتي. لا تستخدم القوة المفرطة ضد المقاومة لدفع القسطرة. عند مواجهة مقاومة التشنج الوعائي المعتدلة أو الشديدة ، حاول مرة أخرى بعد قليل أو استخدم قسطرة أصغر (على سبيل المثال ، 1.0 فهرنهايت). يمكن للجراحين المجهريين ذوي الخبرة تحقيق معدلات نجاح بنسبة 100٪ لقسطرة الشريان الأورطي الصاعد.
   10. بعد أن تجتاز القسطرة العقدة السائبة الأولى بطرف المستشعر ، اربط العقدة السائبة الثانية (# 3) بإحكام أكثر لتأمين القسطرة وحرر العقدة السائبة الأولى برفق (الشكل 5K ، L).
   11. استمر في إدخال القسطرة باتجاه الشريان الأورطي الصاعد وفقا للعلامة الموجودة على القسطرة (الشكل 4 ب) حتى يظهر تحليل الضغط ملف ضغط الدم الشرياني (الشكل 5M). تسجيل بيانات ضغط الدم النظامي (SBP) باستخدام نظام الحصول على البيانات والبرمجيات.
   12. قم بفك عقدة الخيط الوسطى (# 3) للسماح بسحب القسطرة (الشكل 5N).
   13. اربط عقدة الخيط الوسطى (# 3) حول الوعاء قبل سحب القسطرة من الشريان السباتي (الشكل 5O-P).
   14. ضع القسطرة في برنامج تلفزيوني.
4. قسطرة القلب الأيمن.
   1. اعزل الوريد الوداجي الخارجي الأيمن بعناية عن النسيج الضام المحيط واربط جميع الفروع الصغيرة ب 8-0 خياطة (رؤوس الأسهم الزرقاء) (الشكل 6 أ).
      ملاحظة: بالنسبة لقسطرة القلب اليمنى ، يتم الوصول إلى القلب بشكل شائع عبر الوريد الوداجي الأيمن.
   2. باستخدام 8-0 خياطة ، اربط عقدة دائمة لإغلاق نهاية الجمجمة للوعاء (الشكل 6 ب). ثم اربط عقدة فضفاضة على الطرف الذيلي للوعاء (الشكل 6C).
   3. استخدم إبرة 25 جم لعمل ثقب صغير بالقرب من العقدة الدائمة (الشكل 6 د).
      ملاحظة: تحمل الأوردة الوداجية الدم غير المؤكسج إلى القلب ولديها ضغط منخفض. إذا تم قطع الوريد الوداجي ، فلن يندفع الدم (الشكل 6D ، E).
   4. امسك القسطرة وأدخل القسطرة في قطع الوريد (علامة X) (الشكل 6E) وشد العقدة الذيلية حول القسطرة والوعاء (الشكل 6F).
   5. ادفع القسطرة ببطء ورفق إلى القلب الأيمن. راقب عمق طرف القسطرة بناء على علامة القسطرة (الشكل 4 ب).
      ملاحظة: يمثل تقييم الضغط الانقباضي البطيني الأيمن (RVSP) في الفئران المغلقة الصدر تحديا بسبب تشريح وهيكل RV المعقد. تتطلب هذه الخطوة مستوى عال من الخبرة والكثير من الممارسة. في أيدي جراح مجهري متمرس ، يمكن أن يقترب المعدل الناجح لقسطرة البطين الأيمن من 90٪.
   6. قم بتقييم موضع طرف القسطرة وفقا لتتبع موجة الضغط في البرنامج. عندما يكون طرف القسطرة في البطين الأيمن ، ستظهر الشاشة تتبعا نموذجيا ل RVSP (الشكل 6G ، H).
      ملاحظة: عندما يبدو شكل منحنيات الضغط الرئوي غير نمطي (على سبيل المثال ، منحنيات شائكة) ، فهذا يعني وضع القسطرة بشكل غير صحيح. اضبط موضع القسطرة عن طريق سحب القسطرة برفق للخلف قليلا، ثم دفع القسطرة ببطء إلى وضع أكثر مركزية داخل البطين الأيمن. لتجنب توليد القطع الأثرية في بيانات البحث ، يجب على الباحث تجنب المحاولات المطولة (لا تزيد عن 1 دقيقة) أو المتكررة (ليس أكثر من محاولتين) في قسطرة البطين الأيمن.
   7. حافظ على القسطرة غير متحركة واجمع البيانات لمدة 5 دقائق.
   8. بعد اكتمال التسجيل ، اسحب القسطرة بعناية واربط العقدة الذيلية حول الوعاء (الشكل 6I). ضع القسطرة مرة أخرى في محلول PBS.
      ملاحظة: بعد الانتهاء من التجربة ، قم بتنظيف القسطرة بمحلول إنزيم هضمي بنسبة 1٪ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بالإضافة إلى تقييم حالة الدورة الدموية ، قد يحصد الباحثون القلوب والرئتين لفحص PAH النسيجي المرضي. لضمان فعالية جرعات البلعة الوريدية المتعددة ، يمكن للباحثين عزل الخلايا البطانية للرئة وقياس مستويات let-7 miRNA.

4. تحليل بيانات ضغط الدم

1. افحص تسجيل ضغط الدم.
   1. افتح ملف بيانات برنامج تحليل ضغط الدم (PAH JOVE.adicht).
   2. في القناة 1 ، حدد منطقة تمثل إشارة الضغط وضع مؤشر شكل الموجة على الذروة (علامة X) لقياس سعة الضغط (الشكل 7 أ).
   3. أوجد السعة القصوى لموجة الضغط. هذا يمثل الضغط الانقباضي (الشكل 7 أ ، السهم الأحمر).
   4. استخرج منطقة الاهتمام (الشكل 7B المنطقة الرمادية) من الصورة بالضغط على Shift + Command + 3 (لنظام التشغيل Mac) أو Windows + Shift + S (لأجهزة الكمبيوتر التي تعمل بنظام Windows) والصقها في ملف رسومات.
2. التحليل الإحصائي لبيانات ضغط الدم.
   1. أدخل بيانات ضغط دم الماوس الفردية في برنامج التحليل الإحصائي.
   2. قم بإجراء اختبار t للطالب غير المزاوج للتحليل الإحصائي لمجموعتين من الدراسة (normoxia مقابل نقص الأكسجة ؛ نقص الأكسجة مقابل نقص الأكسجة + 7C1 / let-7 miRNA). ضع في اعتبارك الاختلافات في القيم المتوسطة بنفس أهمية p < 0.05.

النتائج

التخدير غالبا ما يقلل من ضغط الدم. لذلك ، تم استخدام جرعة دنيا من التخدير لإلغاء الحركات استجابة لحافز ضار. يمكن تصور الوصول الناجح إلى غرفة البطين الأيمن مع تغير شكل موجة الدورة الدموية في مناطق مختلفة من الأنظمة الوريدية (الشكل 8).

في هذه الدراسة ، تم تعيين ا...

Discussion

تم إنشاء العديد من النماذج الحيوانية لارتفاع ضغط الدم الرئوي لتقليد أحداث المقاومة الوعائية الرئوية المرتفعة في البشر. من بينها ، تم استخدام نموذج PAH الناجم عن نقص الأكسجة في الفئران على نطاق واسع لتقييم فعالية العلاجات التجريبية الجديدة ل PAH. غالبا ما يتطلب البحث باستخدام هذا النموذج إعط...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 prolene suture pack	Ethicon	8698G	for incision closure
8-0 nylon suture pack	AROSurgical Instruments	T06A08N14-13	for ligation
Anesthesia induction chamber	VETEQUIP	#941444	Holds the animal during anesthesia exposure
Catheter Interface Cable PEC-4D	Millar		for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000
Charcoal canister filters	VETEQUIP	#931401	to help remove waste anesthetic gases
Cotton swabs	McKesson	24-106	for applying pressure to the injection site to prevent bleeding
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	Surgical tools
Insulin syringe 28 G	EXEL	26027	for jugular vein IV injection
Isoflurane	COVETRUS	#029405	for mouse anesthesia
LabChart 8 Software	ADInstruments		for data analysis
Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F)	Millar		for invasive blood pressure measurement
Needle-25 G	BD	305124	for making a samll hole in a vessel
Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor	BioSpherix	E702	for oxygen concentration monitoring
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar		for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35
PowerLab 4/35	ADInstruments		for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation.
Prism 8	GraphPad		for statistics and scientific graphing
Semisealable hypoxia chamber	BioSpherix		an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	Surgical tools
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	Surgical tools
VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA	VasoRx, Inc.	Lot# B2-L-16Apr	IV injection compound
VIP 3000 Veterinary Vaporizer	COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC.		for accurate anesthesia delivery