Hipoksi ile İndüklenen Fare Pulmoner Arter Hipertansiyon Modelinde Çoklu İntravenöz Bolus Dozu ve İnvaziv Hemodinamik Değerlendirme

Özet

Bu protokol, farelerde çoklu intravenöz bolus dozu uygulaması ve invaziv hemodinamik izleme yürütmek için adım adım bir prosedür sağlar. Araştırmacılar bu protokolü pulmoner arter hipertansiyonu için gelecekteki terapötik bileşik taraması için kullanabilirler.

Özet

Pulmoner arteriyel hipertansiyon (PAH), primer olarak akciğerin küçük pulmoner arteriyollerini etkileyen, ilerleyici, hayatı tehdit eden bir hastalıktır. Şu anda, PAH için bir tedavi yoktur. PAH'ı tedavi etmek için kullanılabilecek yeni bileşiklerin keşfedilmesi önemlidir. Fare hipoksisinin neden olduğu PAH modeli, PAH araştırmaları için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Bu model, PAH Grup 3 hastalığının insan klinik belirtilerini özetlemektedir ve PAH için yeni deneysel tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için önemli bir araştırma aracıdır. Bu modeli kullanan araştırmalar genellikle farelerde bileşiklerin uygulanmasını gerektirir. Doğrudan kan dolaşımına verilmesi gereken bir bileşik için, intravenöz (IV) uygulamanın optimize edilmesi, deneysel prosedürlerin önemli bir parçasıdır. İdeal olarak, IV enjeksiyon sistemi, belirli bir süre boyunca birden fazla enjeksiyona izin vermelidir. Fare hipoksisinin neden olduğu PAH modeli birçok laboratuvarda çok popüler olmasına rağmen, bu modelde çoklu IV bolus dozu ve invaziv hemodinamik değerlendirme yapmak teknik olarak zordur. Bu protokolde, fare hipoksi ile indüklenen PAH modelinde hemodinamik değerlendirme için fare juguler veni yoluyla çoklu IV bolus dozlamasının nasıl yapılacağı ve arteriyel ve sağ ventrikül kateterizasyonunun nasıl yapılacağı hakkında adım adım talimatlar sunuyoruz.

Giriş

Pulmoner arter hipertansiyonu (PAH), istirahatte ortalama pulmoner arter sistolik basıncının 20 mmHg'dan yüksek^{olması ile} tanımlanır ^1,2. Pulmoner arter basıncında sürekli yükselme ile karakterize, sağ ventrikül aşırı yüklenmesine ve sonuçta sağ ventrikül yetmezliğine bağlı ölüme yol açan ilerleyici ve ölümcül bir hastalıktır¹. Şu anda, PAH için bir tedavi yoktur.

Deneysel PAH tedavilerinin etkinliğini test etmek için pulmoner hipertansiyonun hayvan modellerinin kullanılması önemlidir. Bu modeller arasında, fare hipoksisinin neden olduğu PAH modeli, insan PAH grup 3 hastalık gelişimi hakkında önemli bilgiler sağlamıştır ^3,4. Bu modeli kullanan araştırmalar, genellikle yeni bileşiğin etkinliğini ve güvenliğini değerlendirmek için farelerde bileşiklerin uygulanmasını gerektirir. Bu nedenle, araştırmacılar, enjeksiyon tutarlılığını ve kan basıncı ölçümünün baştan sona tekrarlanabilirliğini sağlamak için bileşik dozlama ve hemodinamik ölçümler için ayrıntılı bir deneysel prosedüre ihtiyaç duyarlar.

Literatürde intravenöz (IV) enjeksiyon ve kan basıncı ölçme yöntemleri bildirilmiştir ^5,6. Bununla birlikte, metodoloji görsel illüstrasyon ve ayrıntılı açıklamadan yoksundur. Burada başarılı bir IV bolus enjeksiyonu ve sistemik ve sağ ventrikül kan basıncının doğru ölçümü ve kaydı için temel adımları gösteriyoruz. Burada sunulan prosedürler, PAH için bir tedavi geliştirmek için bileşik uygulama platformunun IV yolu ile ilgilenen araştırmacılar için önemli bir kaynaktır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanan protokoller kapsamında gerçekleştirildi.

1. Hayvanların, aletlerin, kan basıncı ölçüm cihazlarının ve hipoksi odasının hazırlanması

1. Hayvan iklimi.
   NOT: Bu çalışma için kullanılan deney hayvanları, 25-27 g ağırlığındaki erkek, 8 haftalık C57BL/6 farelerdi. Deney için gerekli hayvan sayısını tahmin ederken, ameliyata bağlı mortalite, beklenmedik cerrahi komplikasyonlar ve ani beklenmedik ölüm dahil olmak üzere çeşitli faktörler göz önünde bulundurulmalıdır. İstatistiksel güce ulaşmak ve yetersiz çalışmalardan kaçınmak için grup başına en az 10 fare kullanın.
   1. Kabul edildikten sonra, hayvanları uygun yatak, kemirgen yemi ve su ile sağlanan havalandırmalı kemirgen kafeslerinde (kafes başına beş hayvandan oluşan gruplar) barındırın. Hayvanların en az 3 gün boyunca yeni ortama alışmasına izin verin (18-20 ° C'de 12 saat aydınlık-karanlık döngüsü).
   2. Bunları rastgele şu gruplara atayın: Normoksi (Grup 1), hipoksi (Grup 2) ve hipoksi + 7C1/let-7 miRNA (Grup 3).
2. Cerrahi aletler ve tansiyon ölçüm cihazlarının hazırlanması.
   1. Tüm cerrahi aletleri otoklavlayarak sterilize edin (Şekil 1A).
   2. Ev yapımı anestezi burun konisi (Şekil 1B), dikiş paketleri (Şekil 1C) ve PAH prosedürü için ekipman (Şekil 1D-F) ile derme çatma bir enjeksiyon platformu hazırlayın.
3. Pulmoner arter hipertansiyonu (PAH) indüksiyonu için deneysel ortam.
   1. N₂ tankını, oksijen sensörünü ve yarı kapatılabilir hipoksi odasını ayarlayın (Şekil 2A).
   2. Oksijen sensöründe %10_O2'lik bir ayar noktası oluşturun ve sistemin kararlı duruma ulaşmasına izin verin (Şekil 2B, C).
   3. Hipoksi (Grup 2) ve hipoksi + 7C1/let-7 miRNA (Grup 3) hayvanlarını 3 hafta boyunca hipokside (%10 O₂) tutun. 3 haftalık hipoksiden sonra, hayvanları 1 hafta boyunca normoksik koşullar altında yerleştirin (Şekil 2D). Normolik grup (Grup 1) 4 hafta boyunca normokside kalır.
      NOT: (1) 3 haftalık hipoksi ve ardından 1 haftalık normoksi, PAH ve sağ ventrikül kalp yetmezliği gelişimi için iyi bilinen bir yöntemdir⁷. Oksijen sensörü, yarı kapatılabilir hipoksi odasının içindeki_O2 konsantrasyonunu algılar ve gaz infüzyon tüpünden_N2 gazı infüze ederek düzeltir.
   4. Deney süresince (3 hafta) hayvanları günlük olarak inceleyin. Hayvanlar dramatik kilo kaybı ve nefes almada zorluk gibi sıkıntı belirtileri gösteriyorsa bir veterinere danışın. Şiddetli sıkıntı içindeki hayvanlar için ötenazi gerekliyse, hayvanı çalışmadan hariç tutun.
      NOT: Hipoksiye maruz kalma, farenin vücut ağırlığının azalmasına neden olur. Vücut ağırlığının %10'luk bir kaybı tipik olarak PAH gelişiminin güvenilir bir göstergesi olarak kullanılır.
   5. Hipoksi odasının geniş açılmasından kaçının. Kafes temizliği, yiyeceklerin yenilenmesi, su şişelerinin değiştirilmesi ve bileşik uygulama için odaları haftada 1 saatten fazla açmayın.

2. Juguler ven yoluyla intravenöz bolus enjeksiyonu

1. Fare hazırlığı ve anestezi.
   1. Hipoksi odasından hipoksi (Grup 2) ve hipoksi + 7C1/let-7 miRNA (Grup 3) fare kafeslerini çıkarın ve hayvanı yavaşça kafesten çıkarın.
      NOT: 7C1 / let-7 miRNA (1.5 mg / kg IV / doz) için dozaj rejimi, 4 haftalık tedavi için haftada iki kezdir. Araştırmacıların, tüm hayvanların zaman aralığı başına aynı büyüklükte hipoksi maruziyeti aldığından emin olmak için IV enjeksiyonu sırasında hipoksi odasından hem hipoksi hem de hipoksi + bileşik tedavi kafeslerini çıkarmaları önerilir.
   2. Fareyi hassas bir terazi kullanarak tartın ve ağırlığını kaydedin (Şekil 3A).
   3. Fareyi anestezik buharlaştırıcıya bağlı bir anestezi indüksiyon odasına yerleştirin ve kapatın (Şekil 3B). Anestezi sırasında kurumayı önlemek için termal destek sağlayın ve her iki göze de göz kayganlaştırıcı uygulayın. Fareyi bilinçsiz olana kadar% 3 izoflurana maruz bırakın (Şekil 3C-D).
   4. Fareyi hazneden çıkarın ve kürkü çeneden kaudal olarak sternumun ortasına kadar kraniyal olarak tıraş edin. Yanal olarak, kürkü çene açılarından, boynun yanlarından ve omuzlara doğru tıraş edin (Şekil 3E).
   5. İzofluran anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyonda (göbek tarafı yukarı bakacak şekilde) diseksiyon mikroskobunun altındaki bir enjeksiyon platformuna yerleştirin. Anesteziyi %1.5 izofluran içeren bir burun konisi ile koruyun ve vücudu hareketsiz hale getirmek için dört bacağı yapışkan bantla hafifçe sabitleyin (Şekil 3F).
   6. Yeterli düzeyde anestezi sağlamak için düz forseps ile zararlı bir uyaran (yani ayak parmağı sıkıştırma) uygulayın. Anestezi uygulanan fare, cerrahi prosedür öncesinde ve sırasında stimülasyona yanıt vermemelidir.
2. Enjeksiyon ajanı hazırlama.
   1. Steril koşullar altında 1.5 mg / kg'lık bir dozda tek dozluk bir enjeksiyon bileşiği hazırlayın.
      NOT: Soğuk maddelerin enjeksiyonu rahatsızlığa ve fare vücut sıcaklığının düşmesine neden olabileceğinden (bu bileşiğe zarar vermiyorsa) enjeksiyon bileşiğini oda sıcaklığına (RT) ısıtın. Bu çalışmada kullanılan 7C1/let-7 miRNA bileşiğinin optimal dozu ve süresi önceki yayınlara^{dayanmaktadır 8,9}.
   2. Steril tek kullanımlık şırıngaya enjekte edilecek hacmi yükleyin. Şırıngayı dik tutun ve havayı şırıngadan dışarı atmak için pistonu ilerletin. Şırıngayı tekrar kullanmayın.
   3. Hayvanlar üzerinde hemodilüsyon ve anormal kardiyak etki insidansını azaltmak için enjeksiyon hacmini 25 g'lık bir farede 200 μL ile sınırlayın. Daha büyük bir hacim gerekiyorsa, enjeksiyon bileşiğini 10 dakika aralıklarla iki enjeksiyona bölün.
3. Fareyi IV enjeksiyonu için hazırlayın.
   1. Cerrahi alanı üç alternatif tur povidon-iyot çözeltisi ve% 70 etanol ile üç kez nazikçe ovalayın. Cerrahi işlemden 30 dakika önce buprenorfin (0.05 mg / kg, SQ) uygulayın.
   2. Bir neşter bıçağı kullanarak boynun orta hattının hafifçe sağında 0,5 cm uzunlamasına bir kesim yapın (Şekil 3G).
   3. Sağ eksternal juguler veni bulmak için kas ve yağ dokularını ayırmak için forseps kullanın (Şekil 3H).
      NOT: Yara izi oluşumunu önlemek için enjeksiyon bölgelerini her seferinde döndürün.
   4. Enjeksiyon alanının kolay görselleştirilmesini sağlamak için yüksek güçlü bir objektif lens kullanın (Şekil 3I).
4. IV enjeksiyon
   1. İğne eğimi yukarı bakacak şekilde juguler damara 28 G'lik steril bir iğne yerleştirin (Şekil 3J, K).
      NOT: Kuyruk damar enjeksiyonu, juguler ven enjeksiyonuna bir alternatiftir. Bununla birlikte, damar derinliği, fare kuyruğu deri rengi ve cilt sertliğindeki değişkenlik nedeniyle bu tekniğin tekrarlanan dozlamayı gerçekleştirmesi zordur.
   2. Bileşiği damara enjekte etmek için şırınga pistonuna yavaşça bastırın. Enjekte edicinin geri akışını önlemek için iğnenin damar içinde 10 saniye daha kalmasına izin verin (Şekil 3L).
      NOT: Mavimsi boya, enjeksiyonun kolay görselleştirilmesini sağlar. Test malzemelerini enjekte ederken boyayı dahil etmeyin. Yanlış bir enjeksiyon, IV enjeksiyon bölgesi çevresinde mavimsi boya birikmesine neden olacaktır.
   3. İğneyi çıkarın ve kanamayı önlemek için enjeksiyon bölgesine basınç uygulamak için pamuklu çubuk kullanın (Şekil 3M).
   4. Cildi 5-0 sütür ile dikin (Şekil 3N). Ameliyattan sonra hayvanı ılık, temiz ve kuru bir alana taşıyın ve Meloksikam (1 mg/kg, SQ, q24h) sağlayın. Hayvanı, yatağı olmayan, ancak alt kısmı bir kağıt havluyla kaplı temiz bir kurtarma kafesine yerleştirin.
      NOT: Fare anesteziden uyanmalı ve kurtarma kafesine geri döndüğünde 5 dakika içinde bilincini geri kazanmalıdır. Fareyi tehlike belirtileri açısından izleyin.
   5. Hayvanları ev kafeslerine geri koyun ve fare kafesini hipoksi odasına geri koyun.
      NOT: Bir farenin uyuşturulmasından juguler ven enjeksiyonunun bitirilmesine kadar tüm prosedür, tek bir deneyci tarafından yaklaşık 10-15 dakika sürer. Farelerde normoksi maruziyetini kısaltmak için, en az iki araştırmacının juguler ven enjeksiyon prosedürünü gerçekleştirmek için işbirliği yapması önerilir.

3. Kan basıncı ölçümü

1. Kan basıncı ölçümü için aletler hazırlayın.
   1. Hemodinamik ölçümden en az 30 dakika önce 1.0 F kateterin ucunu 37 °C önceden ısıtılmış PBS'ye batırın (Şekil 4A).
   2. Kateter yerleştirme bölgesinden istenen kateter ucu konumuna olan mesafeyi ölçün. Örneğin farenin aort damarına çıkması ile boynun ortasına kadar olan mesafe yaklaşık 1-1,2 cm'dir. Kalbin sağ karıncığı ile boynun ortası arasındaki mesafe yaklaşık 2,3-2,8 cm'dir.
   3. Yerleştirme derinliğinin görsel bir göstergesini sağlamak için iki kateter mesafe işaretini işaretleyin (Şekil 4B).
   4. Kateteri basınç dönüştürücüsüne takın, basınç dönüştürücüyü veri toplama cihazındaki giriş kanalı 1'e bağlayın, basınç-hacim kontrol ünitesini açın ve veri toplama kan basıncı analiz yazılımını başlatın. Yeni bir kan basıncı analiz belgesi oluşturun ve kanal 1'i basınç için ayarlayın.
   5. Üreticinin protokolüne göre bir basınç kalibrasyonu yapın. Tüm kurulumun en az 5 dakika stabilize olmasına izin verin (Şekil 4C).
   6. Kan basıncı analiz yazılımında, Kanal 1 açılır menüsünden Birim Dönüştürme'yi seçin (Şekil 4D, kırmızı ok).
   7. Varsayılan Birim Dönüştürme Değerlerini ayarlayın (Şekil 4E).
      NOT: Kan basıncı milimetre cıva (mmHg) olarak temsil edilir. Basınç Kontrol Ünitesinden standartlaştırılmış basınç çıkışı 100 mmHg'de 1 V'tur. 25 mmHg, 0,25 V çıkışa karşılık gelir ve 100 mm Hg, 1 V çıkışa karşılık gelir.
2. Fareyi kan basıncı ölçüm prosedürü için hazırlayın.
   1. Fareyi bir burun konisi aracılığıyla% 3 izofluran inhalasyonu ile uyuşturun.
   2. Fare anestezi altında gözlerini kapatamayacağından, kuruluğu önlemek için veteriner merhemini doğrudan fare gözlerinin oküler yüzeyine uygulayın. Anestezi altındayken farenin boynundaki kürkü tıraş edin.
   3. Traş edilen bölgeyi üç alternatif tur povidon-iyot çözeltisi ve% 70 etanol çubuğu ile ovalayın. Anestezi uygulanmış fareyi diseksiyon mikroskobunun altındaki bir enjeksiyon platformuna sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Cerrahi prosedür boyunca anesteziyi (% 1.5 izofluran) korumak için farenin burnunu burun konisine yerleştirin.
   4. Anestezi uygulanmış farenin zararlı uyarana motor tepkisini test edin. Anestezi uygulanan fare, ameliyattan önce ve ameliyat sırasında zararlı bir uyarana yanıt vermemelidir.
      NOT: Solunabilir (izofluran) ve enjekte edilebilir (ketamin / ksilazin) anestezikler kan basıncını düşürebilir. Genel olarak, izofluran inhalasyon anestezisi, kan basıncını düşürmede ketamin / ksilazinden daha hafif bir etkiye sahiptir. Bu nedenle, izofluran, ketamin / ksilazin yerine tercih edilen inhalan anesteziktir. Uygun anestezi derinliğine ulaşmak, doğru ve tekrarlanabilir hemodinamik ölçümler için kritik öneme sahiptir. Araştırmacının her fare için anestezi derinliğini sabit tutması gerekir.
3. Asendan aort kateterizasyonu
   1. Yeterli düzeyde anestezi sağlamak için düz forseps ile zararlı bir uyaran (yani ayak parmağı sıkıştırma) uygulayın. Mandibuladan sternuma kadar cildin orta hat insizyonunu yapın (Şekil 5A).
   2. Tükürük bezlerini ayırın ve soluk borusunu ortaya çıkarın (Şekil 5B).
   3. Sağ karotis arteri ve sağ eksternal juguler veni ortaya çıkarmak için damarlar boyunca yumuşak dokuyu temizlemek için forseps kullanın (Şekil 5C).
   4. Karotis arteri manipüle ederken vazospazm gelişimini yavaşlatmak için boşluğa 0.5 mL PBS koyun.
   5. Sağ karotis arterin 5 mm'lik bir bölümünü dikkatlice izole edin. Arteri daha görünür hale getirmek için arka plan olarak damarın altına bir parça steril beyaz kağıt yerleştirin (Şekil 5D).
      NOT: Vagus sinirini (beyaz) arterden dikkatlice ayırın ve siniri veya arteri kesmemeye veya zarar vermemeye dikkat edin.
   6. 8-0 sütür, damarın kraniyal ucunu kapatmak için kalıcı bir düğüm (# 1) bağlayın (Şekil 5E).
   7. Aorttan kan akışını geçici olarak engellemek için ilk gevşek düğümü (# 2) bağlayın. Ardından, ilk iki dikiş arasına ikinci bir gevşek düğüm (# 3) bağlayın (Şekil 5F). İkinci gevşek düğüm (# 3), yerleştirildikten sonra kateteri hızlı bir şekilde sabitlemek için kullanılacaktır.
   8. 25 G'lik bir iğne kullanarak, #3 ve #1 ligatürleri arasındaki damarla aynı hizada kateteri geçecek kadar büyük küçük bir delik açın (Şekil 5G).
      NOT: Karotis arterler kalpten oksijenli kan taşır ve çok yüksek basınca sahiptir. Karotis arter kesilirse, bu basınç kanın dışarı fışkırmasına neden olur (Şekil 5H).
   9. Kateteri uçtan 1,5 inç uzakta tutun ve kateterin ucunu arter deliğinden (X işareti) yavaşça sokun. Kateterin geçişine izin veren kateter ve damarın etrafındaki orta sütür düğümünü (# 3) sıkın (Şekil 5I-J).
      NOT: Bu adım pratik gerektirir. Bu adımla ilgili potansiyel komplikasyonlar arasında kateter yerleştirme yerinde kanama ve vazospazm yer alır. Kanama meydana geldiğinde, kanayan arterden kan kaybı kan hacmini azaltır ve sistemik kan basıncında ciddi bir düşüşe neden olur. Ciddiyeti nedeniyle, hayvan insancıl bir son noktaya ulaştı ve ötenazi yapılması gerekiyor. Mekanik olarak indüklenen vazospazm için, genellikle kan damarlarının kalıcı bir şekilde kasılmasından kaynaklanan kateter yerleştirme sırasında ortaya çıkar. Bu, kan damarı açıklığını küçültür ve kateterin karotis artere ilerlemesini önler. Kateteri ilerletmek için dirence karşı aşırı güç uygulamayın. Orta veya şiddetli vazospazm direnci ile karşılaşıldığında, kısa bir süre sonra tekrar deneyin veya daha küçük bir kateter kullanın (ör., 1.0 F). Deneyimli mikrocerrahlar, asendan aort kateterizasyonu için %100 başarı oranlarına ulaşabilirler.
   10. Kateter sensör ucuyla ilk gevşek düğümü (# 2) geçtikten sonra, kateteri sabitlemek için ikinci gevşek düğümü (# 3) daha sıkı sabitleyin ve ilk gevşek düğümü (# 2) nazikçe serbest bırakın (Şekil 5K, L).
   11. Basınç analizi arteriyel kan basıncı profili gösterene kadar kateteri kateter üzerindeki işarete göre (Şekil 4B) çıkan aorta doğru yerleştirmeye devam edin (Şekil 5M). Veri toplama sistemini ve yazılımını kullanarak sistemik kan basıncı (SBP) verilerini kaydedin.
   12. Kateterin dışarı çekilmesine izin vermek için orta dikiş düğümünü (# 3) gevşetin (Şekil 5N).
   13. Kateteri karotis arterden dışarı çekmeden önce orta sütür düğümünü (# 3) damarın etrafına bağlayın (Şekil 5O-P).
   14. Kateteri PBS'ye yerleştirin.
4. Sağ kalp kateterizasyonu.
   1. Sağ dış juguler veni çevreleyen bağ dokusundan dikkatlice izole edin ve tüm küçük dalları 8-0 ile bağlayın sütür (mavi ok uçları) (Şekil 6A).
      NOT: Sağ kalp kateterizasyonu için kalbe genellikle sağ juguler ven yoluyla girilir.
   2. 8-0 dikiş, damarın kraniyal ucunu kapatmak için kalıcı bir düğüm (# 1) bağlayın (Şekil 6B). Ardından, kabın kuyruk ucuna gevşek bir düğüm (# 2) bağlayın (Şekil 6C).
   3. Kalıcı düğüme (# 1) yakın küçük bir delik açmak için 25 G'lik bir iğne kullanın (Şekil 6D).
      NOT: Juguler venler oksijensiz kanı kalbe taşır ve düşük basınca sahiptir. Şah damarı kesilirse, kan dışarı fışkırmaz (Şekil 6D, E).
   4. Kateteri tutun ve kateteri damarın kesiğine (X işareti) yerleştirin (Şekil 6E) ve kateter ve damarın etrafındaki kaudal düğümü (# 2) sıkın (Şekil 6F).
   5. Kateteri yavaşça ve nazikçe sağ kalbe itin. Kateter işaretine göre kateter ucu derinliğini izleyin (Şekil 4B).
      NOT: Kapalı göğüs farelerinde sağ ventrikül sistolik basıncının (RVSP) değerlendirilmesi, karmaşık RV anatomisi ve yapısı nedeniyle zor bir iştir. Bu adım, yüksek düzeyde uzmanlık ve çok fazla pratik gerektirir. Deneyimli bir mikrocerrahın elinde sağ ventrikül kateterizasyonunun başarı oranı %90'a yaklaşabilir.
   6. Kateter ucu pozisyonunu yazılımdaki basınç dalgası izlemesine göre değerlendirin. Kateterin ucu sağ ventrikülde olduğunda, monitör tipik bir RVSP izlemesi gösterecektir (Şekil 6G, H).
      NOT: Pulmoner basınç eğrilerinin şekli atipik göründüğünde (örneğin, dikenli eğriler), bu, kateterin yanlış konumlandırılması anlamına gelir. Kateteri hafifçe biraz geriye çekerek ve ardından kateteri yavaşça sağ ventrikül içinde daha merkezi bir konuma ilerleterek kateter pozisyonunu ayarlayın. Araştırma verilerinde artefakt oluşumunu önlemek için, araştırmacı sağ ventrikül kateterizasyonunda uzun süreli (1 dakikadan fazla değil) veya tekrarlanan girişimlerden (iki denemeden fazla değil) kaçınmalıdır.
   7. Kateteri hareketsiz tutun ve verileri 5 dakika boyunca toplayın.
   8. Kayıt tamamlandıktan sonra, kateteri dikkatlice dışarı çekin ve kuyruk düğümünü (# 2) damarın etrafına bağlayın (Şekil 6I). Kateteri tekrar PBS solüsyonuna yerleştirin.
      NOT: Deneyin tamamlanmasından sonra, kateteri üreticinin talimatlarına göre% 1 sindirim enzimi çözeltisi ile temizleyin. Hemodinamik durumu değerlendirmeye ek olarak, araştırmacılar PAH histopatolojik incelemesi için kalpleri ve akciğerleri toplayabilirler. Çoklu IV bolus dozlamasının etkinliğini sağlamak için, araştırmacılar akciğer endotel hücrelerini izole edebilir ve let-7 miRNA seviyelerini ölçebilir.

4. Kan basıncı veri analizi

1. Kan basıncı kaydını inceleyin.
   1. Kan basıncı analizi yazılım veri dosyasını (PAH JOVE.adicht) açın.
   2. Kanal 1'de, basınç sinyalini temsil eden bir alan seçin ve basınç genliğini ölçmek için Dalga Biçimi İmlecini Tepe Noktasına (X işareti) yerleştirin (Şekil 7A).
   3. Basınç dalgasının maksimum genliğini belirleyin. Bu, sistolik basıncı temsil eder (Şekil 7A, kırmızı ok).
   4. Shift + Command + 3 (Mac için) veya Windows + Shift + S (Windows PC için) tuşlarına basarak ilgilendiğiniz bölgeyi (Şekil 7B gri alan) görüntüden çıkarın ve bir grafik dosyasına yapıştırın.
2. Kan basıncı verilerinin istatistiksel analizi.
   1. Bireysel fare kan basıncı verilerini istatistiksel analiz yazılımına girin.
   2. İki çalışma grubunun istatistiksel analizi için eşleştirilmemiş bir Öğrenci t-testi gerçekleştirin (normoksi ve hipoksi; hipoksi ve hipoksi + 7C1 / let-7 miRNA). Ortalama değerlerdeki farklılıkları p < 0.05 kadar anlamlı olarak düşünün.

Sonuçlar

Anestezi genellikle kan basıncını düşürür. Bu nedenle, zararlı bir uyarana yanıt olarak hareketleri ortadan kaldırmak için minimum anestezi dozu kullanıldı. Başarılı sağ ventrikül odası erişimi, venöz sistemlerin farklı bölgelerinde hemodinamik dalga formu değişiklikleri olarak görselleştirilebilir (Şekil 8).

Bu çalışmada, fareler rastgele normoksik (% 21_O2) grubuna (n = 10), hipoksi (% 10_O2) grubuna (n = 10) ve...

Tartışmalar

İnsan deneklerde artmış pulmoner vasküler direnç olaylarını taklit etmek için çeşitli pulmoner hipertansiyon hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bunlar arasında, fare hipoksisinin neden olduğu PAH modeli, PAH için yeni deneysel tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu modeli kullanan araştırmalar genellikle bileşiklerin farelere uygulanmasını gerektirir. Yayınlanmış diğer intravenöz (IV) enjeksiyon ve invaziv hemodinamik değerlendirme protokolleri ile ka...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 prolene suture pack	Ethicon	8698G	for incision closure
8-0 nylon suture pack	AROSurgical Instruments	T06A08N14-13	for ligation
Anesthesia induction chamber	VETEQUIP	#941444	Holds the animal during anesthesia exposure
Catheter Interface Cable PEC-4D	Millar		for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000
Charcoal canister filters	VETEQUIP	#931401	to help remove waste anesthetic gases
Cotton swabs	McKesson	24-106	for applying pressure to the injection site to prevent bleeding
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	Surgical tools
Insulin syringe 28 G	EXEL	26027	for jugular vein IV injection
Isoflurane	COVETRUS	#029405	for mouse anesthesia
LabChart 8 Software	ADInstruments		for data analysis
Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F)	Millar		for invasive blood pressure measurement
Needle-25 G	BD	305124	for making a samll hole in a vessel
Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor	BioSpherix	E702	for oxygen concentration monitoring
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar		for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35
PowerLab 4/35	ADInstruments		for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation.
Prism 8	GraphPad		for statistics and scientific graphing
Semisealable hypoxia chamber	BioSpherix		an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	Surgical tools
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	Surgical tools
VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA	VasoRx, Inc.	Lot# B2-L-16Apr	IV injection compound
VIP 3000 Veterinary Vaporizer	COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC.		for accurate anesthesia delivery