缺氧诱导小鼠肺动脉高压模型中的多次静脉推注给药和侵入性血流动力学评估

摘要

该协议提供了在小鼠中执行多次静脉推注剂量给药和侵入性血流动力学监测的分步程序。研究人员可以将该方案用于未来肺动脉高压的治疗性化合物筛查。

摘要

肺动脉高压 （PAH） 是一种危及生命的进行性疾病，主要累及肺部的小肺小动脉。目前，尚无治愈多环芳烃的方法。发现可用于治疗多环芳烃的新化合物非常重要。小鼠缺氧诱导的PAH模型是PAH研究广泛使用的模型。该模型概括了 PAH 3 组疾病的人类临床表现，是评估 PAH 新实验疗法有效性的重要研究工具。使用该模型的研究通常需要在小鼠中施用化合物。对于需要直接进入血液的化合物，优化静脉内 （IV） 给药是实验程序的关键部分。理想情况下，静脉注射系统应允许在设定的时间范围内进行多次注射。尽管小鼠缺氧诱导的 PAH 模型在许多实验室中非常流行，但在该模型中进行多次静脉推注给药和侵入性血流动力学评估在技术上具有挑战性。在该方案中，我们提供了有关如何 通过 小鼠颈静脉进行多次静脉推注给药并在小鼠缺氧诱导的 PAH 模型中进行动脉和右心室导管插入术以评估血流动力学的分步说明。

引言

肺动脉高压 （PAH） 定义为静息时肺动脉收缩压平均大于 20 mmHg ^1,2。它是一种进行性和致命的疾病，其特征是肺动脉压持续升高，导致右心室超负荷，最终因右心室衰竭而死亡¹。目前，尚无治愈多环芳烃的方法。

使用肺动脉高压动物模型对于测试实验性 PAH 疗法的有效性非常重要。在这些模型中，小鼠缺氧诱导的 PAH 模型为人类 PAH 第 3 组疾病的发展提供了关键见解 ^3,4。使用该模型的研究通常需要在小鼠中施用化合物以评估新化合物的有效性和安全性。因此，研究人员需要详细的化合物给药和血流动力学测量实验程序，以确保从头到尾的注射一致性和血压测量的可重复性。

静脉注射 （IV） 注射和血压测量的方法已在文献^{中报道 5,6}。然而，该方法缺乏直观的说明和详细的描述。在这里，我们说明了成功静脉推注以及准确测量和记录全身和右心室血压的关键步骤。这里介绍的程序对于对化合物给药平台的静脉注射途径感兴趣的研究人员来说是一个重要的资源，以开发 PAH 的治疗方法。

研究方案

所有动物程序均按照耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准的协议进行。

1、动物、工具、血压测量设备、缺氧室的准备

1. 动物驯化。
   注意:用于本研究的实验动物是雄性，8周龄的C57BL / 6小鼠，体重为25-27g。在估计实验所需的动物数量时，应考虑几个因素，包括与手术相关的死亡率、意外的手术并发症和意外猝死。每组至少使用10只小鼠以达到统计功效并避免功效不足的研究。
   1. 接待后，将动物饲养在通风的啮齿动物笼子里（每个笼子五只动物一组），并提供适当的垫料、啮齿动物食物和水。让动物适应新环境（18-20°C下12小时的光暗循环）至少3天。
   2. 将它们随机分配到以下组:常氧（第 1 组）、缺氧（第 2 组）和缺氧 + 7C1/let-7 miRNA（第 3 组）。
2. 手术工具及血压测量设备的准备。
   1. 通过高压灭菌对所有手术工具进行灭菌（图1A）。
   2. 准备一个临时注射平台，其中包含自制麻醉鼻锥（图1B），缝合包（图1C）和PAH程序设备（图1D-F）。
3. 肺动脉高压 （PAH） 诱导的实验环境。
   1. 设置N₂ 罐，氧传感器和半密封缺氧室（图2A）。
   2. 在氧传感器中建立10%O₂的设定点，让系统达到稳态（图2B，C）。
   3. 将缺氧（第 2 组）和缺氧 + 7C1/let-7 miRNA（第 3 组）动物在缺氧 （10% O₂） 中保持 3 周。缺氧3周后，将动物置于常氧条件下1周（图2D）。常氧组（第 1 组）在常氧状态停留 4 周。
      注意:（1） 缺氧 3 周，然后常氧 1 周是发展 PAH 和右心室心力衰竭的行之有效方法⁷.氧传感器检测半密封缺氧室内的 O₂ 浓度，并通过气体输液管注入 N₂ 气体来校正它。
   4. 在整个实验期间（3周）每天检查动物。如果动物表现出痛苦的迹象，例如体重急剧下降和呼吸困难，请咨询兽医。如果对处于严重困境中的动物有必要实施安乐死，请将该动物排除在研究之外。
      注意:缺氧暴露会导致小鼠体重减轻。体重减轻 10% 通常用作 PAH 发展的可靠指标。
   5. 避免大量打开缺氧室。对于笼子清洁、补充食物、更换水瓶和复合给药，每周打开腔室不超过 1 小时。

2. 通过 颈静脉静脉推注

1. 小鼠制备和麻醉。
   1. 从缺氧室中取出缺氧（第2组）和缺氧+ 7C1 / let-7 miRNA（第3组）小鼠笼，并轻轻地将动物从笼中取出。
      注意:7C1/let-7 miRNA（1.5 mg/kg IV/剂量）的剂量方案为每周两次，持续 4 周的治疗。建议研究人员在静脉注射期间将缺氧和缺氧+复合治疗笼从缺氧室中取出，以确保所有动物在每个时间间隔内接受相同程度的缺氧暴露。
   2. 使用精密秤称量鼠标并记录其重量（图3A）。
   3. 将小鼠放入连接到麻醉剂蒸发器的麻醉诱导室中并关闭它（图3B）。提供热支持，并在双眼涂抹眼部润滑剂，以防止麻醉时干燥。将小鼠暴露于3%异氟烷直至失去知觉（图3C-D）。
   4. 将鼠标从腔室中取出，将毛发从下颌颅部剃到胸骨尾部中部。横向，从下颌角剃掉毛发，穿过脖子两侧，朝向肩膀（图3E）。
   5. 将异氟醚麻醉的小鼠置于仰卧位（腹部面朝上）在解剖显微镜下方的注射平台上。 通过 含有1.5%异氟醚的鼻锥维持麻醉，并用胶带轻轻束缚四条腿以固定身体（图3F）。
   6. 用直镊子施加有害刺激（即脚趾捏），以确保足够的麻醉水平。麻醉的小鼠在手术过程之前和整个手术过程中不应对刺激做出反应。
2. 注射剂制备。
   1. 在无菌条件下制备剂量为1.5mg / kg的单剂量注射化合物。
      注意:将注射化合物加热至室温 （RT），因为注射冷物质会引起不适和小鼠体温下降（如果这不会损坏化合物）。本研究中使用的化合物 7C1/let-7 miRNA 的最佳剂量和持续时间基于先前的出版物 ^8,9。
   2. 将无菌一次性注射器装入要注射的体积。直立握住注射器并推进柱塞以排出注射器中的空气。不要重复使用注射器。
   3. 在25g小鼠中将注射量限制为200μL，以降低血液稀释的发生率和对动物的异常心脏影响。如果需要更大的体积，将注射化合物分成两次注射，间隔10分钟。
3. 准备用于静脉注射的小鼠。
   1. 用三轮交替的聚维酮碘溶液和 70% 乙醇轻轻擦洗手术区域三次。在手术前 30 分钟给予丁丙诺啡（0.05 mg/kg，SQ）。
   2. 使用手术刀刀片在颈部中线右侧略微切开 0.5 厘米的纵向切口（图 3G）。
   3. 使用镊子分离肌肉和脂肪组织以定位右侧颈外静脉（图3H）。
      注意:每次旋转注射部位以避免疤痕形成。
   4. 使用高倍物镜，以便轻松可视化注射区域（图3I）。
4. 静脉注射
   1. 将28G无菌针头插入颈静脉，针头斜面朝上（图3J，K）。
      注意:尾静脉注射是颈静脉注射的替代方法。然而，由于静脉深度、小鼠尾巴皮肤颜色和皮肤硬度的可变性，该技术难以进行重复给药。
   2. 缓慢按压注射器柱塞，将化合物注入静脉中。让针头在静脉内再停留 10 秒，以防止注射剂回流（图 3L）。
      注意:蓝色染料可以很容易地可视化注射。注射测试材料时不要包括染料。不准确的注射将导致静脉注射部位周围积聚蓝色染料。
   3. 取出针头，用棉签对注射部位施加压力，以防止出血（图3M）。
   4. 用5-0缝合线缝合皮肤（图3N）。手术后，将动物移至温暖，清洁，干燥的区域，并提供美洛昔康（1mg / kg，SQ，q24h）。将动物放在干净的恢复笼中，没有垫料，但底部用纸巾覆盖。
      注意:小鼠应从麻醉中醒来，并在回到恢复笼后 5 分钟内恢复意识。监视鼠标是否有遇险迹象。
   5. 将动物放回笼子，将老鼠笼放回缺氧室。
      注意:从麻醉小鼠到完成颈静脉注射的整个过程，由单个实验者大约需要 10-15 分钟。为了缩短小鼠的常氧暴露时间，建议至少两名研究人员合作完成颈静脉注射程序。

3.血压测量

1. 准备用于血压测量的仪器。
   1. 在血流动力学测量前至少30分钟，将1.0F导管的尖端浸泡在37°C预热的PBS中（图4A）。
   2. 测量从导管插入部位到所需导管尖端位置的距离。例如，小鼠升主动脉到颈部中部之间的距离约为1-1.2厘米。心脏右心室到颈部中部之间的距离约为2.3-2.8厘米。
   3. 标记两个导管距离标记，以提供插入深度的视觉指示（图4B）。
   4. 将导管连接到压力传感器上，将压力传感器连接到数据采集设备上的输入通道1，打开压力-体积控制单元，启动数据采集血压分析软件。创建一个新的血压分析文档，并设置压力通道 1。
   5. 根据制造商的协议执行压力校准。让整个设置稳定至少5分钟（图4C）。
   6. 在血压分析软件中，从通道 1 下拉菜单中选择单位转换（图 4D，红色箭头）。
   7. 设置默认的单位转换值（图 4E）。
      注意:血压表示为毫米汞柱 （mmHg）。压力控制单元的标准化压力输出为每 100 mmHg 1 V。25 mmHg 对应 0.25 V 输出，100 mm Hg 对应 1 V 输出。
2. 准备用于血压测量程序的鼠标。
   1. 通过鼻锥吸入3%异氟醚麻醉小鼠。
   2. 将兽药膏直接涂抹在小鼠眼睛的眼表以防止干燥，因为小鼠在麻醉下无法闭上眼睛。在麻醉下剃掉老鼠脖子上的皮毛。
   3. 用三轮交替的聚维酮碘溶液和 70% 乙醇拭子擦洗剃光区域。将麻醉的小鼠置于解剖显微镜下方的注射平台上的仰卧位。将小鼠的鼻子放入鼻锥中，以在整个手术过程中保持麻醉（1.5%异氟烷）。
   4. 测试麻醉小鼠对有害刺激的运动反应。麻醉的小鼠在手术前和手术期间不应对有害刺激做出反应。
      注意:吸入（异氟醚）和注射（氯胺酮/甲苯噻嗪）麻醉剂可以降低血压。一般来说，异氟醚吸入麻醉对降低血压的作用比氯胺酮/甲苯噻嗪略有作用。因此，异氟醚是优于氯胺酮/甲苯噻嗪的吸入麻醉剂。达到适当的麻醉深度对于准确和可重复的血流动力学测量至关重要。研究者需要保持每只小鼠的麻醉深度恒定。
3. 升主动脉导管插入术
   1. 用直镊子施加有害刺激（即脚趾捏），以确保足够的麻醉水平。从下颌骨到胸骨做皮肤的中线切口（图5A）。
   2. 分离唾液腺并暴露气管（图5B）。
   3. 使用镊子清除血管上的软组织，以暴露右颈动脉和右颈外静脉（图5C）。
   4. 将 0.5 mL PBS 放入腔内，以减缓血管痉挛的发展，同时操纵颈动脉。
   5. 小心地隔离右颈动脉的 5 毫米部分。在血管下方放置一张无菌白纸作为背景，使动脉更明显（图5D）。
      注意: 小心地将迷走神经（白色）与动脉分开，并确保不会割伤或损坏神经或动脉。
   6. 使用 8-0缝合线系上一个永久结 （#1） 以关闭血管的颅端（图 5E）。
   7. 打一个松动的结 （#2） 以暂时阻塞主动脉的血流。然后，在前两条缝合线之间打第二个松散的结 （#3）（图 5F）。第二个松动的结 （#3） 将用于在放置后快速固定导管。
   8. 使用 25 G 针头，在 #3 和 #1 结扎线之间与血管对齐，做一个足够大以通过导管的小孔（图 5G）。
      注意:颈动脉从心脏输送含氧血液，压力非常高。如果颈动脉被切断，该压力将导致血液喷出（图5H）。
   9. 将导管与尖端保持 1.5 英寸，然后轻轻地将导管尖端插入动脉孔（X 标记）。拧紧导管和血管周围的中间缝合节点 （#3），使其仍允许导管通过（图 5I-J）。
      注意:此步骤需要练习。此步骤的潜在并发症包括导管插入部位出血和血管痉挛。当发生出血时，出血动脉的失血会减少血容量，导致全身血压严重下降。由于严重程度，动物已经达到了人道的终点，必须被安乐死。对于机械性血管痉挛，通常发生在血管持续收缩引起的导管插入过程中。这使得血管开口变小，并阻止导管向颈动脉推进。不要对阻力使用过大的力来推进导管。当遇到中度或重度血管痉挛抵抗时，请稍后再试一次或使用较小的导管（例如 1.0 F）。经验丰富的显微外科医生可以达到 100% 的升主动脉导管插入术成功率。
   10. 导管用传感器尖端通过第一个松动的结 （#2） 后，将第二个松动的结 （#3） 系得更紧以固定导管并轻轻松开第一个松动的结 （#2）（图 5K、L）。
   11. 根据导管上的标记继续将导管插入升主动脉（图4B），直到压力分析显示动脉血压曲线（图5M）。使用数据采集系统和软件记录全身血压 （SBP） 数据。
   12. 松开中间缝合节点 （#3） 以允许拔出导管（图 5N）。
   13. 在将导管从颈动脉中拉出之前，将中间缝合线节点 （#3） 绑在血管周围（图 5O-P）。
   14. 将导管放入 PBS 中。
4. 右心导管插入术。
   1. 小心地将右颈外静脉与周围的结缔组织隔离，并用8-0结扎所有小分支缝合线（蓝色箭头）（图6A）。
      注意:对于右心导管插入术，通常 通过 右颈静脉进入心脏。
   2. 使用 8-0缝合，打一个永久结 （#1） 以关闭血管的颅端（图 6B）。然后，在容器的尾端打一个松散的结（#2）（图6C）。
   3. 使用25 G针在永久结（#1）的近端做一个小孔（图6D）。
      注意:颈静脉将脱氧血液输送到心脏，并且压力低。如果颈静脉被切断，血液不会喷出（图6D，E）。
   4. 握住导管并将导管插入静脉切口（X标记）（图6E），并拧紧导管和血管周围的尾结（#2）（图6F）。
   5. 缓慢而轻柔地将导管推入右心。根据导管标记监测导管尖端深度（图4B）。
      注意:由于RV解剖结构和结构复杂，评估闭胸小鼠的右心室收缩压（RVSP）是一项挑战。这一步需要高水平的专业知识和大量的实践。在经验丰富的显微外科医生手中，右心室导管插入术的成功率可以接近90%。
   6. 根据软件中的压力波跟踪评估导管尖端位置。当导管尖端位于右心室时，监护仪将显示典型的 RVSP 示踪（图 6G、H）。
      注意:当肺压曲线的形状看起来不典型（例如，尖刺曲线）时，这意味着导管的位置不正确。通过轻轻地将导管向后拉一点来调整导管位置，然后缓慢地将导管推进到右心室内更中心的位置。为避免在研究数据中产生伪影，研究者应避免长时间（不超过 1 分钟）或重复尝试（不超过两次）右心室导管插入术。
   7. 保持导管不动并收集数据 5 分钟。
   8. 记录完成后，小心地将导管拉出并将尾结 （#2） 系在血管周围（图 6I）。将导管放回 PBS 溶液中。
      注意: 实验完成后，根据制造商的说明用 1% 消化酶溶液清洁导管。除了评估血流动力学状态外，研究人员还可以采集心脏和肺部进行 PAH 组织病理学检查。为确保多次静脉推注给药的有效性，研究人员可以分离肺内皮细胞并测量 let-7 miRNA 水平。

4.血压数据分析

1. 检查血压记录。
   1. 打开血压分析软件数据文件（PAH JOVE.adicht）。
   2. 在通道 1 中，选择一个表示压力信号的区域，并将波形光标放在峰值（X 标记）上以测量压力幅度（图 7A）。
   3. 确定压力波的最大振幅。这代表收缩压（图7A，红色箭头）。
   4. 按 Shift + Command + 3（适用于 Mac）或 Windows + Shift + S（适用于 Windows PC）从图像中提取感兴趣区域（图 7B 灰色区域），并将其粘贴到图形文件中。
2. 血压数据的统计分析。
   1. 在统计分析软件中输入单个小鼠的血压数据。
   2. 对两个研究组（常氧与缺氧;缺氧与缺氧 + 7C1/let-7 miRNA）进行未配对学生 t 检验。将平均值的差异视为 p < 0.05。

结果

麻醉通常会降低血压。因此，使用最小剂量的麻醉来消除响应有害刺激的运动。当静脉系统不同区域的血流动力学波形发生变化时，可以直观地看到成功的右心室通路（图8）。

在这项研究中，小鼠被随机分配到常氧（21% O₂）组（n = 10），缺氧（10% O₂）组（n = 10）或缺氧+ 7C1 / let-7治疗组（n = 10）。为了检查let-7 miRNA在抑制缺氧诱导的PAH发...

讨论

已经建立了几种肺动脉高压动物模型来模拟人类受试者的肺血管阻力事件升高。其中，小鼠缺氧诱导的PAH模型已被广泛用于评估PAH新实验疗法的有效性。使用这种模型的研究通常需要对小鼠施用化合物。与其他已发表的静脉注射 （IV） 注射和侵入性血流动力学评估方案相比，该方法提供了视觉说明和详细描述。

成功执行程序和获得准确和可重复的血压测量值有三个关键步骤?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 prolene suture pack	Ethicon	8698G	for incision closure
8-0 nylon suture pack	AROSurgical Instruments	T06A08N14-13	for ligation
Anesthesia induction chamber	VETEQUIP	#941444	Holds the animal during anesthesia exposure
Catheter Interface Cable PEC-4D	Millar		for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000
Charcoal canister filters	VETEQUIP	#931401	to help remove waste anesthetic gases
Cotton swabs	McKesson	24-106	for applying pressure to the injection site to prevent bleeding
Fine scissors	Fine Science Tools	14059-11	Surgical tools
Insulin syringe 28 G	EXEL	26027	for jugular vein IV injection
Isoflurane	COVETRUS	#029405	for mouse anesthesia
LabChart 8 Software	ADInstruments		for data analysis
Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F)	Millar		for invasive blood pressure measurement
Needle-25 G	BD	305124	for making a samll hole in a vessel
Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor	BioSpherix	E702	for oxygen concentration monitoring
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar		for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35
PowerLab 4/35	ADInstruments		for Data Acquisition. Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation.
Prism 8	GraphPad		for statistics and scientific graphing
Semisealable hypoxia chamber	BioSpherix		an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals
Spring Scissors	Fine Science Tools	15021-15	Surgical tools
Tweezer Style 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	Surgical tools
VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA	VasoRx, Inc.	Lot# B2-L-16Apr	IV injection compound
VIP 3000 Veterinary Vaporizer	COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC.		for accurate anesthesia delivery