JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا العمل بروتوكولا للشاشة الجينية المثبطة متعددة النسخ في Schizosaccharomyces pombe. تستخدم هذه الشاشة مكتبة بلازميد على نطاق الجينوم لتحديد استنساخ (نسخ) مثبط لنمط ظاهري مفقود الوظيفة مرتبط بسلالة متحولة للاستعلام. تم تحديد مثبطات جينية جديدة للمتحور الفارغ ell1 باستخدام هذه الشاشة.

Abstract

يعد تحديد التفاعلات الجينية أداة قوية لفك رموز وظائف الجينات (الجينات) من خلال توفير رؤى ثاقبة لعلاقاتها الوظيفية مع الجينات الأخرى وتنظيمها في المسارات والعمليات البيولوجية. على الرغم من أن غالبية الشاشات الجينية تم تطويرها في البداية في Saccharomyces cerevisiae ، فقد تم توفير منصة تكميلية لتنفيذ هذه الشاشات الجينية من قبل Schizosaccharomyces pombe. أحد الأساليب الشائعة المستخدمة لتحديد التفاعلات الجينية هو الإفراط في التعبير عن الحيوانات المستنسخة من مكتبة بلازميد عالية النسخ على نطاق الجينوم في متحور يفقد وظيفته ، يليه اختيار المستنسخات التي تقمع النمط الظاهري المتحور.

تصف هذه الورقة بروتوكولا لتنفيذ هذه الشاشة الجينية القائمة على "القمع متعدد النسخ" في S. pombe. ساعدت هذه الشاشة في تحديد مثبط (مثبطات) متعدد النسخ للنمط الظاهري الحساس للإجهاد الوراثي المرتبط بغياب عامل استطالة النسخ Ell1 في S. pombe. بدأت الشاشة عن طريق تحويل سلالة الاستعلام ell1 الطافرة الخالية مع مكتبة بلازميد S. pombe cDNA ذات رقم نسخ مرتفع واختيار المثبطات على ألواح EMM2 التي تحتوي على 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO) ، وهو مركب محفز للإجهاد السام للجينوم. في وقت لاحق ، تم عزل البلازميد من مستعمرتين مثبطتين في القائمة المختصرة وهضمها بواسطة إنزيمات التقييد لإطلاق الحمض النووي المدخل. تم إعادة تحويل البلازميدات التي تطلق جزءا من الحمض النووي المدرج إلى سلالة حذف ell1 لتأكيد قدرة هذه المستنسخات البلازميدية المثبطة على استعادة نمو متحور حذف ell1 في وجود 4-NQO وغيرها من المركبات السامة للجينات. تم تسلسل تلك البلازميدات التي تظهر إنقاذا للنمط الظاهري للحذف لتحديد الجين (الجينات) المسؤول عن قمع النمط الظاهري الحساس للإجهاد المرتبط بالحذف ell1.

Introduction

توفر شبكات التفاعلات الجينية معلومات وظيفية حول الجينات وتحدد المسارات والعمليات البيولوجية التي قد تشارك فيها هذه الجينات في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، قد توفر أيضا رؤى حول كيفية تفاعل الجينات المختلفة مع بعضها البعض ، مما يؤدي إلى نمط ظاهري محدد1،2،3. على مر السنين ، تم تصميم مجموعة متنوعة من الشاشات الجينية من قبل الباحثين للإجابة على الأسئلة البيولوجية الأساسية ودراسة الأمراض البشرية. يمكن إجراء فحوصات لتحديد التفاعلات الجينية بطرق متعددة. يمكن أن تمثل التفاعلات الجينية المحددة في الشاشات الجينية المختلفة علاقات ميكانيكية متميزة بين الجينات. علاوة على ذلك ، كشفت الدراسات أن مجموعة مشتركة من التفاعلات الجينية تتقاسمها الجينات التي تشفر البروتينات التي تنتمي إلى نفس المسار أوالمعقدة 4,5. وبالتالي ، يمكن استخدام شبكات التفاعل الجيني لإنشاء التنظيم الوظيفي في الخلية ، حيث تنتمي الجينات التي تشترك في أكثر الملفات الشخصية تشابها إلى نفس المجمع أو المسار ، وتنتمي تلك الجينات التي تشترك في ملفات تعريف أقل تشابها إلى حد ما إلى نفس العملية البيولوجية ، وتعكس تلك الجينات التي تظهر ملفات تعريف متداخلة ولكنها أكثر تنوعا أعضاء ينتمون إلى نفس المقصورة الخلوية6.

تعد شاشات التفاعل الجيني القائمة على قمع الجرعة ("قمع النسخ العالي أو النسخ المتعددة") واحدة من الأساليب الشائعة الاستخدام. يمكن إجراء هذه الشاشات عن طريق تحويل سلالة متحورة للاستعلام باستخدام مكتبة جينومية أو cDNA عالية النسخ ، تليها تقنيات الفحص / الاختيار المناسبة لتحديد قمع أو تعزيز التفاعلات الجينية 7,8,9. لضمان تغطية شاملة على نطاق الجينوم ، تم إجراء هذه الشاشات أيضا عن طريق المبالغة في التعبير عن جين معين ذي أهمية في مجموعة من المتحورات المفقودة للوظيفة على نطاق الجينوم أو عن طريق المبالغة في التعبير عن مكتبة جينومية عالية العدد من البلازميد المشفر بالبلازميد أو cDNA في متحفر استعلام فقدان الوظيفة 9,10,11,12,13,14,15 . يمكن أن تعمل استراتيجية النسخ المتعددة أيضا باستخدام نهج مهيمن / مفرط في التعبير باستخدام مروج قابل للتنظيم.

تتمثل المزايا الرئيسية لاستخدام الشاشات القائمة على المثبطات في أن قمع النمط الظاهري الموجود مسبقا في سلالة متحولة بواسطة جين آخر ينشئ علاقة وراثية بين هذين المنتجين الجينيين ربما لم يتم إثباتهما باستخدام أساليب أخرى. ثانيا، لوحظ أن وجود طفرة موجودة مسبقا يحسس مسارا معينا، مما يسمح بتحديد مكونات إضافية لهذا المسار من خلال عزل المثبطات، والتي ربما لم يتم تحديدها عن طريق اختيارات جينية أكثر مباشرة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الشاشة لتحديد المثبطات التي لها آليات قمع مختلفة16. عادة ما تحدث التفاعلات المثبطة بين الجينات ذات الصلة وظيفيا ويمكن استخدامها لتوضيح التسلسلات الهرمية في المسارات. قد تختلف الآلية الأساسية الدقيقة للقمع بناء على عدة عوامل، بما في ذلك نوع متحور الاستعلام المستخدم في الشاشة، والظروف التجريبية، ومستوى التعبير الجيني. تتضمن إحدى آليات قمع الجرعة الشائعة جينات ترميز المنتجات التي تعمل معا في نفس المجمع أو بالتوازي في نفس العملية الخلوية / البيولوجية. يمكن توسيع نتائج هذه الشاشات في الكائنات الحية النموذجية الأبسط مثل الخميرة إلى الكائنات حقيقية النواة الأعلى حيث يتم الحفاظ على معظم المسارات والعمليات البيولوجية الأساسية عبر التطور.

يمكن أيضا تعديل هذه الشاشات الجينية بعدة طرق للإجابة على الأسئلة البيولوجية المختلفة. على سبيل المثال ، يمكن تحديد الجينات التقويمية من الكائنات الحية المختلفة التي يمكنها قمع النمط الظاهري لسلالة الاستعلام المتحولة. كما تم استخدامه لتحديد آليات المقاومة المحتملة وتحديد أهداف البروتين للمركبات الجديدة المضادة للبكتيريا17,18 والمضادة للفطريات 19,20 والمضادة للطفيليات 21 والمضادة للسرطان 22. كما تم استغلال هذه الشاشة لتحديد مثبطات نشاط الأدوية الصيدلانية التي لا تعرف آلية عملها. وبالتالي ، من حيث المبدأ ، يمكن تحسين هذه الشاشات المثبطة متعددة النسخ واستخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات في الكائنات الحية المختلفة. على الرغم من أن معظم الشاشات الجينية التي يستخدمها باحثو الخميرة قد تم تطويرها في البداية في S. cerevisiae ، فقد برزت S. pombe كنظام نموذجي تكميلي لإجراء مختلف الفحوصات الجينية والفحوصات23. علاوة على ذلك ، فإن التنظيم الجينومي والعمليات البيولوجية في S. pombe ، مثل حدوث الإنترونات في المزيد من الجينات ، وتعقيد أصول تكرار الحمض النووي ، وبنية centromere ، وتنظيم دورة الخلية ووجود آلية RNAi ، تظهر تشابها أكبر بين S. pombe وحقيقيات النوى الأعلى23,24 ، مما يؤكد أهمية تصميم واستخدام الأدوات الجينية في S. pombe.

تصف هذه الورقة بروتوكولا لتحديد التفاعلات الجينية بناء على "قمع الجرعة" للنمط الظاهري المتحور المفقود الوظيفة في S. pombe. أساس هذا البروتوكول هو أنه طريقة سريعة وفعالة لفحص مكتبة cDNA التي تبالغ في التعبير عن جينات النوع البري إما على بلازميد متعدد النسخ و / أو من مروج قوي. يحتوي هذا البروتوكول على أربع خطوات رئيسية: تحويل المكتبة إلى سلالة متحولة للاستعلام ، واختيار مستنسخات البلازميد التي تقمع النمط الظاهري المطلوب لسلالة الاستعلام المتحولة ، واسترداد البلازميد (البلازميدات) من هذه المستنسخات المثبطة ، وتحديد الجين المسؤول عن قمع النمط الظاهري. كما هو الحال بالنسبة لأي طريقة تعتمد على اختيار وتحديد cDNAs من المكتبة ، يعتمد نجاح الشاشة على استخدام مكتبة عالية الجودة وعالية التعقيد حيث يمكن للشاشة استرداد فقط تلك المستنسخات cDNA الموجودة في المكتبة.

باستخدام هذا البروتوكول ، نجحنا في تحديد اثنين من المثبطات الجديدة للنمط الظاهري الحساس للإجهاد السام الوراثي للاستعلام S. pombe ell1 null mutant. عائلة ELL (أحد عشر تسعة عشر ليسين الغنية بسرطان الدم) من عوامل استطالة النسخ تمنع التوقف المؤقت العابر لبوليميراز الحمض النووي الريبي II على قوالب الحمض النووي في المقايسات الكيميائية الحيوية في المختبر ويتم حفظها عبر الكائنات الحية المختلفة ، من الخميرة الانشطارية إلى البشر25. وقد قدمت أعمال سابقة أدلة على أن متحور S. pombe ell1 الفارغ يظهر حساسية الإجهاد السام وراثيا في وجود 4-nitroquinoline 1-oxide (4-NQO) وميثيل ميثان سلفونات (MMS)26. لذلك ، قمنا بتحويل مكتبة cDNA متعددة النسخ المشفرة بالبلازميد S. pombe إلى الاستعلام S. pombe ell1 null mutant وحددنا اثنين من المستنسخات المفترضة التي أظهرت القدرة على قمع حساسية الإجهاد السام الوراثي للمتحور الفارغ S. pombe ell1 في وجود 4-NQO ، وهو مركب يحفز آفات الحمض النووي. حدد التسلسل اللاحق للإدراج الموجود في استنساخ البلازميد أن الجينات التي تشفر rax2+ و osh6+ كانت مسؤولة عن قمع حساسية الإجهاد السام الجيني للمتحور الفارغ ell1 عند المبالغة في التعبير عنه في المتحور الفارغ ell1.

Protocol

1. تحويل مكتبة cDNA إلى سلالة S . pombe المتحولة للاستعلام لفحص المثبطات متعددة النسخ

ملاحظة: تم اتباع طريقة الليثيوم - خلات الليثيوم القياسية27 لتحويل مكتبة S. pombe cDNA إلى سلالة S. pombe ell1Δ مع بعض التعديلات:

  1. تنمو سلالة S. pombe ell1Δ عند 32 درجة مئوية على لوحة متوسطة YE (الجدول 1) مكملة ب 225 ميكروغرام / مل لكل من الأدينين والليوسين واليوراسيل. قم بتلقيح حلقة مليئة بالتلقيح من سلالة ell1Δ من اللوحة المذكورة أعلاه في 15-20 مل من وسط YE مع استكمال 225 ميكروغرام / مل لكل من الأدينين والليوسين واليوراسيل. احتضنه بين عشية وضحاها عند 32 درجة مئوية مع الاهتزاز (200-250 دورة في الدقيقة).
  2. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الثقافة بين عشية وضحاها في 100 مل من وسط YE الطازج مع المكملات الغذائية المطلوبة إلى OD 600 nm (الكثافة البصرية عند 600 nm) من 0.3 واحتضنها عند 32 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200-250 دورة في الدقيقة حتى يصل OD600 nm إلى مرحلة منتصف السجل.
  3. قسم مزرعة 100 مل إلى أنبوبين لأجهزة الطرد المركزي سعة 50 مل، يليهما الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 4000 × جم.
  4. تخلص من المادة الفائقة واغسل حبيبة الخلية ب 1 مل من الماء المعقم ، أي أعد تعليق الخلايا في 1 مل من الماء المعقم وأجهزة الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. تخلص من المادة الفائقة واغسل كل حبيبة خلية بمحلول 1 مل من 1x LiAc-TE (100 mM lithium acetate ، 10 mM Tris-HCl ، 1 mM EDTA ، pH 7.5) كما هو موضح في الخطوة 1.4.
  6. قم بإزالة supernatant وأعد تعليق كل حبيبة خلية في 250 ميكرولتر من 1x LiAc-TE. استخدم هذه الخلايا المختصة S. pombe (500 ميكرولتر) للتحويل باستخدام الحمض النووي محل الاهتمام. نقل 125 ميكرولتر من الخلايا المختصة إلى أربعة أنابيب مختلفة لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة المعقمة لخطوات التحويل اللاحقة.
  7. غلي الحمض النووي الناقل من خصيتي السلمون أو الحيوانات المنوية الرنجة لمدة 1 دقيقة ووضعها على الفور على الجليد. لكل تحويل، أضف 10 ميكرولتر من الحمض النووي الناقل المشوه أحادي الخيط إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على 125 ميكرولتر من الخلايا المختصة، يليه خلط لطيف باستخدام طرف ماصة دقيقة. بعد ذلك ، أضف 50 ميكروغرام من مكتبة S. pombe cDNA إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الحامل للخلايا المختصة الذي يحتوي على خليط الحمض النووي.
  8. احتضن أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم أضف 260 ميكرولتر من محلول خلات البولي إيثيلين جليكول ليثيوم (40٪ [w / v] PEG 4000 ، 100 mM lithium acetate ، 10 mM Tris-HCl ، 1 mM EDTA ، pH 7.5) إلى الأنابيب واخلطها بلطف بمساعدة طرف ماصة دقيقة.
  9. احتضان أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على خليط التحويل عند 32 درجة مئوية لمدة 2 ساعة دون اهتزاز. أضف 43 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ثنائي الميثيل المسخن مسبقا (DMSO) إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق واخلطه بلطف. بعد ذلك ، قم بتعريض الأنابيب لصدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. اضرب الخلايا على 4000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الفائقة وقم بإزالة محلول PEG- LiAc-TE المتبقي بمساعدة طرف ماصة دقيقة.
  11. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من الماء المعقم والصفيحة على لوحة EMM2 واحدة (الجدول 1) (150 مم) مع المكملات الغذائية المطلوبة و 0.2 ميكروغرام / مل من 4-NQO.
  12. احتضن الألواح عند 32 درجة مئوية لمدة 5-6 أيام للسماح للمستعمرات بالظهور على اللوحات. قم بربط المستعمرات التي تم الحصول عليها على نفس اللوحة المتوسطة في وجود 0.2 ميكروغرام / مل من 4-NQO واستخدامها لمزيد من الفحص.
  13. بالنسبة لتجربة تحويل مكتبة واحدة، استخدم 500 ميكرولتر من الخلايا المختصة (125 ميكرولتر من الخلايا المختصة × 4 أنابيب أجهزة طرد مركزي دقيقة) للتحويل كما هو موضح في الخطوات من 1.8 إلى 1.14 أعلاه.
  14. كعنصر تحكم ، لوحة 1/10th من خليط التحويل على لوحة EMM2 واحدة (150 مم) مع المكملات المطلوبة ، ولكن تفتقر إلى 4-NQO ، لحساب العدد الإجمالي لاستنساخ المكتبة التي تم الحصول عليها بعد تحويل المكتبة ، وفحص عزل المستنسخات المثبطة.

2. اختبار والتحقق من صحة إنقاذ / قمع النمط الظاهري المرتبط بسلالة الاستعلام المتحورة بواسطة الكابت المفترض

ملاحظة: تم إجراء اختبارات بقعة الإجهاد كما هو موضح أدناه لاختبار والتحقق من صحة إنقاذ / قمع حساسية الإجهاد 4-NQO المرتبطة بالحذف ell1 بواسطة المثبط (المثبطات) المفترضة.

  1. أضف 100-200 ميكرولتر من الماء المعقم في كل بئر من الآبار المختلفة لصفيحة ميكروتيتر معقمة من 96 بئرا.
  2. اختر كمية صغيرة من التلقيح من كل مستعمرة من المستعمرات المختلفة التي تم الحصول عليها بعد تحويل مكتبة cDNA على اللوحة التي تحتوي على 4-NQO باستخدام مسواك معقم أو طرف ماصة ميكروماصة 20-200 ميكرولتر. أضف اللقاح من كل مستعمرة من المستعمرات المختلفة إلى آبار مستقلة منفصلة من صفيحة microtiter تحتوي على 100-200 ميكرولتر من الماء المعقم. اخلطي جيدا.
  3. بقعة 3 ميكرولتر من تعليق الخلية من كل بئر على ألواح أجار EMM2 التي تحتوي على الأدينين (225 ميكروغرام / مل) والوراسيل (225 ميكروغرام / مل) ولكنها تفتقر إلى الليوسين (علامة التغذية المساعدة القابلة للاختيار الموجودة على متجه البلازميد المستخدم في بناء المكتبة المستخدمة في هذا العمل). أضف تركيزات مناسبة من 4-NQO إلى الألواح حسب الحاجة.
  4. احتضن الألواح عند 32 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام للسماح للخلايا بالنمو. تحديد المستعمرات التي تظهر نموا في وجود تركيزات مختلفة من 4-NQO كمثبطات مفترضة.
  5. لمزيد من التحقق من صحة المثبطات ، قم بزراعة المثبطات المختارة جنبا إلى جنب مع سلالات التحكم المناسبة بين عشية وضحاها عند 32 درجة مئوية مع اهتزاز (200-250 دورة في الدقيقة) في وسط EMM2 يحتوي على 225 ميكروغرام / مل لكل من الأدينين واليوراسيل ولكن يفتقر إلى الليوسين.
  6. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الخلايا إلى OD 600 نانومتر من 0.3 في وسط EMM2 الطازج وقم بتنميتها عند 32 درجة مئوية مع الاهتزاز حتى مرحلة منتصف السجل (حواليOD 600 نانومتر من 0.6-0.8).
  7. حدد التخفيفات التسلسلية المناسبة (1:10 أو 1:5) للثقافات على لوحات EMM2 مع المكملات المطلوبة التي تحتوي إما على 0.4 ميكرومتر 4-NQO أو 0.01٪ MMS. للتحكم ، حدد السلالات على لوحة EMM2 مع المكملات الغذائية المطلوبة ولكن تفتقر إلى أي عامل ضار بالحمض النووي.
  8. احتضان الألواح عند 32 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام لمراقبة النمو.
    ملاحظة: يجب استخدام المقايسات المناسبة استنادا إلى النمط الظاهري المرتبط بسلالة الاستعلام المتحولة لاختبار إنقاذ النمط الظاهري أو قمعه. على سبيل المثال، إذا كانت هناك حاجة إلى تحديد مثبطات النمط الظاهري الحساس للبرد لسلالة متحورة استعلامية، فإن اختبار اختبار المستنسخات المثبطة والتحقق من صحتها سيتضمن محولات متنامية في درجة حرارة منخفضة.
  9. حدد السلالات الطافرة المتحولة باستخدام جين كامل الطول ذي أهمية (Spell1 في هذه الحالة) أو متجه فارغ كعناصر تحكم إيجابية وسلبية ، على التوالي ، إلى جانب محولات المكتبة.

3. عزل البلازميد عن استنساخ مثبط S. pombe

ملاحظة: تم إجراء عزل البلازميد من S. pombe باتباع البروتوكول الموصوف في الخميرة الانشطارية: دليل المختبر28 مع بعض التعديلات.

  1. قم بتلقيح مستعمرة خميرة واحدة في وسط EMM2 يحتوي على 225 ميكروغرام / مل من الأدينين واليوراسيل وتنمو الخلايا بين عشية وضحاها عند 32 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200-250 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، قم بحصاد 5 خلايا O.D. (أي 10 مل من O.D. 0.5) عن طريق الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة عند 4000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بإزالة المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبة الخلية في 0.2 مل من المخزن المؤقت للتحلل (2٪ Triton X-100 و 1٪ SDS و 100 mM NaCl و 10 mM Tris HCl (الرقم الهيدروجيني 8.0) و 1 mM Na2EDTA).
  3. أضف 0.2 مل من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل (25:24:1) و 0.3 جم من الخرز الزجاجي المغسول بالأحماض إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. دوامة أنبوب الطرد المركزي الدقيق لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية واحتضن على الجليد لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة 6x.
  4. قم بطرد الأنبوب مركزيا عند 10000 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. انقل الطبقة المائية العليا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق طازج وأضف 200 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل (25: 24: 1).
  5. جهاز طرد مركزي للأنبوب على ارتفاع 10000 × غرام لمدة 10 دقائق. انقل الطبقة المائية العليا إلى أنبوب جديد وأضف مجلدين من الإيثانول بنسبة 100٪ (~ 400 ميكرولتر) وحجم 1/10 من خلات الصوديوم (3 م ، درجة الحموضة 5.8) (~ 20 ميكرولتر) إلى الأنبوب. احتضان أنبوب الطرد المركزي الدقيق -70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  6. عجل الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي في 10000 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant. اغسل حبيبات الحمض النووي بالإيثانول بنسبة 70٪ (~ 500 ميكرولتر) واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة حتى تجف في الهواء.
  7. أعد تعليق الحمض النووي في 20 ميكرولتر من الماء المعقم. استخدم 2-5 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد لتحويل خلايا الإشريكية القولونية المختصة.
    ملاحظة: يمكن أيضا عزل البلازميد من خلايا الخميرة باستخدام أي من مجموعات عزل بلازميد الخميرة المتاحة تجاريا.

4. تحديد الجين المشفر بواسطة استنساخ المثبط

  1. تحويل بلازميدات الخميرة المعزولة إلى سلالة E. coli Top10 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] باستخدام البروتوكول القياسي29 ونشر الخلايا على ألواح LB (مرق لوريا) مع المضادات الحيوية المطلوبة.
  2. اعزل البلازميد (البلازميدات) عن محولات الإشريكية القولونية باستخدام بروتوكول التحلل القلوي القياسي29 ، واتبع المجموعات المناسبة من إنزيمات التقييد للتحقق من إطلاق جزء الحمض النووي المدرج عن طريق هضم التقييد.
    ملاحظة: تم هضم البلازميد المثبط 84 باستخدام إنزيم تقييد Bam HI ، وتم هضم البلازميد المثبط 104 باستخدام إنزيمات تقييد PstI / BamHI.
  3. أعد تحويل البلازميدات التي تظهر إطلاق الإدراج بعد تقييد الهضم في سلالة ell1 Δ للتحقق من قدرتها على إنقاذ النمط الظاهري الحساس للإجهاد السام الوراثي لسلالة ell1Δ.
  4. حدد المستنسخات البلازميدية التي تظهر قمع حساسية الإجهاد السام الجيني وتسلسل جزء الحمض النووي المدرج الموجود في هذه المستنسخات البلازميدية باستخدام الاشعال الأمامي والعكسي الخاص بالمتجهات.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام التمهيدي الأمامي العالمي الخاص ب adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30.
  5. لتحديد الجين المسؤول عن القمع، قم بمحاذاة التسلسل الذي تم الحصول عليه باستخدام انفجار نيوكليوتيدات NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) أو أداة محاذاة تسلسل Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). حدد التسلسل الذي يظهر أقصى محاذاة وحدده على أنه الجين الخاص بالبلازميد الكابت متعدد النسخ.

النتائج

فحص المثبطات متعددة النسخ لحساسية الإجهاد السام الجيني المرتبطة بالحذف ell1 في S. pombe
أجرينا الفحص الجيني باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه لتحديد المثبطات متعددة النسخ للنمط الظاهري لفقدان الوظيفة للسلالة الطافرة لحذف الاستعلام ell1. تم ...

Discussion

تم استخدام الخمائر على نطاق واسع للتحقيق في العمليات والمسارات البيولوجية الأساسية التي يتم حفظها تطوريا عبر الكائنات حقيقية النواة. إن توافر الأدوات الجينية والجينومية إلى جانب قابليتها للتكيف مع مختلف الإجراءات الكيميائية الحيوية والوراثية والجزيئية يجعل الخمائر كائنا نموذجيا ممتا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة بحثية مقدمة من إدارة التكنولوجيا الأحيائية بحكومة الهند (المنحة رقم BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) إلى نيميشا شارما. يشكر المؤلفون البروفيسور تشارلز هوفمان (كلية بوسطن ، الولايات المتحدة الأمريكية) على هدية مكتبة S. pombe cDNA والبروفيسور سوزان فورسبورغ على بلازميدات الخميرة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4-NQOSigmaN8141
Acetic Acid, glacialSigma1371301000
Adenine SulphateHimediaGRM033
AgarHimediaGRM026
AgaroseLonza50004L
Ammonium ChlorideHimediaMB054
BamHIFermentasER0051
BiotinHimediaRM095
Boric AcidHimediaMB007
Calcium Chloride SigmaC4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1SigmaC0549
Citric AcidHimediaRM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrousHimediaGRM3960
single stranded DNA from Salmon testesSigmaD7656
EDTA disodiumSigma324503
Ferric Chloride HexahydrateHimediaRM6353
GlucoseAmresco188
IonositolHimediaGRM102
IsopropanolQualigenQ26897
LeucineHimediaGRM054
Lithium AcetataeSigma517992
Magnesium Chloride HexahydrateHimediaMB040
Molybdic AcidHimediaRM690
Nicotinic AcidHimediaCMS177
PEG, MW 4000Sigma81240
Pentothinic AcidHimediaTC159
PhenolHimediaMB082
Plasmid Extraction KitQiagen27104
Potassium ChlorideSigmaP9541
Potassium hydrogen PthallateMercDDD7D670815
Potassium iodideHimediaRM1086
RNAseFermentasEN0531
SDSHimediaGRM205
Sodium HydroxideHimediaGRM1183
Sodium SulphateHimediaRM1037
Tris free BaseHimediaMB209
UracilHimediaGRM264
Yeast Extract PowderHimediaRM668
Zinc Sulphate HeptahydrateMercDJ9D692580

References

  1. Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
  2. Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -. L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
  3. Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712 (2015).
  4. Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), 808-813 (2004).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), 425-431 (2010).
  6. Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), (2016).
  7. Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
  8. Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
  9. Carlsson, M., Hu, G. -. Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840 (2018).
  10. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  11. Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
  12. Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
  13. Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  14. Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
  15. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  16. Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
  17. Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
  18. Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
  19. Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
  20. Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
  21. Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
  22. Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
  23. Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
  24. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  25. Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
  26. Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), 1641-1653 (2017).
  27. Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969 (2016).
  28. Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. . Fission yeast: a laboratory manual. , (2016).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932 (2006).
  30. Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090 (2006).
  32. Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
  33. Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601 (2021).
  34. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  35. Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
  36. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  37. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  38. Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
  39. Melnykov, A. V., Elson, E. L. . MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444 (2019).
  40. Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
  41. Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
  42. Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
  43. Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
  44. Kim, D. -. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
  45. Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187 Schizosaccharomyces pombe Ell1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved