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要約

この研究は、 シゾサッカロミセス・ポンベにおけるマルチコピーサプレッサー遺伝子スクリーニングのプロトコルについて説明しています。このスクリーニングでは、ゲノムワイドなプラスミドライブラリを使用して、クエリ変異株に関連する機能喪失表現型のサプレッサークローンを特定します。 ell1 null変異体の新規遺伝子抑制因子をこのスクリーンを用いて同定した。

要約

遺伝的相互作用の同定は、他の遺伝子との機能的関係や生物学的経路やプロセスへの組織化に関する洞察を提供することにより、遺伝子の機能を解読するための強力なツールです。遺伝子スクリーニングの大部分は当初、 Saccharomyces cerevisiaeで開発されましたが、これらの遺伝子スクリーニングを実施するための補完的なプラットフォームは、 Schizosaccharomyces pombeによって提供されています。遺伝的相互作用を同定するために使用される一般的なアプローチの1つは、機能喪失変異体におけるゲノムワイドな高コピー数プラスミドライブラリからのクローンの過剰発現と、それに続く変異表現型を抑制するクローンの選択です。

この論文では、 S. pombeでこの「マルチコピー抑制」ベースの遺伝子スクリーニングを実施するためのプロトコルについて説明します。このスクリーニングは、 S. pombe におけるEll1転写伸長因子の欠如に関連する遺伝毒性ストレス感受性表現型のマルチコピー抑制因子を特定するのに役立ちました。スクリーニングは、クエリ ell1 ヌル変異株を高コピー数の S.ポンベ cDNAプラスミドライブラリで形質転換し、遺伝毒性ストレス誘導化合物である4-ニトロキノリン1-オキシド(4-NQO)を含むEMM2プレート上のサプレッサーを選択することによって開始されました。続いて、プラスミドを2つの候補リストに載せたサプレッサーコロニーから単離し、制限酵素によって消化してインサートDNAを放出した。インサートDNA断片を 放出 するプラスミドをell1欠失株に再形質転換し、これらのサプレッサープラスミドクローンが4-NQOおよび他の遺伝毒性化合物の存在下で ell1 欠失変異体の増殖を回復する能力を確認した。欠失表現型のレスキューを示すこれらのプラスミドを配列決定して、 ell1 欠失関連遺伝毒性ストレス感受性表現型の抑制に関与する遺伝子を同定した。

概要

遺伝的相互作用のネットワークは、遺伝子に関する機能情報を提供し、これらの遺伝子がin vivoで関与する可能性のある経路と生物学的プロセスを描写します。さらに、それらはまた、異なる遺伝子が互いにどのように相互作用し、特定の表現型をもたらすかについての洞察を提供するかもしれない1,2,3。長年にわたり、基本的な生物学的質問に答え、人間の病気を研究するために、さまざまな遺伝子スクリーニングが研究者によって設計されてきました。遺伝的相互作用の同定のためのスクリーニングは、複数の方法で実施することができる。異なる遺伝子スクリーニングで同定された遺伝的相互作用は、遺伝子間の異なる機構的関係を表すことができる。さらに、研究により、遺伝的相互作用の共通のセットが、同じ経路または複合体に属するタンパク質をコードする遺伝子によって共有されることが明らかになりました4,5。したがって、遺伝的相互作用ネットワークは、細胞内の機能的組織を確立するために使用することができ、ここで、最も類似したプロファイルを共有する遺伝子は同じ複合体または経路に属し、幾分類似していないプロファイルを共有するそれらの遺伝子は同じ生物学的プロセスに属し、重複するがより多様なプロファイルを示すそれらの遺伝子は同じ細胞区画6に属するメンバーを反映する。

投与量抑制(「高コピーまたはマルチコピー抑制」)に基づく遺伝的相互作用スクリーニングは、一般的に使用されるアプローチの1つです。これらのスクリーニングは、クエリ変異株を高コピー数のゲノムまたはcDNAライブラリで形質転換し、続いて遺伝的相互作用を抑制または増強することを同定するための適切なアッセイ/選択技術によって実行することができる7、8、9。ゲノムワイドな包括的なカバレッジを確保するために、これらのスクリーニングは、ゲノムワイドな機能喪失変異体のコレクションにおいて目的の特定の遺伝子を過剰発現させることによって、または機能喪失クエリ変異体9、10、11、12、13、14、15において、高コピー数のプラスミドコードゲノムまたはcDNAライブラリを過剰発現することによっても実施されている。.マルチコピー戦略は、調節可能なプロモーターを用いたドミナント/過剰発現アプローチを使用しても機能する可能性がある。

サプレッサーベースのスクリーニングを使用する主な利点は、別の遺伝子による変異株における既存の表現型の抑制が、他のアプローチでは実証されなかった可能性のあるこれら2つの遺伝子産物間の遺伝的関係を確立することである。第二に、既存の突然変異の存在が特定の経路を感作し、より直接的な遺伝的選択によって同定されなかった可能性のあるサプレッサーの単離によってその経路の追加成分を同定することを可能にすることが観察されている。さらに、この画面は、抑制16の異なるメカニズムを有するサプレッサを識別するために使用することができる。サプレッサー相互作用は通常、機能的に関連する遺伝子間で発生し、経路の階層を解明するために使用できます。抑制の正確な根底にあるメカニズムは、スクリーニングで使用されるクエリ変異体の種類、実験条件、および遺伝子発現のレベルを含むいくつかの要因に基づいて異なり得る。一般的な投与量抑制メカニズムの1つは、同じ複合体内で、または同じ細胞/生物学的プロセス内で並行して機能する製品をコードする遺伝子を含む。酵母などのより単純なモデル生物におけるこのようなスクリーニングの結果は、ほとんどの基本的な生物学的経路とプロセスが進化全体にわたって保存されるため、高等真核生物に拡張することができます。

これらの遺伝子スクリーニングは、さまざまな生物学的質問に答えるためにいくつかの方法で変更することもできます。例えば、クエリ変異株の表現型を抑制することができる異なる生物由来のオーソログ遺伝子を同定することができる。また、潜在的な耐性メカニズムを描写し、新規抗菌17,18、抗真菌19,20、抗寄生虫21、および抗癌22化合物のタンパク質標的を決定するためにも使用されています。このスクリーニングは、作用機序が不明な医薬品の活性の抑制因子を特定するためにも利用されています。したがって、原則として、これらのマルチコピーサプレッサースクリーンは、最適化され、異なる生物の様々な用途で使用することができる。酵母研究者が採用する遺伝子スクリーニングのほとんどは、最初はS. cerevisiaeで開発されましたが、S. pombeは、さまざまな遺伝子スクリーニングおよびアッセイを実施するための補完的なモデルシステムとして浮上しています23。さらに、より多くの遺伝子におけるイントロンの発生、DNA複製の起源の複雑さ、セントロメア構造、細胞周期の組織化、RNAi機構の存在など、S. pombeのゲノム組織化と生物学的プロセスは、S. pombeと高等真核生物との間により大きな類似性を示しており23,24、S. pombeの遺伝的ツールの設計と使用の重要性を強調しています。

この論文では、 S. pombeの機能喪失変異表現型の「投与量抑制」に基づいて遺伝的相互作用者を特定するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルの基礎は、マルチコピープラスミド上および/または強力なプロモーターのいずれかで野生型遺伝子を過剰発現するcDNAライブラリをスクリーニングするための迅速かつ効率的な方法であるということです。このプロトコルには、ライブラリのクエリ変異株への形質転換、クエリ変異株の望ましい表現型を抑制するプラスミドクローンの選択、これらのサプレッサークローンからのプラスミドの取得、および表現型の抑制に関与する遺伝子の同定の4つの主要なステップがあります。ライブラリからのcDNAの選択と同定に基づくあらゆる方法に当てはまるように、スクリーンはライブラリに存在するcDNAクローンのみを取得できるため、スクリーンの成功は高品質で複雑なライブラリの使用に依存します。

このプロトコルを使用して、クエリS. pombe ell1 null変異体の遺伝毒性ストレス感受性表現型の2つの新規サプレッサーを特定することに成功しました。転写伸長因子のELL(Eleven Nineteen Lysine Rich Whiteemia)ファミリーは、in vitro生化学的アッセイにおけるDNAテンプレート上のRNAポリメラーゼIIの一時的な休止を抑制し、分裂酵母からヒトまで、さまざまな生物にわたって保存されています25。以前の研究では、S. pombe ell1ヌル変異体が4-ニトロキノリン1-オキシド(4-NQO)およびメタンスルホン酸メチル(MMS)の存在下で遺伝毒性ストレス感受性を示すという証拠が提供されています26。そこで、S. pombe プラスミドにコードされたマルチコピーcDNAライブラリをクエリ S. pombe ell1 null 変異体に形質転換し、DNA病変を誘発する化合物である 4-NQO の存在下で S. pombe ell1 null 変異体の遺伝毒性ストレス感受性を抑制する能力を示す2つの推定クローンを同定しました。プラスミドクローンに存在するインサートのその後の配列決定により、rax2+およびosh6+をコードする遺伝子が、ell1 null変異体で過剰発現した場合のell1 null変異体の遺伝毒性ストレス感受性の抑制に関与していることが特定されました。

プロトコル

1. cDNAライブラリのクエリ S.ポンベ 変異株への変換によるマルチコピーサプレッサーのスクリーニング

注:標準酢酸リチウム法27に従って、S.ポンベcDNAライブラリをクエリS.ポンベell1Δ株にいくつかの変更を加えて変換しました。

  1. S. pombe ell1Δ株を、アデニン、ロイシン、ウラシルをそれぞれ225 μg/mL添加したYE培地(表1)プレート上で32°Cで増殖させます。上記のプレートからのell1Δ株の接種材料でいっぱいのループを、アデニン、ロイシン、およびウラシルをそれぞれ225 μg / mLを添加した15〜20 mLのYE培地に接種します。振とう(200-250rpm)しながら32°Cで一晩インキュベートします。
  2. 翌日、100 mLの新鮮なYE培地で一晩培養液を目的のサプリメントでOD 600 nm(600 nmでの光学密度)が0.3になるように希釈し、OD600 nm が中期対数期に達するまで200〜250 rpmで振とうしながら32°Cでインキュベートします。
  3. 100 mLの培養液を2本の50 mL遠沈管に分割し、室温で4,000 × gで10分間遠心分離します。
  4. 上清を捨て、細胞ペレットを1 mLの滅菌水で洗浄する、すなわち細胞を1 mLの滅菌水に再懸濁し、室温で5分間4,000 × g で遠心分離する。
  5. 上清を廃棄し、ステップ1.4に記載されているように、1 mLの1x LiAc-TE(100 mM酢酸リチウム、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5)溶液で各細胞ペレットを洗浄します。
  6. 上清を除去し、各細胞ペレットを250 μLの1x LiAc-TEに再懸濁します。これらの S.ポンベ コンピテントセル(500 μL)を使用して、目的のDNAで形質転換します。125 μLのコンピテントセルを4つの異なる滅菌マイクロ遠心チューブに移し、後続の形質転換ステップを行います。
  7. サーモン精巣またはニシン精子からのキャリアDNAを1分間煮沸し、すぐに氷の上に置きます。形質転換ごとに、125 μLのコンピテントセルを含むマイクロ遠心チューブに10 μLの10 mg/mL変性一本鎖キャリアDNAを加え、マイクロピペットチップを使用して穏やかに混合します。続いて、50 μgの S. pombe cDNAライブラリをコンピテントセルキャリアDNA混合物含有微量遠心チューブに加えます。
  8. マイクロ遠心チューブを室温で10分間インキュベートし、260 μLのポリエチレングリコール-酢酸リチウム溶液(40%[w/v] PEG 4,000、100 mM酢酸リチウム、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.5)をチューブに加え、マイクロピペットチップを使用して穏やかに混合します。
  9. 形質転換混合物を含む微量遠心チューブを振とうせずに32°Cで2時間インキュベートします。43 μLの予熱ジメチルスルホキシド(DMSO)をマイクロ遠心チューブに加え、穏やかに混合します。続いて、チューブを42°Cで5分間ヒートショックにさらします。
  10. 細胞を4,000 × g で室温で5分間ペレット化します。上清を廃棄し、マイクロピペットチップを使用して残留PEG-LiAc-TE溶液を除去します。
  11. 細胞を100 μLの滅菌水に再懸濁し、必要なサプリメントと0.2 μg/mLの4-NQOを含む1枚のEMM2(表1)プレート(150 mm)にプレートします。
  12. プレートを32°Cで5〜6日間インキュベートして、コロニーがプレート上に現れるようにします。得られたコロニーを0.2 μg/mLの4-NQOの存在下で同じ培地プレート上にストリークし、さらなるスクリーニングに使用します。
  13. 1回のライブラリー形質転換実験では、上記のステップ1.8から1.14で説明されている形質転換に、500 μLのコンピテントセル(125 μLのコンピテントセルx 4本のマイクロ遠心チューブ)を使用します。
  14. 対照として、1/10番目の 形質転換混合物を必要なサプリメントを有するが4-NQOを欠く1枚のEMM2プレート(150mm)上に、ライブラリーの形質転換後に得られたライブラリークローンの総数を計算し、サプレッサークローンの単離をスクリーニングした。

2.推定サプレッサーによるクエリ変異株に関連する表現型のレスキュー/抑制をテストおよび検証します

注:ストレススポットアッセイは、推定サプレッサーによる ell1 欠失関連4-NQOストレス感受性のレスキュー/抑制をテストおよび検証するために、以下のように実施されました。

  1. 滅菌96ウェルマイクロタイタープレートの異なるウェルのそれぞれに100〜200μLの滅菌水を追加します。
  2. 滅菌爪楊枝または20-200 μLのマイクロピペットチップを使用して、4-NQOを含むプレート上のcDNAライブラリ変換後に得られた異なるコロニーのそれぞれから少量の接種材料をピックします。異なるコロニーのそれぞれからの接種材料を、100〜200μLの滅菌水を含むマイクロタイタープレートの別々の独立したウェルに追加します。よく混ぜます。
  3. 各ウェルからの細胞懸濁液3 μLを、アデニン(225 μg/mL)とウラシル(225 μg/mL)を含むEMM2寒天プレートにスポットしますが、ロイシン(この研究で使用したライブラリの構築に使用したプラスミドベクターに存在する選択可能な栄養要求性マーカー)がありません。必要に応じて、適切な濃度の4-NQOをプレートに追加します。
  4. プレートを32°Cで3〜4日間インキュベートして、細胞を増殖させます。推定サプレッサーとして、異なる濃度の4-NQOの存在下で増殖を示すコロニーを特定します。
  5. サプレッサーをさらに検証するには、選択したサプレッサーを適切なコントロール株とともに、アデニンとウラシルのそれぞれ225 μg / mLを含むがロイシンを含まないEMM2培地で振とう(200〜250 rpm)しながら32°Cで一晩増殖させます。
  6. 翌日、新鮮なEMM2培地で細胞をOD 600 nmに希釈し、中期対数期(約OD600 nmの0.6-0.8)まで振とうしながら32°Cで増殖させます。
  7. EMM2プレート上で培養物の適切な段階希釈(1:10または1:5)を、0.4 μM 4-NQOまたは0.01% MMSを含む必要なサプリメントで見つけます。対照のために、必要なサプリメントを含むEMM2プレート上の菌株を見つけますが、DNA損傷剤はありません。
  8. プレートを32°Cで3〜5日間インキュベートして、成長を監視します。
    注:クエリ変異株に関連する表現型に基づく適切なアッセイを使用して、表現型のレスキューまたは抑制をテストする必要があります。例えば、クエリ変異株の低温感受性表現型のサプレッサーを同定する必要がある場合、サプレッサークローンの試験および検証のためのアッセイは、低温で形質転換体を増殖させることを含むであろう。
  9. 目的の完全長遺伝子(この場合はSpell1 )または空のベクターで形質転換された変異株を、ライブラリー形質転換体とともに、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして見つけます。

3. S.ポンベ サプレッサークローンからのプラスミドの単離

注: S. pombe からのプラスミド単離は、分裂酵母:いくつかの変更を加えた実験マニュアル28 に記載されているプロトコルに従って実施しました。

  1. 225 μg/mLのアデニンとウラシルを含むEMM2培地に単一の酵母コロニーを接種し、200〜250 rpmで振とうしながら32°Cで一晩細胞を増殖させます。翌日、室温で4,000 × g で2分間遠心分離することにより、5 O.D.細胞(すなわち、O.D.0.5の10 mL培養物)を回収します。
  2. 上清を除去し、細胞ペレットを0.2 mLの溶解バッファー(2% Triton X-100、1% SDS、100 mM NaCl、10 mM Tris HCl(pH 8.0)、および1 mM Na2EDTA)に再懸濁します。
  3. 0.2 mLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)と0.3 gの酸洗浄ガラスビーズをマイクロ遠心チューブに加えます。マイクロ遠心チューブを4°Cで2分間ボルテックスし、氷上で1分間インキュベートします。この手順を6回繰り返します。
  4. チューブを10,000 × g で室温で15分間遠心分離します。上部の水層を新しい微量遠心チューブに移し、200 μLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を加えます。
  5. チューブを10,000 × g で10分間遠心分離します。上部水層を新しいチューブに移し、2倍量の100%エタノール(~400 μL)と1/10容量の酢酸ナトリウム(3 M、pH 5.8)(~20 μL)をチューブに加えます。微量遠心チューブを-70°Cで1時間インキュベートします。
  6. 10,000 × g で4°Cで15分間遠心分離してDNAを沈殿させ、上清を除去します。DNAペレットを70%エタノール(~500 μL)で洗浄し、室温で風乾します。
  7. DNAを20 μLの滅菌水に再懸濁します。2〜5 μLのプラスミドDNAを使用して、有能な 大腸菌 細胞を形質転換します。
    注:プラスミドは、市販の酵母プラスミド単離キットのいずれかを使用して酵母細胞から単離することもできます。

4. サプレッサークローンがコードする遺伝子の同定

  1. 単離した酵母プラスミドを、標準プロトコル29を用いて大腸菌Top10株[F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG]に形質転換し、必要な抗生物質を含むLB(ルリアブロス)プレート上に細胞を広げます。
  2. 標準的なアルカリ溶解プロトコル29を使用して大腸菌形質転換体からプラスミドを単離し、制限酵素の適切な組み合わせに従って、制限酵素によるインサートDNA断片の放出を確認します。
    注:サプレッサープラスミド84は BamHI制限酵素で消化され、サプレッサープラスミド104は PstI / BamHI制限酵素で消化されました。
  3. ell1Δ株の制限消化後にインサート放出を示すプラスミドを再形質転換して、ell1Δ株の遺伝毒性ストレス感受性表現型を救済する能力を確認します。
  4. 遺伝毒性ストレス感受性の抑制を示すプラスミドクローンを選択し、ベクター特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いてこれらのプラスミドクローンに存在するインサートDNA断片を配列決定する。
    注:本研究では、 adh1 プロモーター特異的ユニバーサルフォワードプライマー(5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')30を用いた。
  5. 抑制の原因となる遺伝子を特定するには、NCBIヌクレオチドブラスト(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch)またはポン塩基配列アラインメントツール(https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core)を使用して得られた配列をアラインメントします。最大アライメントを示す配列を選択し、マルチコピーサプレッサープラスミドの遺伝子として同定します。

結果

S. pombeにおけるell1欠失関連遺伝毒性ストレス感受性のマルチコピー抑制因子のスクリーニング
上記のプロトコルを用いて遺伝子スクリーニングを行い、クエリell1欠失変異株の機能喪失表現型のマルチコピー抑制因子を同定した。4-NQO遺伝毒性物質の存在下で観察されたell1欠失株の成長関連感受性は、マルチコ?...

ディスカッション

酵母は、真核生物全体で進化的に保存されている基本的な生物学的プロセスと経路を調査するために広く使用されています。遺伝学的およびゲノム的ツールの利用可能性と、さまざまな生化学的、遺伝的、および分子的手順へのそれらの快適さにより、酵母は遺伝子研究のための優れたモデル生物になります34,35,36。長年?...

開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

この研究は、インド政府のバイオテクノロジー省からの研究助成金によって資金提供されました(助成金番号。BT / PR12568 / BRB / 10/1369/2015)からニミシャシャルマへ。著者らは、 S. pombe cDNAライブラリーの寄贈についてチャールズ・ホフマン教授(米国ボストン大学)と酵母プラスミドを提供してくれたスーザン・フォースバーグ教授に感謝の意を表した。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4-NQOSigmaN8141
Acetic Acid, glacialSigma1371301000
Adenine SulphateHimediaGRM033
AgarHimediaGRM026
AgaroseLonza50004L
Ammonium ChlorideHimediaMB054
BamHIFermentasER0051
BiotinHimediaRM095
Boric AcidHimediaMB007
Calcium Chloride SigmaC4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1SigmaC0549
Citric AcidHimediaRM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrousHimediaGRM3960
single stranded DNA from Salmon testesSigmaD7656
EDTA disodiumSigma324503
Ferric Chloride HexahydrateHimediaRM6353
GlucoseAmresco188
IonositolHimediaGRM102
IsopropanolQualigenQ26897
LeucineHimediaGRM054
Lithium AcetataeSigma517992
Magnesium Chloride HexahydrateHimediaMB040
Molybdic AcidHimediaRM690
Nicotinic AcidHimediaCMS177
PEG, MW 4000Sigma81240
Pentothinic AcidHimediaTC159
PhenolHimediaMB082
Plasmid Extraction KitQiagen27104
Potassium ChlorideSigmaP9541
Potassium hydrogen PthallateMercDDD7D670815
Potassium iodideHimediaRM1086
RNAseFermentasEN0531
SDSHimediaGRM205
Sodium HydroxideHimediaGRM1183
Sodium SulphateHimediaRM1037
Tris free BaseHimediaMB209
UracilHimediaGRM264
Yeast Extract PowderHimediaRM668
Zinc Sulphate HeptahydrateMercDJ9D692580

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