JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تصف هذه المقالة تقنية لتقسيم العظام الصدغية البشرية السريعة التي تستخدم منشارا دقيقا مع شفرات الماس المزدوجة لتوليد شرائح رقيقة لإزالة الكلس السريع وتحليل الكيمياء المناعية للعظام الصدغية.

Abstract

يعد التحليل النسيجي المرضي لأقسام العظام الصدغية البشرية تقنية أساسية لدراسة أمراض الأذن الداخلية والوسطى. يتم تحضير أقسام العظام الصدغية عن طريق حصاد العظام الصدغي بعد الوفاة ، والتثبيت ، وإزالة الكلس ، والتضمين ، والتلطيخ. نظرا لكثافة العظم الصدغي ، فإن إزالة الكلس هي عملية تستغرق وقتا طويلا وكثيفة الاستخدام للموارد. قد يستغرق إعداد الأنسجة الكامل 9-10 أشهر في المتوسط. هذا يبطئ أبحاث أمراض الأذن ويعيق الدراسات الحساسة للوقت ، مثل تلك المتعلقة بجائحة COVID-19. تصف هذه الورقة تقنية للتحضير السريع وإزالة الكلس من أقسام العظام الصدغية لتسريع معالجة الأنسجة.

تم حصاد العظام الصدغية بعد الوفاة باستخدام التقنيات القياسية وتثبيتها في الفورمالين بنسبة 10٪. تم استخدام منشار دقيق مع شفرات الماس المزدوجة لقطع كل قسم إلى ثلاثة أقسام سميكة. ثم تم إزالة الكلس من أقسام العظام الصدغية السميكة في محلول إزالة الكلس لمدة 7-10 أيام قبل أن يتم تضمينها في البارافين ، وتقسيمها إلى أقسام رقيقة (10 ميكرومتر) باستخدام التبريد ، وتركيبها على شرائح غير مشحونة. ثم تم إزالة عينات الأنسجة وإعادة ترطيبها لتلطيخ الأجسام المضادة (ACE2 و TMPRSS2 و Furin) وتصويرها. خفضت هذه التقنية الوقت من الحصاد إلى تحليل الأنسجة من 9-10 أشهر إلى 10-14 يوما. قد يزيد تقسيم العظام الصدغي عالي السرعة من سرعة أبحاث أمراض الأذن ويقلل من الموارد اللازمة لإعداد الأنسجة ، مع تسهيل الدراسات الحساسة للوقت مثل تلك المتعلقة ب COVID-19.

Introduction

توفر أبحاث العظام الصدغية البشرية موردا لا يقدر بثمن لدراسة علم الأمراض والفيزيولوجيا المرضية للأذن الداخلية والوسطى. قبل القرن التاسع عشر ، لم يكن يعرف سوى القليل عن مرض الأذن1،2،3. لفهم مرض الأذن بشكل أفضل و "إنقاذ الجراحة السمعية من أيدي الدجالين" ، طور جوزيف توينبي (1815-1866) طرقا لدراسة الأقسام النسيجية للعظم الصدغي البشري3. تم تعزيز هذا العمل من قبل آدم بوليتزر (1835-1920) في فيينا وغيرها في جميع أنحاء أوروبا خلال الفترة المتبقية من القرن التاسع عشر ، الذي استخدم أقسام العظام الصدغية لوصف الأنسجة المرضية للعديد من الحالات الشائعة التي تؤثر على الأذن2،3،4.

تم افتتاح أول مختبر للعظام الصدغية البشرية في الولايات المتحدة في عام 1927 في مستشفى جونز هوبكنز ، حيث طورت نقابة ستايسي (1890-1966) طرقا لتقسيم العظام الصدغية 5,6. تألفت الطرق التي طورتها النقابة من عملية مدتها 9-10 أشهر شملت حصاد ما بعد الوفاة ، والتثبيت ، وإزالة الكلس في حمض النيتريك ، والجفاف في الإيثانول ، وتضمين السيلويدين ، والتقسيم ، والتلطيخ ، والتركيب. تم إجراء تعديلات على هذه التقنية في وقت لاحق من قبل هارولد شوكنخت (1917-1996)7. ومع ذلك، فإن المكونات الأساسية لهذه العملية لا تزال دون تغيير جوهري.

شكلت الموارد الكبيرة اللازمة للحفاظ على مختبر العظام الصدغي تحديا لأبحاث العظام الصدغية ومن المحتمل أن تسهم في انخفاض شعبيتها على مدى السنوات ال 30 الماضية 4,8. يجب تخصيص جزء كبير من موارد مختبر العظام الصدغي لعملية إعداد العظام الصدغية لمدة 9-10 أشهر. واحدة من أكثر الخطوات التي تستغرق وقتا طويلا في التحضير هي إزالة الكلس من العظم الصدغي ، وهو أكثر العظام كثافة في جسم الإنسان. عادة ما يتم إجراء إزالة الكلس في حمض النيتريك أو حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) ويستغرق أسابيع إلى أشهر بينما يتطلب التغيير المتكرر للمحاليل 7,9. علاوة على ذلك ، قد تعوق عملية التحضير البطيئة هذه الدراسات الحساسة للوقت للأذن البشرية ، مثل تلك المتعلقة بجائحة COVID-19. تصف هذه الورقة تقنية لتقسيم العظام الصدغية عالية السرعة تستخدم منشارا دقيقا من الماس لتوليد أقسام سميكة تسمح بإزالة الكلس السريع وتحليل الأنسجة في غضون 10-14 يوما من حصاد العظام الصدغي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم تطوير هذا البروتوكول بموافقة IRB (IRB00250002) ووفقا للسياسات المؤسسية لاستخدام الأنسجة البشرية والمواد المعدية. قدم كل متبرع بالعظام الصدغية موافقة خطية قبل الوفاة، أو تم الحصول على الموافقة بعد وفاته من عائلة المتبرع. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. حصاد العظام الزمنية

  1. الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية المحلية (IRB) ، ومراجعة السياسات المؤسسية لاستخدام المواد البشرية والمعدية ، والحصول على موافقة للتبرع بالأنسجة قبل استخدام هذا البروتوكول.
  2. ضع معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) قبل العمل مع الأنسجة من المتبرعين بالعظام الصدغية المصابين ب COVID-19. تأكد من أن معدات الوقاية الشخصية تتكون من جهاز تنفس N-95 ودرع للوجه (أو بدلا من ذلك نظام تنقية الهواء بضغط إيجابي) ، وثوب ، وزوجين من القفازات. راجع تقنيات ارتداء معدات الوقاية الشخصية والتخلص منها بشكل صحيح قبل البدء في هذا البروتوكول10.
  3. حصاد أنسجة العظام الصدغية في غضون 12-24 ساعة من وفاة المتبرع. إذا لم يتم تبريد الجسم ، فتأكد من أن الحصاد يحدث في غضون 8 ساعات من الوفاة.
    1. حصاد العظام الصدغية أثناء تشريح الجثة باستخدام طريقة الشق الرباعي ، الكتلة بواسطة osteotome7.
      1. بعد بضع القحف ، قم بإزالة الدماغ وتقسيم الأعصاب القحفية إلى القناة السمعية الداخلية بشكل حاد.
      2. قم بعمل أول شق عظمي باستخدام العظم العظمي الموازي والإنسي للجزء الحرشفي من العظم الصدغي.
      3. قم بإجراء الشق العظمي الثاني بالتوازي مع الأول عند الحدود الإنسية للعظم الصدغي.
      4. ثم ، اجعل الشق الثالث 3-4 سم أماميا وموازيا للتلال الصخرية.
      5. اجعل الشق الرابع موازيا تقريبا للشق الثالث ، 2 سم الخلفي إلى التلال الصخرية.
        ملاحظة: تأكد من أن جميع الشقوق تمتد عبر قاعدة الجمجمة.
      6. ثم قم بإزالة العظم الصدغي باستخدام تشريح حاد لتحرير مرفق الأنسجة الرخوة على طول الحافة السفلية للعينة. إذا كان من المقرر إجراء التحنيط بعد حصاد العظام الصدغي ، فقم بربط جذع الشريان السباتي.

2. تثبيت الأنسجة ، وإزالة الكلس ، والتقسيم

  1. ضع الأنسجة على الفور في 200-300 مل من الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪ (الفورمالديهايد) بحيث يتم غمر الأنسجة بالكامل. اترك الأنسجة في الفورمالديهايد لمدة لا تقل عن 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، مع تغيير المحاليل يوميا. قم بتخزين الأنسجة في حاوية محكمة الإغلاق وقم بإجراء تغييرات في المحلول تحت غطاء الدخان أثناء ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة لمنع انتشار الفيروس.
    ملاحظة: بعد فترة التثبيت البالغة 72 ساعة، لم تعد هناك حاجة إلى اعتبار العينات معدية.
  2. استخدم منشارا دقيقا مع شفرات ماسية مزدوجة لقطع كل عينة إلى ثلاثة أقسام "سميكة" للسماح بإزالة كلس الأنسجة بسرعة أكبر. اضبط شفرات الماس المزدوجة على مسافة 5 مم ، بحيث يكون القسم المركزي من العظم الصدغي بسمك 5 مم. تأكد من أن أقسام الأنسجة على كلا الطرفين بسماكة 3-5 مم.
  3. ضع المقاطع السميكة في 200-300 مل من محلول إزالة الكلس من حمض الفورميك بنسبة 23٪ واط لمدة 7-10 أيام في درجة حرارة الغرفة ، حتى يصبح النسيج ناعما بما يكفي لتضمين البارافين. تغيير الحلول يوميا. تحقق من إزالة كلس الأنسجة بشكل كاف عن طريق ملامسة العينة ، والتي يجب أن تشعر بالنعومة.
    ملاحظة: يمكن أيضا التحقق من إزالة الكلس عن طريق الأشعة السينية.
  4. شطف العينات في مياه الصنبور الجارية لمدة 24 ساعة عن طريق وضعها في كوب كبير تحت صنبور الجري.
  5. تجفيف الأنسجة في سلسلة من الكحوليات ذات التركيز المتزايد7. غمر الأنسجة في 100-200 مل من الإيثانول 70 ٪ لمدة 1.5 ساعة ، تليها ثلاث غسلات في 95 ٪ و 100 ٪ الإيثانول لمدة 1.5 ساعة لكل منهما ، على التوالي. بعد ذلك ، اغسل المنديل 3 × 1.5 ساعة في الزيلين.
  6. قم بتضمين الأقسام السميكة في البارافين ، مع أربعة علاجات لمدة 45 دقيقة لكل منها.
  7. استخدم المبرد لقطع مقاطع رقيقة (10 ميكرومتر). ضع الأنسجة بحيث يتم قطع الأنسجة في المستوى المحوري. قطع أقسام أكثر سمكا (20 ميكرومتر) إذا رغبت في ذلك.

3. الكيمياء النسيجية المناعية والتصوير

  1. إذا كان تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين التقليدي مطلوبا (غير موضح هنا) ، فقم بإجراء التلطيخ قبل تركيب الأقسام على الشرائح الزجاجية7.
  2. قم بتركيب الأقسام على شرائح زجاجية مشحونة إيجابيا.
  3. تخبز الشرائح على طبق ساخن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. ضع الشرائح في حامل واغمرها في محلول تجاري للمعالجة المسبقة يحتوي على مذيب عضوي (ديثانولامين في هذه الحالة) والإيثانول لإزالة البارافينات وإعادة الترطيب وكشف النقاب عن الأنسجة.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لتحقيق نتائج مرضية مع الكيمياء النسيجية المناعية للأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين.
  5. سخني الشرائح في قدر ضغط على ضغط عال لمدة 20 دقيقة.
  6. ضع الشرائح في غرفة رطبة وقم بسد الأنسجة بمحلول حجب تجاري.
  7. قم بفحص أقسام الأنسجة باستخدام الجسم المضاد الأساسي ضد الإنزيم المحول للأنجيوتنسين 2 (ACE2 ؛ 1:50) ، وسيرين البروتياز عبر الغشاء 2 (TMPRSS2 ، 1: 1000) ، وبروتياز فورين (1: 250).
    ملاحظة: يتم استخدام الأجسام المضادة ACE2 و TMPRSS2 و Furin لأنه يعتقد أن هذه البروتينات تلعب دورا في عدوى SARS-CoV-2 11,12 ، وسعى هذا البروتوكول إلى التحقيق في الآليات المحتملة التي قد يصيب بها SARS-CoV-2 الأذن الوسطى 13.
  8. علاج مع HRP المقترنة الجسم المضاد الثانوي للأرانب (ACE2 ، فورين ؛ تخفيف 1:100) أو مضاد الماعز (TMPRSS2 ، 1:100 تخفيف) الأجسام المضادة الثانوية.
  9. قم بتلطيخ الشرائح بنسبة 70٪ من الهيماتوكسيلين في الماء.
  10. احصل على صور على مجهر ضوئي باستخدام كاميرا رقمية مثبتة. احصل على صور للغشاء المخاطي للأذن الوسطى وأنبوب استاكيوس عند تكبير 20x و 10x ، على التوالي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين في الغشاء المخاطي للأذن الوسطى وأنبوب استاكيوس الحفاظ على الغشاء المخاطي للأذن الوسطى وأنسجة الأذن الوسطى تحت المخاطية بعد المعالجة (الشكل 1). أظهرت الصور الكيميائية النسيجية المناعية تعبيرا عن بروتينات ACE2 و TMPRSS2 و Furin داخل الغشاء المخ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تعد أبحاث العظام الصدغية البشرية أمرا بالغ الأهمية لدراسة أمراض الأذن الداخلية والوسطى ولكنها تظل مسعى كثيف الوقت والموارد. تصف هذه الورقة تقنية تستخدم المنشار الدقيق الماسي لتوليد أقسام عظمية صدغية سميكة يمكن إزالتها بسرعة قبل مزيد من التقسيم بحيث يمكن تقليل الوقت من حصاد الأنسجة إلى ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgements

ونشكر محمد ليهار على مساعدته في هذا المشروع. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (T32DC000027 ، NSA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution)Novus BiologicalsSN0754
Anti-Furin Antibody (1:250 dilution)AbcamEPR 14674
Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution)Novus BiologicalsNBP1-20984
BX43 Manual System MicroscopeOlympus Life Science Solutions
CBN/Diamond Hybrid Wafering BladePace TechnologiesWB-007GP
Collin Mallet - 8''Surgical MartSM1517
DS-Fi3 Microscope CameraNikon
Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution)DakoS2003
Eaosin StainSigma-Aldrich548-24-3
Formalin solution, neutral buffered 10%Sigma-AldrichHT501128
Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution)StatLab1214-1 GAL
Hematoxylin StainSigma-AldrichH9627
HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution)Leica BiosystemsPV6119
ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution)Vector LaboratoriesMP-7405
Lambotte OsteotomeSurgical MartSM1553
Metallographic PICO 155P Precision SawPace TechnologiesPICO 155Pmicrosaw
NIS Elements Software Version 4.6Nikon
Paraplast PlusSigma-AldrichP3683paraffin
Positive Charged Microscope Slides with White Frosted EndWalter Products1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat MicrotomeNew Life Scientific Inc.A78900104cryotome
Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution)Sigma-Aldrich920P-05
XyleneSigma-Aldrich920P-05

References

  1. Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
  2. Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
  3. Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
  4. Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
  5. Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480(1934).
  6. Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
  7. Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).
  8. Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
  9. Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal Bone. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).
  10. COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022).
  11. Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822(2022).
  12. Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
  13. Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
  14. Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
  15. Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113(2021).
  16. McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
  17. Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
  18. Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
  19. Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved