JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalede, temporal kemik immünohistokimyasının hızlı dekalsifikasyonu ve analizi için ince dilimler oluşturmak üzere ikiz elmas bıçaklı bir mikro testere kullanan hızlı insan temporal kemik kesitleme tekniği açıklanmaktadır.

Özet

İnsan temporal kemik kesitlerinin histopatolojik analizi, iç ve orta kulak patolojisini incelemek için temel bir tekniktir. Temporal kemik kesitleri postmortem temporal kemik hasadı, fiksasyon, dekalsifikasyon, gömme ve boyama ile hazırlanır. Temporal kemiğin yoğunluğu nedeniyle, dekalsifikasyon zaman alıcı ve kaynak yoğun bir işlemdir; tam doku hazırlığı ortalama 9-10 ay sürebilir. Bu, otopatoloji araştırmalarını yavaşlatır ve COVID-19 pandemisiyle ilgili olanlar gibi zamana duyarlı çalışmaları engeller. Bu yazıda, doku işlemeyi hızlandırmak için temporal kemik kesitlerinin hızlı hazırlanması ve kireçlenmesi için bir teknik anlatılmaktadır.

Temporal kemikler standart teknikler kullanılarak postmortem olarak toplandı ve% 10 formalin ile sabitlendi. Her bölümü üç kalın bölüme ayırmak için ikiz elmas bıçaklı hassas bir mikro testere kullanıldı. Kalın temporal kemik kesitleri daha sonra parafine gömülmeden önce 7-10 gün boyunca kireç çözücü çözeltide dekalsifiye edildi, bir kriyotom kullanılarak ince (10 μm) bölümlere ayrıldı ve yüksüz slaytlara monte edildi. Doku örnekleri daha sonra deparafinize edildi ve antikor boyama (ACE2, TMPRSS2, Furin) için rehidre edildi ve görüntülendi. Bu teknik, hasattan doku analizine kadar geçen süreyi 9-10 aydan 10-14 güne indirdi. Yüksek hızlı temporal kemik kesitleme, otopatoloji araştırmalarının hızını artırabilir ve doku hazırlığı için gerekli kaynakları azaltabilirken, COVID-19 ile ilgili olanlar gibi zamana duyarlı çalışmaları da kolaylaştırabilir.

Giriş

İnsan temporal kemik araştırması, iç ve orta kulağın patolojisini ve patofizyolojisini incelemek için paha biçilmez bir kaynak sağlar. 19. yüzyıldan önce, otolojik hastalık 1,2,3 hakkında çok az şey biliniyordu. Otolojik hastalığı daha iyi anlamak ve "işitsel cerrahiyi şarlatanların elinden kurtarmak" için Joseph Toynbee (1815-1866), insan temporal kemiğinin histolojik bölümlerini incelemek için yöntemler geliştirdi3. Bu çalışma, Viyana'da ve 19. yüzyılın geri kalanında Avrupa'daki diğer kişilerde Adam Politzer (1835-1920) tarafından ilerletildi ve kulak 2,3,4'ü etkileyen birçok yaygın durumun histopatolojisini tanımlamak için temporal kemik kesitlerini kullandı.

Amerika Birleşik Devletleri'ndeki ilk insan temporal kemik laboratuvarı, Stacy Guild'in (1890-1966)temporal kemik kesiti 5,6 için yöntemler geliştirdiği Johns Hopkins Hastanesi'nde 1927'de açıldı. Guild tarafından geliştirilen yöntemler, ölüm sonrası hasat, fiksasyon, nitrik asitte kireçlenme, etanolde dehidrasyon, celloidin gömme, kesitleme, boyama ve montajı içeren 9-10 aylık bir süreçten oluşuyordu. Bu teknikte değişiklikler daha sonra Harold Schuknecht (1917-1996)7 tarafından yapılmıştır; Bununla birlikte, bu sürecin temel bileşenleri esasen değişmeden kalır.

Bir temporal kemik laboratuvarını sürdürmek için gereken önemli kaynaklar, temporal kemik araştırması için bir zorluk oluşturmuş ve muhtemelen son 30 yılda azalan popülaritesine katkıda bulunmuştur 4,8. Temporal kemik laboratuar kaynaklarının önemli bir kısmı 9-10 aylık temporal kemik preparasyonu sürecine ayrılmalıdır. Hazırlıkta en çok zaman alan adımlardan biri, insan vücudundaki en yoğun kemik olan temporal kemiğin kireçlenmesidir. Dekalsifikasyon tipik olarak nitrik asit veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içinde gerçekleştirilir ve çözeltilerin sık sık değiştirilmesini gerektirirken haftalar ila aylar sürer 7,9. Ayrıca, COVID-19 pandemisi ile ilgili olanlar gibi insan kulağının zamana duyarlı çalışmaları, bu yavaş hazırlık süreci tarafından engellenebilir. Bu yazıda, temporal kemik hasadından sonraki 10-14 gün içinde hızlı dekalsifikasyon ve doku analizine izin veren kalın kesitler oluşturmak için elmas mikro testere kullanan yüksek hızlı temporal kemik kesitleme tekniği açıklanmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokol IRB (IRB00250002) onayı ile ve insan dokusu ve enfeksiyöz materyal kullanımına yönelik kurumsal politikalara uygun olarak geliştirilmiştir. Her temporal kemik donörü ölümden önce yazılı onay verdi veya doğumdan sonra donörün ailesinden onay alındı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Temporal kemik hasadı

  1. Bu protokolü kullanmadan önce yerel kurumsal inceleme kurulu (IRB) kurulu onayını alın, insan ve bulaşıcı materyallerin kullanımı için kurumsal politikaları gözden geçirin ve doku bağışı için onay alın.
  2. COVID-19 pozitif temporal kemik bağışçılarından gelen dokularla çalışmadan önce uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) takın. KKD'nin bir N-95 solunum cihazı ve yüz siperliği (veya alternatif olarak pozitif basınçlı hava temizleme sistemi), önlük ve iki çift eldivenden oluştuğundan emin olun. Bu protokole başlamadan önce KKD'yi düzgün bir şekilde takma ve çıkarma tekniklerini gözden geçirin10.
  3. Donör ölümünden sonraki 12-24 saat içinde temporal kemik dokusunu toplayın. Vücut soğutulmamışsa, hasatın ölümden sonraki 8 saat içinde gerçekleştiğinden emin olun.
    1. Otopsi sırasında osteotom7 ile dört kesi, blok yöntemi kullanılarak temporal kemiklerin toplanması.
      1. Kraniotomiden sonra, beyni çıkarın ve kraniyal sinirleri iç işitsel kanala keskin bir şekilde bölün.
      2. Osteotom ile ilk kemik insizyonunu temporal kemiğin skuamöz kısmına paralel ve sadece medial yapın.
      3. İkinci kemik kesisini temporal kemiğin medial sınırında birincisine paralel olarak yapın.
      4. Ardından, üçüncü kesiyi 3-4 cm ön ve petroz sırtına paralel yapın.
      5. Dördüncü insizyonu kabaca üçüncüye paralel, petroz sırtına 2 cm posterior yapın.
        NOT: Tüm insizyonların kafatası tabanından uzandığından emin olun.
      6. Daha sonra, numunenin alt kenarı boyunca yumuşak doku ekini serbest bırakmak için keskin diseksiyon kullanarak temporal kemiği çıkarın. Mumyalama temporal kemik hasadını takiben yapılacaksa, karotis arterin kütüğünü bağlayın.

2. Doku fiksasyonu, kireçlenme ve kesitleme

  1. Dokuyu derhal 200-300 mL% 10 tamponlu formalin (formaldehit) içine yerleştirin, böylece doku tamamen suya batırılır. Dokuyu oda sıcaklığında en az 72 saat formaldehit içinde bırakın ve çözeltileri günlük olarak değiştirin. Dokuyu hava geçirmez bir kapta saklayın ve virüsün yayılmasını önlemek için uygun KKD giyerken bir duman başlığı altında çözelti değişiklikleri yapın.
    NOT: 72 saatlik fiksasyon periyodunu takiben, örneklerin artık bulaşıcı olarak kabul edilmesine gerek yoktur.
  2. Daha hızlı doku kireçlenmesine izin vermek için her bir numuneyi üç "kalın" bölüme ayırmak için ikiz elmas bıçaklı hassas bir mikro testere kullanın. İkiz elmas bıçakları 5 mm'lik bir mesafeye ayarlayın, böylece temporal kemiğin orta kısmı 5 mm kalınlığındadır. Her iki uçtaki doku bölümlerinin 3-5 mm kalınlığında olduğundan emin olun.
  3. Kalın kesitleri, doku parafin gömme için yeterince yumuşak olana kadar, oda sıcaklığında 7-10 gün boyunca% 23 w / w formik asit kireç çözücü çözeltinin 200-300 mL'sine yerleştirin. Çözümleri günlük olarak değiştirin. Yumuşak hissetmesi gereken numuneyi palpe ederek yeterli doku dekalsifikasyonunu kontrol edin.
    NOT: Dekalsifikasyon röntgen ile de doğrulanabilir.
  4. Numuneleri, akan musluğun altındaki büyük bir beherin içine yerleştirerek 24 saat boyunca akan musluk suyunda durulayın.
  5. Dokuyu artan konsantrasyonda bir dizi alkolde dehidrateedin 7. Dokuyu 1.5 saat boyunca 100-200 mL% 70 etanol içine batırın, ardından sırasıyla% 95'te üç yıkama ve% 1.5 saat boyunca% 100 etanol ile yıkayın. Daha sonra, dokuyu 3 x 1,5 saat Ksilen içinde yıkayın.
  6. Kalın bölümleri parafine yerleştirin, her biri 45 dakikalık dört işlemle.
  7. İnce (10 μm) bölümleri kesmek için bir kriyotom kullanın. Dokuyu, doku eksenel düzlemde kesilecek şekilde konumlandırın. İsterseniz daha kalın (20 μm) kesitler kesin.

3. İmmünohistokimya ve görüntüleme

  1. Geleneksel hematoksilin ve eozin boyama isteniyorsa (burada tarif edilmemiştir), bölümleri cam slaytlara monte etmeden önce boyamayapın 7.
  2. Bölümleri pozitif yüklü cam slaytlara monte edin.
  3. Kızakları sıcak bir tabakta 60 ° C'de 20 dakika pişirin.
  4. Slaytları bir tutucuya yerleştirin ve dokuyu deparafiniz, rehidratlamak ve maskesini çıkarmak için organik bir çözücü (bu durumda dietanolamin) ve etanol içeren ticari bir ön işlem çözeltisine batırın.
    NOT: Bu adım, formalin ile sabitlenmiş ve parafin gömülü doku için immünohistokimya ile tatmin edici sonuçlar elde etmek için gereklidir.
  5. Kızakları düdüklü tencerede 20 dakika boyunca yüksek basınçta ısıtın.
  6. Slaytları nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin ve dokuyu ticari bir blokaj çözeltisi ile bloke edin.
  7. Primer antikor içeren doku kesitlerini anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE2; 1:50), transmembran proteaz serin 2 (TMPRSS2, 1:1.000) ve Furin proteazına (1:250) karşı araştırın.
    NOT: ACE2, TMPRSS2 ve Furin antikorları kullanılır, çünkü bu proteinlerin SARS-CoV-2 enfeksiyonu11,12'de rol oynadığına inanılmaktadır ve bu protokol SARS-CoV-2'nin orta kulağı enfekte edebileceği olası mekanizmaları araştırmaya çalışmıştır13.
  8. HRP konjuge anti-tavşan sekonder antikoru (ACE2, Furin; 1:100 seyreltme) veya anti-keçi (TMPRSS2, 1:100 seyreltme) sekonder antikoru ile tedavi edin.
  9. Slaytları suda% 70 hematoksilin ile karşı lekeleyin.
  10. Monte edilmiş bir dijital kamera ile ışık mikroskobunda görüntüler elde edin. Orta kulak mukozasının ve östaki tüpünün görüntülerini sırasıyla 20x ve 10x büyütmede elde edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Orta kulak mukozası ve östaki tüpünün hematoksilin ve eozin boyaması, işlem sonrasında orta kulak mukozasının ve submukozal orta kulak dokusunun korunduğunu gösterdi (Şekil 1). İmmünohistokimyasal görüntülerde orta kulak mukozası ve östaki tüpü içinde ACE2, TMPRSS2 ve Furin proteinlerinin ekspresyonu görüldü (Şekil 1). Bu proteinlerin orta kulaktaki varlığı, SARS-CoV-2'nin orta kulaktaki solunum epitelini enfekte edebileceği olası...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

İnsan temporal kemik araştırması, iç ve orta kulak patolojisini incelemek için kritik öneme sahiptir, ancak zaman ve kaynak yoğun bir çaba olmaya devam etmektedir. Bu makalede, daha fazla bölümlemeden önce hızla dekalsifiye edilebilen kalın temporal kemik kesitleri oluşturmak için elmas mikro testere kullanan bir teknik açıklanmaktadır, böylece doku hasadından çalışmaya kadar geçen süre 9-10 aydan 10-14 güne düşürülebilir. Bu teknik, temporal kemik işleme için gereken kaynakları azaltabi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Mohamed Lehar'a bu projedeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32DC000027, NSA) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution)Novus BiologicalsSN0754
Anti-Furin Antibody (1:250 dilution)AbcamEPR 14674
Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution)Novus BiologicalsNBP1-20984
BX43 Manual System MicroscopeOlympus Life Science Solutions
CBN/Diamond Hybrid Wafering BladePace TechnologiesWB-007GP
Collin Mallet - 8''Surgical MartSM1517
DS-Fi3 Microscope CameraNikon
Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution)DakoS2003
Eaosin StainSigma-Aldrich548-24-3
Formalin solution, neutral buffered 10%Sigma-AldrichHT501128
Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution)StatLab1214-1 GAL
Hematoxylin StainSigma-AldrichH9627
HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution)Leica BiosystemsPV6119
ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution)Vector LaboratoriesMP-7405
Lambotte OsteotomeSurgical MartSM1553
Metallographic PICO 155P Precision SawPace TechnologiesPICO 155Pmicrosaw
NIS Elements Software Version 4.6Nikon
Paraplast PlusSigma-AldrichP3683paraffin
Positive Charged Microscope Slides with White Frosted EndWalter Products1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat MicrotomeNew Life Scientific Inc.A78900104cryotome
Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution)Sigma-Aldrich920P-05
XyleneSigma-Aldrich920P-05

Referanslar

  1. Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
  2. Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
  3. Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
  4. Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
  5. Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480(1934).
  6. Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
  7. Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).
  8. Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
  9. Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal Bone. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).
  10. COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022).
  11. Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822(2022).
  12. Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
  13. Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
  14. Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
  15. Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113(2021).
  16. McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
  17. Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
  18. Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
  19. Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır