Sezionamento dell'osso temporale umano ad alta velocità per la valutazione della patologia dell'orecchio medio associata a COVID-19

Riepilogo

Questo articolo descrive una tecnica per il sezionamento rapido dell'osso temporale umano che utilizza una microsega con due dischi diamantati per generare fette sottili per una rapida decalcificazione e analisi dell'immunoistochimica ossea temporale.

Abstract

L'analisi istopatologica delle sezioni ossee temporali umane è una tecnica fondamentale per lo studio della patologia dell'orecchio interno e medio. Le sezioni ossee temporali sono preparate mediante raccolta ossea temporale post-mortem, fissazione, decalcificazione, incorporamento e colorazione. A causa della densità dell'osso temporale, la decalcificazione è un processo che richiede tempo e risorse; la preparazione completa dei tessuti può richiedere in media 9-10 mesi. Ciò rallenta la ricerca otopatologica e ostacola gli studi sensibili al fattore tempo, come quelli rilevanti per la pandemia di COVID-19. Questo documento descrive una tecnica per la rapida preparazione e decalcificazione delle sezioni ossee temporali per accelerare l'elaborazione dei tessuti.

Le ossa temporali sono state raccolte post mortem utilizzando tecniche standard e fissate in formalina al 10%. Una microsega di precisione con due lame diamantate è stata utilizzata per tagliare ogni sezione in tre sezioni spesse. Sezioni ossee temporali spesse sono state poi decalcificate in soluzione decalcificante per 7-10 giorni prima di essere incorporate nella paraffina, sezionate in sezioni sottili (10 μm) usando un criotomo e montate su vetrini non caricati. I campioni di tessuto sono stati quindi deparaffinati e reidratati per la colorazione degli anticorpi (ACE2, TMPRSS2, Furin) e ripresi. Questa tecnica ha ridotto il tempo dalla raccolta all'analisi dei tessuti da 9-10 mesi a 10-14 giorni. Il sezionamento osseo temporale ad alta velocità può aumentare la velocità della ricerca otopatologica e ridurre le risorse necessarie per la preparazione dei tessuti, facilitando al contempo studi sensibili al tempo come quelli relativi a COVID-19.

Introduzione

La ricerca sull'osso temporale umano fornisce una risorsa inestimabile per studiare la patologia e la fisiopatologia dell'orecchio interno e medio. Prima del 19 ° secolo, si sapeva poco per quanto riguarda la malattia^{otologica 1,2,3}. Per comprendere meglio la malattia otologica e "salvare la chirurgia uditiva dalle mani dei ciarlatani", Joseph Toynbee (1815-1866) sviluppò metodi per studiare le sezioni istologiche dell'osso temporale umano³. Questo lavoro è stato promosso da Adam Politzer (1835-1920) a Vienna e altri in tutta Europa durante il resto del 19 ° secolo, che ha usato sezioni ossee temporali per descrivere l'istopatologia di molte condizioni comuni che interessano l'orecchio ^2,3,4.

Il primo laboratorio di ossa temporali umane negli Stati Uniti fu aperto nel 1927 al Johns Hopkins Hospital, dove Stacy Guild (1890-1966) sviluppò metodi per il sezionamento dell'osso temporale ^5,6. I metodi sviluppati da Guild consistevano in un processo di 9-10 mesi che includeva la raccolta post-mortem, la fissazione, la decalcificazione in acido nitrico, la disidratazione in etanolo, l'incorporamento di celloidin, il sezionamento, la colorazione e il montaggio. Le modifiche a questa tecnica furono successivamente apportate da Harold Schuknecht (1917-1996)⁷; tuttavia, le componenti di base di questo processo rimangono sostanzialmente invariate.

Le risorse significative necessarie per mantenere un laboratorio di osso temporale hanno rappresentato una sfida per la ricerca sull'osso temporale e probabilmente hanno contribuito al declino della sua popolarità negli ultimi 30 anni ^4,8. Una parte significativa delle risorse di laboratorio dell'osso temporale deve essere dedicata al processo di 9-10 mesi di preparazione dell'osso temporale. Una delle fasi più dispendiose in termini di tempo nella preparazione è la decalcificazione dell'osso temporale, che è l'osso più denso del corpo umano. La decalcificazione viene tipicamente eseguita in acido nitrico o acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e richiede settimane o mesi mentre richiede il frequente cambio di soluzioni ^7,9. Inoltre, gli studi sensibili al tempo dell'orecchio umano, come quelli relativi alla pandemia di COVID-19, possono essere ostacolati da questo lento processo di preparazione. Questo documento descrive una tecnica per il sezionamento osseo temporale ad alta velocità che utilizza una microsega a diamante per generare sezioni spesse che consentono una rapida decalcificazione e analisi dei tessuti entro 10-14 giorni dalla raccolta dell'osso temporale.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Questo protocollo è stato sviluppato con l'approvazione IRB (IRB00250002) e in conformità con le politiche istituzionali per l'uso di tessuti umani e materiale infettivo. Ogni donatore di ossa temporali ha fornito il consenso scritto prima della morte, o il consenso è stato ottenuto postumo dalla famiglia del donatore. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo.

1. Raccolta ossea temporale

1. Ottenere l'approvazione del consiglio di revisione istituzionale locale (IRB), rivedere le politiche istituzionali per l'uso di materiale umano e infettivo e ottenere il consenso per la donazione di tessuti prima di utilizzare questo protocollo.
2. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) prima di lavorare con tessuti di donatori di ossa temporali covid-19-positivi. Assicurarsi che il DPI sia costituito da un respiratore N-95 e da una visiera (o in alternativa da un sistema di purificazione dell'aria a pressione positiva), un camice e due paia di guanti. Rivedere le tecniche per indossare e togliere correttamente i DPI prima di iniziare questo protocollo¹⁰.
3. Raccogliere il tessuto osseo temporale entro 12-24 ore dalla morte del donatore. Se il corpo non è refrigerato, assicurarsi che la raccolta avvenga entro 8 ore dalla morte.
   1. Raccogliere le ossa temporali durante l'autopsia usando il metodo a quattro incisioni, blocco con osteotoma⁷.
      1. Dopo la craniotomia, rimuovere il cervello e dividere bruscamente i nervi cranici nel canale uditivo interno.
      2. Fare la prima incisione ossea con l'osteotoma parallela e solo mediale alla porzione squamosa dell'osso temporale.
      3. Eseguire la seconda incisione ossea parallela alla prima sul bordo mediale dell'osso temporale.
      4. Quindi, fare la terza incisione 3-4 cm anteriore e parallela alla cresta petrosa.
      5. Fai la quarta incisione approssimativamente parallela alla terza, 2 cm posteriore alla cresta petrosa.
         NOTA: Assicurarsi che tutte le incisioni si estendano attraverso la base del cranio.
      6. Quindi, rimuovere l'osso temporale usando una dissezione acuta per liberare l'attaccamento dei tessuti molli lungo il bordo inferiore del campione. Se l'imbalsamazione deve essere eseguita dopo la raccolta dell'osso temporale, legare il moncone dell'arteria carotide.

2. Fissazione dei tessuti, decalcificazione e sezionamento

1. Posizionare immediatamente il tessuto in 200-300 ml di formalina tamponata al 10% (formaldeide) in modo che il tessuto sia completamente sommerso. Lasciare il tessuto in formaldeide per un minimo di 72 ore a temperatura ambiente, cambiando le soluzioni quotidianamente. Conservare il tessuto in un contenitore ermetico ed eseguire cambi di soluzione sotto una cappa aspirante mentre si indossano DPI appropriati per prevenire la diffusione del virus.
   NOTA: Dopo il periodo di fissazione di 72 ore, i campioni non devono più essere considerati infettivi.
2. Utilizzare una microsega di precisione con due lame diamantate per tagliare ogni campione in tre sezioni "spesse" per consentire una più rapida decalcificazione dei tessuti. Impostare i dischi gemelli diamantati a una distanza di 5 mm, in modo che la sezione centrale dell'osso temporale abbia uno spessore di 5 mm. Assicurarsi che le sezioni di tessuto su entrambe le estremità abbiano uno spessore di 3-5 mm.
3. Posizionare le sezioni spesse in 200-300 ml di soluzione decalcificante di acido formico al 23% p/p per 7-10 giorni a temperatura ambiente, fino a quando il tessuto è abbastanza morbido per l'incorporamento della paraffina. Cambia le soluzioni ogni giorno. Verificare l'adeguata decalcificazione dei tessuti palpando il campione, che dovrebbe sentirsi morbido.
   NOTA: La decalcificazione può anche essere verificata mediante raggi X.
4. Risciacquare i campioni in acqua corrente del rubinetto per 24 ore posizionandoli in un grande becher sotto un rubinetto in esecuzione.
5. Disidratare il tessuto in una serie di alcoli di concentrazione crescente⁷. Immergere il tessuto in 100-200 ml di etanolo al 70% per 1,5 ore, seguito da tre lavaggi rispettivamente al 95% e al 100% di etanolo per 1,5 ore ciascuno. Quindi, lavare il tessuto 3 x 1,5 ore in xilene.
6. Incorporare le sezioni spesse in paraffina, con quattro trattamenti di 45 minuti ciascuno.
7. Utilizzare un criotomo per tagliare sezioni sottili (10 μm). Posizionare il tessuto in modo che il tessuto venga tagliato nel piano assiale. Tagliare sezioni più spesse (20 μm) se lo si desidera.

3. Immunoistochimica e imaging

1. Se si desidera la colorazione tradizionale di ematossilina ed eosina (non descritta qui), eseguire la colorazione prima di montare le sezioni su vetrini⁷.
2. Montare le sezioni su vetrini caricati positivamente.
3. Cuocere i vetrini su una piastra calda a 60 °C per 20 min.
4. Posizionare i vetrini in un supporto e immergerli in una soluzione di pretrattamento commerciale contenente un solvente organico (dietanolamina in questo caso) ed etanolo per deparaffinizzare, reidratare e smascherare il tessuto.
   NOTA: Questo passaggio è necessario per ottenere risultati soddisfacenti con l'immunoistochimica per tessuti fissati con formalina e paraffina.
5. Riscaldare i vetrini in una pentola a pressione ad alta pressione per 20 minuti.
6. Posizionare i vetrini in una camera umidificata e bloccare il tessuto con una soluzione di blocco commerciale.
7. Sondare le sezioni tissutali con l'anticorpo primario contro l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2; 1:50), la proteasi transmembrana 2 (TMPRSS2, 1:1.000) e la proteasi Furin (1:250).
   NOTA: Gli anticorpi ACE2, TMPRSS2 e Furin sono usati perché si ritiene che queste proteine svolgano un ruolo nell'infettività sars-CoV-2^11,12 e questo protocollo ha cercato di studiare i possibili meccanismi con cui SARS-CoV-2 può infettare l'orecchio medio¹³.
8. Trattare con anticorpo secondario anti-coniglio coniugato HRP (ACE2, Furin; diluizione 1:100) o anti-capra (TMPRSS2, diluizione 1:100).
9. Controbattere i vetrini con il 70% di ematossilina in acqua.
10. Acquisisci immagini su un microscopio ottico con una fotocamera digitale montata. Ottenere immagini della mucosa dell'orecchio medio e della tromba di Eustachio rispettivamente con ingrandimento 20x e 10x.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

La colorazione di ematossilina ed eosina della mucosa dell'orecchio medio e della tromba di Eustachio ha mostrato la conservazione della mucosa dell'orecchio medio e del tessuto dell'orecchio medio sottomucoso dopo l'elaborazione (Figura 1). Le immagini immunoistochimiche hanno mostrato l'espressione delle proteine ACE2, TMPRSS2 e Furin all'interno della mucosa dell'orecchio medio e della tromba di Eustachio (Figura 1). La presenza di queste proteine all'interno...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

La ricerca sull'osso temporale umano è fondamentale per lo studio della patologia dell'orecchio interno e medio, ma rimane uno sforzo ad alta intensità di tempo e risorse. Questo documento descrive una tecnica che utilizza una microsega diamanta per generare sezioni ossee temporali spesse che possono essere rapidamente decalcificate prima di ulteriori sezioni in modo che il tempo dalla raccolta dei tessuti allo studio possa essere ridotto da 9-10 mesi a 10-14 giorni. Questa tecnica può ridurre le risorse necessarie pe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution)	Novus Biologicals	SN0754
Anti-Furin Antibody (1:250 dilution)	Abcam	EPR 14674
Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution)	Novus Biologicals	NBP1-20984
BX43 Manual System Microscope	Olympus Life Science Solutions
CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade	Pace Technologies	WB-007GP
Collin Mallet - 8''	Surgical Mart	SM1517
DS-Fi3 Microscope Camera	Nikon
Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution)	Dako	S2003
Eaosin Stain	Sigma-Aldrich	548-24-3
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution)	StatLab	1214-1 GAL
Hematoxylin Stain	Sigma-Aldrich	H9627
HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution)	Leica Biosystems	PV6119
ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution)	Vector Laboratories	MP-7405
Lambotte Osteotome	Surgical Mart	SM1553
Metallographic PICO 155P Precision Saw	Pace Technologies	PICO 155P	microsaw
NIS Elements Software Version 4.6	Nikon
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	paraffin
Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End	Walter Products	1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome	New Life Scientific Inc.	A78900104	cryotome
Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution)	Sigma-Aldrich	920P-05
Xylene	Sigma-Aldrich	920P-05