زعزعة استقرار الغضروف المفصلي الإنسي والغضروف نموذج خدش الفئران من هشاشة العظام المتسارعة

Summary

يصف البروتوكول الحالي خدوش الشفرة الدقيقة التي يتم التحكم فيها على سطح الغضروف المفصلي بعد زعزعة استقرار ركبة الفأر عن طريق قطع الرباط الظنبوبي الإنسي. يقدم هذا النموذج الحيواني شكلا متسارعا من هشاشة العظام (OA) مناسبا لدراسة تكوين هشاشة العظام وتصلب العظام وآلام المرحلة المبكرة.

Abstract

هشاشة العظام هو أكثر الأمراض العضلية الهيكلية انتشارا لدى الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 45 عاما ، مما يؤدي إلى زيادة التكلفة الاقتصادية والمجتمعية. تستخدم النماذج الحيوانية لتقليد العديد من جوانب المرض. يصف البروتوكول الحالي نموذج زعزعة الاستقرار وخدش الغضروف (DCS) لالتهاب المفاصل العظمي بعد الصدمة. استنادا إلى زعزعة استقرار نموذج الغضروف المفصلي الإنسي (DMM) المستخدم على نطاق واسع ، يقدم DCS ثلاث خدوش على سطح الغضروف. تسلط المقالة الحالية الضوء على خطوات زعزعة استقرار الركبة عن طريق عبور الرباط الغضروفي الإنسي متبوعا بثلاث خدوش سطحية متعمدة على الغضروف المفصلي. كما يتم توضيح طرق التحليل الممكنة عن طريق حمل الوزن الديناميكي والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق وعلم الأنسجة. في حين أن نموذج DCS غير موصى به للدراسات التي تركز على تأثير هشاشة العظام على الغضروف ، إلا أنه يتيح دراسة تطور هشاشة العظام في نافذة زمنية أقصر ، مع التركيز بشكل خاص على (1) تكوين هشاشة العظام ، (2) التهاب المفاصل وآلام الإصابة ، و (3) تأثير تلف الغضروف في المفصل بأكمله.

Introduction

هشاشة العظام (OA) هو أكثر أمراض العضلات والعظام انتشارا لدى الأشخاص الذين تزيد أعمارهم عن 45 عاما ، حيث يسعى أكثر من 8.75 مليون شخص للعلاج في المملكة المتحدة¹. أدى الانتشار المتزايد للمرض إلى زيادة التكلفة الاقتصادية والمجتمعية ، وهو مساهم رئيسي في الإعاقة ، ويقلل من نوعية حياة المرضى¹. بدون العلاجات المتاحة ، هناك حاجة ملحة لتسريع البحث لفهم تطور المرض وتطوره. المرض معقد ومتعدد العوامل بطبيعته. القياسات السريرية الرئيسية للمرض هي الألم وحركة المفاصل² ، ويؤثر OA على جميع الأنسجة في المفصل ، وليس فقط الغضروف³. أحد التحديات الرئيسية في فهم هشاشة العظام هو أنه قد يستغرق سنوات ، وأحيانا عقودا ، من العرض الأولي / الإصابة إلى تطور المرض المصحوب بأعراض مع الألم وعدم الحركة.

عززت نمذجة هشاشة العظام في القوارض معرفتنا بالفيزيولوجيا المرضية OA من خلال السماح لنا بفهم البدء والتقدم في إطار زمني أقصر بكثير ومع فحص مفصل للأنسجة المعنية. هناك العديد من نماذج الفئران من هشاشة العظام ، من الحيوانات المعدلة وراثيا إلى نماذج التدخل الجراحي. نموذج الفئران الأكثر استخداما على نطاق واسع من الزراعة العضوية بعد الصدمة هو زعزعة استقرار الغضروف المفصلي الإنسي (DMM)^4،5. تحذير النموذج هو التباين بين المشغلين المختلفين. يمكن للجراحين ذوي الخبرة إجراء العملية بأقل قدر من تلف المفاصل ، بينما يعرض المشغلون عديمي الخبرة كبسولة المفصل لفترات أطول من الوقت ويلحقون الضرر بالغضروف. يؤثر هذا التباين في العملية على شدة النموذج ، مع المزيد من الضرر الأولي الذي يؤدي إلى زيادة درجات تلف الغضروف وتكوين العظم. بهدف تقليل التباين بين المشغلين وتقليد تلف الغضروف الناتج عن التدخل السريري ، تم تطوير نسخة معدلة من هذا النموذج ، حيث يتم إلحاق أضرار إضافية يتم التحكم فيها على سطح الغضروف في شكل ثلاثة خدوش سطحية⁶. يسمح هذا أيضا بنمذجة تطور الزراعة العضوية الناتج عن تلف الغضروف الناجم عن بعض التدخلات السريرية. بالمقارنة مع نموذج DMM القياسي ، يؤدي تلف الغضروف المستحث مباشرة إلى تسارع تكوين هشاشة العظام باستمرار ، وزيادة تلف الغضروف والتهابه ، وألم بديل قابل للقياس في ذكور الفئران.

هذا النموذج مناسب بشكل خاص لدراسة الزراعة العضوية في مرحلة مبكرة بعد الصدمة ، مع التركيز على تكوين العظم ، وعرض الألم (في الفئران الذكور) ، والتهاب الغشاء المفصلي ، والتغيرات المبكرة في معلمات العظام. إن اتساق تكوين العظم في هذا النموذج يجعل من المناسب دراسة إصلاح العظام والتعظم داخل الغضروف لأن تكوين العظم هو عملية إصلاح عن طريق التعظم الغضروفي⁷. يحاكي النموذج أيضا الضرر الذي يحدث مباشرة إلى الغضروف أثناء التدخلات السريرية ، مثل العمليات الجراحية بالمنظار ، وبالتالي فهو مناسب أيضا لدراسة تأثير تلف الغضروف على المفصل بأكمله.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة المراجعة الأخلاقية بجامعة غلاسكو وجامعة غرب اسكتلندا ، وتم تنفيذها وفقا لإرشادات قانون الحيوانات (الإجراءات العلمية) لعام 1986 (المملكة المتحدة). تم استخدام ذكور الفئران C57Bl6 / J البالغة من العمر 10 أسابيع ، والتي تزن حوالي 25 جراما ، في الدراسة الحالية. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).

1. إعداد الحيوانات

ملاحظة: ضع في اعتبارك جنس الفأر فيما يتعلق بالغرض من الدراسة حيث تظهر نماذج الزراعة العضوية بعد الصدمة اختلافات مهمة اعتمادا على الجنس⁸،^9،10.

1. تأكد من أن كاشف التخدير (2٪ إيزوفلوران) جاهز.
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام التخدير عن طريق الحقن¹¹. نظرا لسرعة مدة الجراحة ، يوصى باستخدام التخدير المستنشق.
2. استخدم مجموعة منفصلة مطابقة للعمر تعمل بشكل زائف كمراقبة جراحية.
   ملاحظة: يجب عدم استخدام الركبة المقابلة كعنصر تحكم جراحي (عملية وهمية على الساق المقابلة). قد يكون لهذا مشاكل فيما يتعلق برعاية الحيوان ، ومن المحتمل أن يؤثر على قياسات المشي والمشي. تعمل الركبة المقابلة على تطبيع المعلمات العظمية الجوهرية¹² وتعمل كمقارنة مزدوجة في اختبارات الألم المثارة¹³.
3. استخدم الفئران الناضجة هيكليا.
   ملاحظة: معظم الأدبيات تحفز الزراعة العضوية في عمر 8-12 أسبوعا. في هذه الدراسة ، يبلغ عمر الفئران 10 أسابيع.

2. رعاية ما قبل الجراحة (يقوم بها مساعد جراحي)

1. إذا تم نقلها من منشأة مختلفة ، اترك ما لا يقل عن 1 أسبوع قبل التدخل الجراحي للفئران للتكيف مع بيئتها الجديدة.
2. إجراء الجراحة في غرفة معقمة مخصصة بشكل مناسب ، مع التأكد من أن جميع الأسطح معقمة (على سبيل المثال ، استخدم الستائر المعقمة لتغطية مناطق الجراحة).
   ملاحظة: الجراحة معقمة.
3. ترتيب ووضع الأدوات المعقمة على الستائر المعقمة.
4. وزن الماوس.
5. تحفيز التخدير عن طريق إدخال الفأر في قفص مخدر ثم إدخال 2٪ إيزوفلوران لمدة تصل إلى 15 دقيقة باستخدام جهاز مخدر قياسي (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: يجب ألا يحتوي القفص على تخدير "متبقي" قبل إدخال الماوس.
6. بمجرد التخدير ، أخرج الفأر من غرفة التخدير وقم بقص الفراء على الركبة والجانبين الأمامي والجانبي من منتصف الذقن إلى منتصف الفخذ باستخدام مقصات شعر صغيرة.
   ملاحظة: يعود اختيار ركبة الطرف الخلفي إلى تفضيل المشغل للجانب الذي يجده أسهل لإجراء الجراحة. يعمل هذا البروتوكول على الساق اليسرى.
7. تأكد من تخدير الماوس بالكامل (لا يستجيب لقرص القدم).
8. تطهير الجلد عن طريق تطبيق منظف الجلد المضاد للبكتيريا (على سبيل المثال ، يحتوي على الكلورهيكسيدين أو اليودوفور ، انظر جدول المواد) على الجلد المكشوف المحلوق.
9. لتسكين، يتم تطبيق 0.05 ملغ/ كغ من البوبرينورفين تحت الجلد.
10. ضع الماوس على الجانب الظهري ، واترك الركبة ليتم تشغيلها لأعلى ، وضع أنف الفأر في الفوهة المتصلة بجهاز التخدير.
11. قم بتغطية الماوس بستارة معقمة بفتحة صغيرة لثقب المفتاح.
12. ضع الساق المراد إجراء العملية عليها مع ثني الركبة بأقل من 90 درجة ، مع توجيه الرباط الرضفي لأعلى وشل حركة القدم بشريط جراحي.

3. زعزعة استقرار عملية الغضروف المفصلي الإنسي تليها خدش الغضروف

1. اضبط المجهر للتركيز على الرباط الرضفي.
2. قرصة جلد الركبة على الجانب الجانبي مع ملقط مسنن (انظر جدول المواد) ، وجعل قطع صغير مواز للوتر الرضفي البعيد باستخدام مقص جراحي ، وإدخال المقص وتوسيع القطع إلى حوالي 1 سم. حرك الجلد إلى الجانب الإنسي ، وكشف الرباط الرضفي والهضبة الظنبوبية القريبة (الشكل 1).
3. باستخدام شفرة رقم 11 ، قم بعمل شق على طول الجانب الإنسي من الرباط الرضفي ، من أعلى الرباط إلى أسفله (الشكل 1 أ). عند الوصول إلى الجزء السفلي من الرباط الرضفي ، أدر الشفرة 90 درجة وقم بتمديد الشق بعيدا عن الرباط الرضفي باتجاه الجانب الإنسي للوصول إلى كبسولة المفصل.
   ملاحظة: قد يحدث نزيف في هذه الخطوة أو الخطوات اللاحقة. في حالة حدوث نزيف ، استخدم برعما قطنيا معقما واضغط لبضع ثوان (من 5 إلى 30 ثانية).
4. اضغط على الرباط الرضفي بملقط ذو طرف حاد وقم بتدوير الرسغ لتحريك الرباط الرضفي إلى الجانب الجانبي ، وهو ما يكفي لكشف وسادة الدهون تحت الرضفة (IFP).
   ملاحظة: لتقليل الضرر الذي يلحق بالرباط الرضفي ، لا تمسك الملقط بإحكام شديد ، فقط يكفي لإبقاء الرباط جانبيا.
5. بينما لا تزال تمسك الرباط الرضفي برفق ، اضغط على IFP بملاقط دقيقة (انظر جدول المواد) لرفعه وتحريكه لأعلى قليلا. هذا يسمح بتصور الرباط الغضروفي الإنسي.
6. تحديد الرباط الغضروفي الإنسي (MMTL) للهلالة الإنسية ، الذي يثبت القرن القحفي للهلالة الإنسية بالهضبة الظنبوبية الأمامية (الشكل 1 ب).
7. تجنب التلف والتعرض الطويل للغضروف في هضبة الظنبوب أو اللقمة الفخذية.
8. اقطع MMTL بعناية باستخدام مقص زنبركي Vannas صغير بشفرة 2 مم ، تاركا الغضروف المفصلي الإنسي والأربطة الأخرى سليمة. في هذه المرحلة ، يتم الانتهاء من الإجراء الجراحي لنموذج DMM (الشكل 1C).
9. باستخدام سكين جراحي مجهري 3 مم ، حدد ثلاث مسافات بادئة متباعدة بالتساوي على الغضروف المفصلي الظنبوبي في اتجاه من الجزء الخلفي إلى الجزء الأمامي.
   ملاحظة: يبلغ طول الدرجات حوالي 1 مم ولا تلحق الضرر إلا بسطح الغضروف (الشكل 2 د).
   1. لا تستخدم القوة المفرطة مع الشفرة على الغضروف (أي تأكد من أن الخدوش سطحية). تتسبب هذه الخطوة الإضافية في تلف الغضروف ، مما يؤدي إلى نموذج DCS.
10. أغلق الجلد باثنين أو ثلاثة مشابك معدنية صغيرة لإغلاق الجرح مقاس 7 مم أو خيوط جراحية تحت الجلد 6-0 قابلة للامتصاص (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: الغرز الجراحية تحت الجلد أفضل لأنها تتجنب المزيد من التدخل ، لكنها تطيل مدة الجراحة. تزيد الغرز الخارجية من خطر فتح الجرح عن طريق قضم الفئران.
11. تحديد الرباط الهلالي الإنسي للهلالة الإنسية لإجراء جراحة وهمية ، ولكن لا تقطع.
12. بالنسبة للفئران التي تتلقى خدوشا غضروفية فقط ، قم بعمل الخدوش السطحية الثلاثة دون قطع الرباط.
    ملاحظة: بين كل ماوس ، قم بتغيير القفازات وتعقيم الأدوات عبر الأوتوكلاف. تذكر أن تتحقق من تبريد الأدوات قبل إعادة استخدامها.

4. رعاية ما بعد الجراحة

1. في حالة حدوث نزيف (>50 ميكرولتر) ، قم بحقن 500 ميكرولتر من محلول ملحي معقم دافئ تحت الجلد (على ظهر الماوس).
   ملاحظة: في تجربتنا ، على الرغم من أن الفئران لديها نزيف طفيف ، إلا أنها ليست أكثر من قطرة صغيرة ، وبالتالي لا تحتاج السوائل إلى التجديد.
2. بعد الجراحة ، ضع الفأر في قفص الاسترداد على منديل ورقي نظيف واسمح بالشفاء من التخدير (5-10 دقائق).
3. نقل الفئران واعية تماما إلى قفص نظيف مع فراش جديد بعد الجراحة.
4. في 72 ساعة بعد التدخل الجراحي ، راقب أي علامات للألم أو الضيق. انتبه إلى:
   1. التغيرات في وزن الجسم. على الرغم من أن وزن الجسم قد ينخفض في اليوم الأول والثاني ، إلا أن هذا لا يزيد عادة عن 5٪ من وزن الجسم قبل الجراحة.
   2. النقص العام في الاستمالة أو الإفراط في الاستمالة حول الشق.
   3. علامات تدهور الصحة العامة ، مثل الموقف المنحني ، تجهم الوجه ، و / أو التنفس غير الطبيعي.
   4. عدوى الجرح كما يتضح من أي تورم أو إفرازات أو فتح للجرح.
      ملاحظة: قد تحدث العدوى إذا فتح الجرح الجراحي. نظرا لأن إصلاح الجروح الجراحية (على سبيل المثال ، استبدال المشابك المعدنية المفقودة أو إعادة الخياطة) هو إجراء منظم ، تأكد من الحصول على الموافقة ذات الصلة قبل إجراء الإصلاحات.
5. قم بإزالة المشابك المعدنية بين 5-7 أيام بعد الجراحة.
6. الحفاظ على الفئران عادة 2-52 أسابيع بعد الجراحة اعتمادا على تصميم الدراسة.
7. تقييم الألم / المشية في أي وقت أثناء الدراسة.
   ملاحظة: تستخدم هذه الدراسة الوزن الديناميكي الحامل كما هو موضح في الخطوة 5.1.
8. القتل الرحيم للحيوان بطريقة معتمدة ، وفقا لاتفاقيات الترخيص الوطنية والمبادئ التوجيهية المحلية والموافقة التجريبية.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم القتل الرحيم للحيوانات عن طريق الاستنزاف (ثقب القلب) تحت التخدير النهائي يليه خلع عنق الرحم¹⁴.

5. تقييم مرض التهاب المفاصل العظمي

1. قم بقياس الوزن الديناميكي كقياس بديل للألم باتباع الخطوات أدناه.
   ملاحظة: بما أن الفئران فريسة ، فإنها تميل إلى إخفاء سلوكيات الألم. هذا يجعل قياس الألم صعبا. هناك العديد من الطرق لقياس الألم المثار ، مثل Von Frey¹⁵ وتحليل المشي¹⁶. قامت الدراسة الحالية بقياس الحمل التفاضلي بين ساق التهاب المفاصل التي تم تشغيلها وساق التحكم غير المشغلة على حصيرة ضغط أثناء وجود الفأر في قفص (انظر جدول المواد ، الشكل 2 أ).
   1. وزن الماوس. قم بتفريغ حصيرة الضغط ومعايرتها وفقا للتعليمات المحددة للشركة المصنعة (انظر المعدات الديناميكية الحاملة للوزن في جدول المواد). أعرض الماوس في القفص.
   2. سجل الحركة وضغط مخلب الماوس في القفص لمدة 5 دقائق. تحليل البيانات المكتسبة للتحقق من صحة 1 دقيقة ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: يوفر التحليل الآلي للشركة المصنعة على برنامج DWB (انظر المعدات الديناميكية الحاملة للوزن في جدول المواد) قياسات على كل مخلب بما يتناسب مع إجمالي وزن الجسم ، ومقدار الوقت الذي تم التحقق من صحته والذي بقي فيه كل مخلب على الحصيرة ، وتقدير لمنطقة الحصيرة التي يشغلها كل مخلب. هذا يسمح بحساب الحمل التفاضلي بين الكفوف الخلفية ، والحمل التفاضلي بين الكفوف الأمامية والخلفية ، وزيادة تحميل المخلب الأمامي (إذا تم قياس نفس الماوس على مدى فترة زمنية) ، والوقت المستغرق في رفع ساق الزراعة العضوية مقارنة بالساق المقابلة وسطح المخلب.
2. تحديد الأنسجة المتكلسة من خلال التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (μCT).
   ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن قياس تصلب العظم تحت الغضروف وتكوين الخلايا العظمية في الأقسام النسيجية ، إلا أن μCT يوفر الفرصة لتحديد ثلاثي الأبعاد. دقة التقاط الصور في μCT عند 5 ميكرومتر كافية ، لأن هذا يسمح بتصور الهياكل الأصغر مثل الخلايا العظمية ، على الرغم من أنه كلما زادت الدقة ، كان ذلك أفضل.
   1. إصلاح مفاصل الركبة في محلول بارافورمالدهيد 4 ٪ لمدة 24 ساعة ، ثم نقل إلى 70 ٪ EtOH.
   2. مسح مفاصل الركبة في الماسح الضوئي μCT.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم مسح العينات ضوئيا على ماسح ضوئي μCT (انظر جدول المواد) مع مرشح ألومنيوم 0.5 مضبوط على 50 كيلو فولت و 200 ميكرو أمبير. تم فحص العينات بحجم فوكسل 4.5 ميكرومتر. 2 ميكرومتر ، زاوية دوران 0.2 درجة للتصوير ، وزاوية دوران 0.5 درجة للقياس الكمي.
   3. إعادة بناء عمليات المسح للسماح بالتصور 3D. تمت إعادة بناء عمليات المسح المعروضة هنا باستخدام برنامج متوافق (انظر جدول المواد).
   4. تحليل التصلب العظمي تحت الغضروف (الشكل 2 ب) باتباع الخطوات أدناه.
      1. حدد حجم الاهتمام (VOI) من 0.5 مم × 0.9 مم × 0.9 مم في وسط حمل هضبة الظنبوب الإنسي¹⁷.
      2. تطبيع ضد النمط الظاهري العظمي الجوهري للفأر عن طريق تحليل الساق غير المشغلة.
      3. تحديد كثافة العظام تحت الغضروف والبنية الدقيقة عن طريق اختيار منطقة الاهتمام (ROI) التي تحدد البنية التربيقية داخل المشاش الظنبوبي ، أو الصفيحة تحت الغضروف ، أو العظم تحت الغضروفي الكلي في المنظر الإكليلي ثنائي الأبعاد للمكدس باستخدام برنامج CTan (انظر جدول المواد).
         ملاحظة: مع تقدم المرض ، يصبح من الصعب التمييز بين الصفيحة تحت الغضروفية والمنطقة التربيقية تحت الغضروف. ثم يوصى بتحليل منطقة العظم تحت الغضروف المختارة من مساحة المفصل إلى صفيحة النمو.
   5. حدد كمية النباتات العظمية (الشكل 2C) باتباع الخطوات أدناه.
      1. تحديد الخلايا العظمية في مكدسات الصور ثلاثية الأبعاد المعاد بناؤها باستخدام برنامج CTvol (انظر جدول المواد).
         ملاحظة: النابتات العظمية المعدنية هي نتوءات مشابهة للعظام المنسوجة المرئية على الجانب الإنسي من العظم تحت الغضروف¹⁸. يشار إلى مثال على ذلك بأسهم صفراء في الشكل 2C.
      2. عد يدويا عدد النباتات العظمية المحددة في الجانب الإنسي من مفصل الركبة.
      3. قم بقياس حجم الخلايا العظمية في تحليل الصور المتسلسلة 2D (باستخدام محلل التصوير المقطعي المحوسب) عن طريق تحديد حافة الخلايا العظمية يدويا ، والبروز من الصفيحة تحت الغضروف كمنطقة الاهتمام (ROI) للتحليل.
      4. احسب كثافة عظام العظم كنسبة حجم العظام على حجم العظم باستخدام برنامج محلل التصوير المقطعي المحوسب (انظر جدول المواد).
3. تقييم تلف الغضروف والتهاب الغشاء المفصلي (الشكل 2D) وفقا لدرجة تلف الغضروف OARSI¹⁹ ودرجة التهاب الغشاء المفصلي²⁰ على أقسام 6 ميكرومتر المضمنة بالبارافين.
   1. بعد المسح ، قم بإزالة الكلس من مفاصل الركبة في 10٪ EDTA عند 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن 2 أسابيع ، مع تغيير المحلول مرتين في الأسبوع.
   2. تضمين العينات في البارافين. للاطلاع على العلاجات وفترات الحضانة، انظر الملف التكميلي 1.
   3. قطع 5 ميكرومتر من المقاطع الإكليلية من العينات المضمنة بالبارافين على ميكروتوم دوار (انظر جدول المواد).
   4. حدد أقساما في المنطقة التي تلتقي فيها اللقمات الظنبوبية والفخذية (الشكل 2 د). حدد قسمين في ثلاث مناطق متباعدة بالتساوي من المفصل.
      ملاحظة: تم اختيار الأقسام المسجلة في هذه الدراسة في مناطق تفصل بينها 80-100 ميكرومتر.
   5. أقسام البقع مع Safranin-O والأخضر السريع (انظر جدول المواد) باتباع الخطوات أدناه.
      1. إزالة المقاطع عن طريق غمرها (بالتسلسل المذكور) في زيلين لمدة 5 دقائق (2x) ، و 100٪ إيثانول لمدة دقيقتين ، و 95٪ إيثانول لمدة دقيقتين ، و 80٪ إيثانول لمدة دقيقتين ، و 70٪ إيثانول لمدة دقيقتين.
      2. وصمة عار مع الهيماتوكسيلين المصفى (انظر جدول المواد) لمدة 30 ثانية. ثم شطف في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق (ثلاث مرات).
      3. يغسل مع سكوت عازلة (2 غرام من بيكربونات الصوديوم و 10 غرام من كبريتات المغنيسيوم في 1 لتر من الماء المقطر) لمدة 2 دقيقة. شطف في "ماء الصنبور" لمدة 5 دقائق (ثلاث مرات).
      4. تلطخ لمدة 4 دقائق مع 0.2٪ أخضر سريع. اغمس في 1٪ حمض الخليك الجليدي ، خمس مرات (طازج في كل جلسة). شطف بسرعة في ماء الصنبور.
      5. تلطخ لمدة 5 دقائق مع 0.5٪ سافرانين-O. شطف في 95 ٪ الإيثانول. قم بتجفيف المقاطع في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق تليها 3 دقائق في الزيلين.
   6. أقسام النتيجة كما هو مذكور في Glasson et al. للغضروف¹⁹ وجاكسون وآخرون لالتهاب الغشاء المفصلي²⁰.
      ملاحظة: توجد طرق أخرى للقياس الكمي ، مثل القياس الكمي القائم على الكمبيوتر بواسطة Pinamont et ^al.21.
   7. تحقق من صحة نظام التسجيل مع اثنين من الهدافين المختلفين ، أعمى عن التجربة.

النتائج

تمت مقارنة النسبة المئوية للحمل لكل إجمالي وزن الجسم للساق الخلفية التي تعمل / OA مع الساق المقابلة / التحكم. على الرغم من أن المعلمات الأخرى قد تعطي أيضا اختلافات كبيرة ، مثل الزيادة في حمل المخلب الأمامي بعد التدخل الجراحي ، إلا أن التغيير المستمر في حمل المخلب الخلفي يشير إلى تفضيل استخدام ساق واحدة على الأخرى وهو مؤشر مباشر أكثر على الانزعاج الشديد للماوس بسبب تطور الزراعة العضوية. لم تكن هناك تغييرات كبيرة في حمل الساق الخلفية في نموذج DMM في غضون 8 أسابيع بعد الحث ، في حين أن الفئران DCS تفضل الساق المقابلة / السيطرة بشكل ملحوظ 2 أسابيع بعد التدخل (الشكل 3A).

تم تحليل العظم تحت الغضروف من خلال التركيز على الحجم تحت المنطقة المحملة الإنسي من اللقمة الظنبوبية. قمنا هنا بتقييم كثافة العظام في هذه المنطقة من خلال تحديد النسبة المئوية للعظام المعدنية داخل المنطقة محل الاهتمام وحساب النسبة بين الساق المقابلة والساق المماثلة. تشير النسبة إلى أن كلا النموذجين قد زاديا من كثافة العظام في الطرف المصاب (النسبة أعلى من 1) بعد 4 أسابيع من الحث (الشكل 3 ب). ظهور الخلايا العظمية أكثر بروزا في نموذج DCS ، حيث توجد زيادة كبيرة في العدد والحجم مقارنة بنموذج DMM بعد أسبوعين من التدخل (الشكل 3C ، D). يعرض DCS تلفا مرتفعا في الغضروف في مقصورات الظنبوب والفخذ الإنسي والتهاب الغشاء المفصلي (الشكل 3E ، F) بعد 4 أسابيع من التحريض.

الشكل 1: التدخل الجراحي للحث على الزراعة العضوية بعد الصدمة في الفأر. تمثل الصور المتسلسلة المراحل المختلفة للإجراء. (أ) تعرض كبسولة المفصل التي تقطع الغشاء السطحي حول الركبة عن طريق إدخال شفرة مشرط رقم 11 على الجانب الإنسي من الرباط الرضفي وبعيدا عن الرباط. هذا سوف يفضح وسادة الدهون تحت الرضفة. ب: تحديد الرباط الهلالي الإنسي وقطعه. لتحديد الرباط ، حرك الرباط الرضفي نحو الجانب الجانبي ثم ادفع وسادة الدهون لأعلى. هذا يسمح بتصور الرباط كخط أبيض أفقي صغير فوق اللقمة الظنبوبية مباشرة (يشار إليه هنا بسهم أسود). لقطع الرباط ، يتم وضع الشفرة السفلية لمقص الربيع تحت الرباط ، مع الحرص على عدم إتلاف الغضروف. حرك الغضروف المفصلي نحو الجانب الإنسي لتصور اللقمة الظنبوبية. ج: خدش سطح الغضروف المكشوف وإغلاق الجرح. لخدش الغضروف ، يتم إدخال الشفرة الدقيقة باتجاه الجانب الخلفي ، حيث تلامس الغضروف ثم تتحرك للأمام نحو الجزء الأمامي من المفصل. بمجرد الانتهاء من الخدوش ، اسحب الجلد فوق الركبة وأغلق الجرح إما عن طريق خياطة تحت الجلد أو بمشابك الجرح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تقييم هشاشة العظام في الماوس . (أ) يتكون حمل الوزن الديناميكي من مطابقة الحمل على حصيرة الضغط مع المخلب المقابل. ثم يتم التعبير عن الحمل كنسبة مئوية من الوزن الكلي. (ب) يقاس العظم تحت الغضروف باختيار حجم الاهتمام في منطقة تحميل اللقمة الظنبوبية الإنسية، واختيار الصفيحة تحت الغضروفية أو العظم التربيقي. هذه الصور بدقة 4.5 ميكرومتر. (ج) يتم تحديد النابتات العظمية وقياسها كميا في عرض ثلاثي الأبعاد لصور μCT المكتسبة. يتم قياس حجم الخلايا العظمية عن طريق اختيار عائد استثمار يحدد حافة النابت العظمي. يتم حساب كثافة العظام على أنها حجم العظام لكل حجم عظمي. تم التقاط الصور المعروضة هنا بدقة 2 ميكرومتر ، ولكن عادة ما يتم القياس الكمي بدقة 4.5 ميكرومتر. (د) درجات الغضروف والتهاب الغشاء المفصلي مأخوذة من مقاطع مقدارها 6 ميكرومتر ملطخة ب Safranin-O و Fast green. قسم إكليلي من ركبة الفأر حيث تكون جميع الأرباع ، المميزة بصندوق أسود ، مرئية للتسجيل ويظهر تكبير الجانب الإنسي. يظهر أيضا التهاب الغشاء المفصلي المحيط بالجانب الإنسي من مفصل الركبة ، خاصة فوق وتحت الغضروف المفصلي النازح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تقييم تمثيلي للنفاذ المفتوح في نماذج DMM و DCS. (أ) تم قياس DWB لمدة تصل إلى 8 أسابيع بعد الاستقراء على التجارب التي أجراها نفس المشغل الخبير. يتم التعبير عن الحمل كنسبة بين الحمل الذي تم تشغيله / OA مقابل الحمل المقابل / التحكم. تظهر اختبارات t المزدوجة لكلا الساقين أيضا في طرازات Sham (الرمادي) و DMM (الأزرق) و DCS (الوردي). تحليل μCT بعد 4 أسابيع من التدخل الجراحي. (ب) تم تحليل العظم تحت الغضروف بعد 4 أسابيع من التدخل الجراحي وتم التعبير عنه كنسبة المماثل على النسبة المئوية المقابلة BV / TV. (ج) تم تحليل عدد النبتات العظمية و (د) حجم النبتة العظمية بعد 2 أسابيع من التحريض. تم تسجيل التقييم النسيجي بعد 4 أسابيع من تحريض (E) تلف الغضروف في الغضروف المفصلي الظنبوبي والفخذي الإنسي و (F) التهاب الغشاء المفصلي بطرق موحدة^19,20. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري ، رقم ≥ 5. تمت مقارنة البيانات عن طريق ANOVA ذات المقاييس المتكررة مع تصحيح اختبار Šídák (A) أو اختبار t المقترن (A) أو اختبار t القياسي للطالب (B-F). * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، ***P < 0.001 ، ns = غير مهم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: حالة المعالجة والحضانة لتضمين البارافين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

لإجراء الحث الجراحي لالتهاب المفاصل بعد الصدمة (PTOA) ، يوصى بشدة بالدعم من مساعد (على سبيل المثال ، لإعداد الفئران بينما يركز المشغل على الجراحة). هذا يسهل الجراحة المعقمة ، وبالتالي تقليل مخاطر العدوى وجعل التدخل أكثر كفاءة في التجارب الكبيرة. من السهل أن تفقد مستوى التركيز أثناء الجراحة ، لذا فإن المجهر الذي يتضمن دواسات للتركيز هو ميزة قيمة في المساعدة في الحفاظ على العقم طوال الجراحة. موقف الفأر والركبة أمر بالغ الأهمية. يجب أن تكون الركبة متجهة لأعلى ومثنية بدرجة كافية لزيادة فتحة مساحة مفصل الركبة إلى أقصى حد ، مما يسهل الوصول إلى الرباط لإدخال الشفرة الدقيقة لخدش سطح اللقمة. قد يكون تحديد MMTL أمرا صعبا ، خاصة عندما تكون وسادة الدهون أكبر من المعتاد أو يكون هناك نزيف صغير. لتجنب النزيف ، ادفع وسادة الدهون لأعلى لمنع التمزقات والنزيف اللاحق. إذا كانت وسادة الدهون كبيرة ، فقد يستغرق ذلك وقتا أطول قليلا ، ولكن استمر بصبر في دفعها لأعلى.

MMTL قريب جدا من اللقمة الظنبوبية ، لذلك يجب على المرء أن يحرص على عدم إصابة الغضروف عند وضع الشفرة السفلية لمقص الزنبرك المنحني تحت MMTL. يجب أن تشير الشفرات المنحنية نحو الجانب الإنسي وإلى الأعلى قليلا ، بالتوازي مع اللقمة. للحصول على أفضل تقسيم ل MMTL ، تأكد من أن المقص حاد. تأكد من أن الغضروف المفصلي يمكن أن يتحرك وسطيا بعد قطع الرباط ، حيث يبقى في بعض الأحيان ملحق صغير يحتاج إلى مزيد من القطع. عند إدخال الشفرة الدقيقة لخدش اللقمة ، يجب أن تكون متعامدة مع اللقمة. اجعل الخدش الأول أقرب إلى منتصف المفصل ولكن احرص على عدم تلف الرباط الصليبي الأمامي. ثم تحرك نحو الجانب الإنسي ثم خلف الغضروف المفصلي. قد تكون الخدوش مرئية كخطوط بيضاء باهتة على الغضروف. نظرا لأننا عادة ما نستخدم المشابك ، يتم إجراء الشق الأولي على الجانب الجانبي ، بحيث يتم وضع المشابك على جانب الساق بعد إغلاق الجرح. هذا يتجنب المشابك التي تفرك الركبة بينما يستعيد الماوس الحركة. عند استخدام الغرز ، يوصى بشدة باستخدام غرز تحت الجلد. في حالة استخدام غرز خارجية ، من المرجح أن تقضم الفئران الغرز وتفتح جرحها ، مما يزيد من فرص الإصابة. عند القيام بها بشكل صحيح ، يجب ألا تستغرق هذه الجراحة أكثر من 5-10 دقائق ، من شق إلى إغلاق الجرح ، وبالتالي تقليل تعرض الغضروف وأي ضرر إضافي غير منضبط قد يحدث. بعد الجراحة ، تتعافى الفئران بسرعة كبيرة وعلى الفور تقريبا يمكن أن تصعد إلى القفص وتتحرك بشكل طبيعي. إذا لم تكن الفئران نشطة ، فيجب استشارة الخبير المناسب في الوحدة.

للتقييم السلوكي للألم ، تم تقييم حمل الوزن الديناميكي. ومع ذلك ، يمكن اعتبار هذه الطريقة أقل حساسية من اختبارات الألم الأخرى المستثارة ، مثل اختبار فون فراي¹⁵. يوصى باستخدام أكثر من طريقة لمراقبة الألم وتقييمه. التغييرات التي لوحظت بعد 2 أسابيع من التدخل في DCS ، على الرغم من عابرة ، تشير إلى انخفاض تحميل الساق الزراعة العضوية بشكل عام مقارنة بالساق السليمة. لذلك ، يمكن استخدام 2 أسابيع بعد تدخل DCS لتقييم ألم التهاب المفاصل أو الإصابة المبكر في نماذج الفئران. يسمح تصور الخلايا العظمية المعدنية بواسطة μCT بالقياس الكمي ثلاثي الأبعاد ، والذي يمكن أيضا مطابقته مع الأقسام النسيجية¹² ، مما يضيف بعدا آخر لدراسة ظهور العظم وتطوره. في مجموعتنا ، كان وجود العظم متغيرا في نموذج DMM بين وداخل المشغلين (2.3 ± 1 مقابل 1.2 ± 1 ، n > 7 ، P = 0.0183) ، في حين أدى تحريض DCS بقوة إلى توليد هشاشة العظام في جميع الحالات بغض النظر عن المشغل (2.6 ± 0.7 مقابل 2.4 ± 0.5 ، n > 7 ، P = 0.711). أيضا ، هناك نباتات عظمية أكثر وأكبر بكثير في نموذج DCS مقارنة ب DMM. وبالتالي ، فإن DCS هو نموذج مثالي لدراسة تكوين العظم. القياس الكمي لتصلب العظام يقتصر على منطقة التحميل من العظم تحت الغضروف هو أيضا تحسن في الكشف عن التغييرات الصغيرة. توفر مقارنة المقصورة الإنسية للساق التي تم تشغيلها بالساق المقابلة أيضا طريقة للتطبيع ضد النمط الظاهري العظمي الداخلي لهذا الفأر^{المعين 12}. تعد إضافة خدوش الغضروف في نموذج DCS وسيلة خاضعة للرقابة لإحداث تلف غضروفي مركز أثناء الجراحة التي تسرع العديد من جوانب المرض. تتمثل إحدى عواقب الإجراء التجريبي الذي ينطوي على تلف متعمد للغضروف نفسه في أن هذا الضرر المصطنع يحتاج إلى استبعاده أو تعديله في نظام تصنيف الغضروف. بسبب هذا القيد ، لا نوصي بهذا النموذج إذا كان الهدف الرئيسي للدراسة هو فهم تأثير هشاشة العظام على الغضروف نفسه. أخيرا ، يوصى بشدة أيضا بتصنيف اثنين على الأقل من الهدافين المكفوفين لتلف الغضروف ودرجات التهاب الغشاء المفصلي. هذا يتحقق ويعزز توحيد أنظمة التسجيل.

أحد قيود هذه الدراسة هو أن مدى التباين عبر جميع المعلمات التي تقارن نماذج DCS و DMM لم يتم تقييمه بالكامل. وسيتم تناول ذلك في المستقبل من خلال دراسات أكثر شمولا، والتي يمكن أن تشمل أيضا تقييما للتباين بين المشغلين من مختلف المؤسسات.

في الختام ، يسمح التسبب في هشاشة العظام المتسارع في نموذج DCS الحالي بتمثيل الزراعة العضوية بعد الصدمة ويوفر أداة بحث قوية وقوية للتحقيق وتوضيح الآليات الفيزيولوجية المرضية الأساسية للهشاشة العضوية التي تقود مرض المفاصل المنهك المزمن. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يتيح استكشاف هشاشة العظام في نافذة زمنية أقصر ، مع التركيز على تكوين العظم ، وألم هشاشة العظام ، وتأثير تلف الغضروف على المفصل بأكمله.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 scalpel blade (and scalpel handle).	World precision instruments	500240	access the joint capsule
15° Cutting Angle microsurgical stab knife	MSP	REF7503	scratch the cartilage
6-0 vicryl rapide	Any medical supplies provider	-	alternative method to close wound
Anaesthetic rig	Generic (many different suppliers)	-
Antibacterial skin clenser (Hibiscrub)	Amazon	-	To sterilise surgical skin area
Applicator for 7 mm clips	World precision instruments	500343	close the wound
Balance	Generic (many different suppliers)	-	To weigh mouse
Blunt curved forceps	Fine science tools	500232	move the patellar ligament to the side
Buprenorphine (Vetergesic)	Supplied by unit as it is a prescription drug	-	Analgesia
CT analyser	Bruker	3D.SUITE software	Software
Ctvol	Bruker	3D.SUITE software	Software
Data viewer	Bruker	3D.SUITE software	Software
Dynamic weight bearing equipment	Bioseb	BIO-DWB-DUAL	Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis
EDTA	Merck	E9884	10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4
Ethanol	Generic (many different suppliers)	-	for embedding decalcified bones
Fast Green FCF	Merck	F7252	For staining sections
Glacial acetic acid	Merck	1005706	For stianing sections
Haematoxylin solution	Merck	GHS132	Nuclear staining in paraffin sections.
Hoskins #21 micro-tweezers.	Cameron surgical limited	PHF1085	move the fat pad
Isofluorane	Supplied by unit as it is a prescription drug	-
Mice	Charles river	-	C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit)
Microcomputed tomography scanner	Bruker	SKYSCAN 1272 CMOS	µCT
Micropore surgical paper tape	FisherScientific	12787597	hold leg in position
Paraffin wax	Generic (many different suppliers)	-	for embedding decalcified bones
Reflex 7 mm stainless steel wound clips or	Fine science tools	12032-07	close the wound
Remover for 7 mm clips	World precision instruments	500347	remove wound clips
Rotary Microtome	Generic (many different suppliers)	-	To cut section of Paraffin embedded tissue.
Safranin-O	Merck	S2255	For staining sections
Serrated curved forceps	Fine science tools	15915	hold the skin
Sterile Drape	Generic (many different suppliers)	-	To ensure sterility of surgical area
Sterile Drape with key hole	Generic (many different suppliers)	-	To cover mouse and expose leg
Sterile saline	Generic (many different suppliers)
Sterile surgical drape	Generic (many different suppliers)	-	maintain sterile environment for surgical tools
Sterile surgical drape with key hole	Generic (many different suppliers)	-	cover the mouse and keep leg through key hole
Straight Scissors	World precision instruments	14393	open the wound
Surgical microscope.	Generic (many different suppliers)	-	Adjustable focus.
Vannas spring scissors with 2 mm blades.	Fine science tools	15000-04	cut the MMTL
Xylene	Generic (many different suppliers)	-	for embedding decalcified bones