加速性骨关节炎内侧半月板和软骨划痕鼠模型的不稳定

摘要

本协议描述了通过切割内侧小肩韧带破坏小鼠膝盖稳定性后关节软骨表面上受控的微刀片划痕。该动物模型呈现了一种加速形式的骨关节炎（OA），适用于研究骨赘形成，骨硬化和早期疼痛。

摘要

骨关节炎是45岁以上人群中最常见的肌肉骨骼疾病，导致经济和社会成本增加。动物模型用于模仿疾病的许多方面。本协议描述了创伤后骨关节炎的不稳定和软骨划痕模型（DCS）。基于广泛使用的内侧半月板不稳定（DMM）模型，DCS在软骨表面引入了三个划痕。本文重点介绍了通过横断内侧半月板韧带，然后在关节软骨上故意进行三次浅表划痕来破坏膝盖稳定性的步骤。还展示了通过动态承重、微计算机断层扫描和组织学的可能分析方法。虽然DCS模型不推荐用于关注骨关节炎对软骨影响的研究，但它可以在更短的时间内研究骨关节炎的发展，特别关注（1）骨赘形成，（2）骨关节炎和损伤疼痛，以及（3）整个关节软骨损伤的影响。

引言

骨关节炎 （OA） 是 45 岁以上人群中最普遍的肌肉骨骼疾病，在英国有超过 875 万人寻求治疗¹。该疾病的日益流行导致经济和社会成本增加，是导致残疾的主要原因，并降低了患者的生活质量¹。在没有可用的治疗方法的情况下，迫切需要加快研究以了解疾病的发展和进展。这种疾病很复杂，而且性质也是多因素的。该疾病的主要临床测量是疼痛和关节活动性²，OA影响关节中的所有组织，而不仅仅是软骨³。理解OA的主要挑战之一是，从最初的表现/损伤到有症状的疾病进展伴有疼痛和不动可能需要数年，有时甚至数十年。

啮齿动物的骨关节炎建模增强了我们对OA病理生理学的了解，使我们能够在更短的时间内了解起始和进展，并对所涉及的组织进行详细检查。有许多小鼠骨关节炎模型，从转基因动物到手术干预模型。最广泛使用的创伤后OA小鼠模型是内侧半月板不稳定（DMM）^4，5。该模型的一个警告是不同运算符之间的可变性。有经验的外科医生可以在最小的关节损伤下进行手术，而没有经验的操作员将关节囊暴露更长时间并对软骨造成损害。过程中的这种可变性会影响模型的严重性，更多的初始损伤导致软骨损伤评分和骨赘形成增加。为了减少操作员之间的变异性并模仿临床干预造成的软骨损伤，开发了该模型的修改版本，从而以三个浅表划痕的形式对软骨表面造成受控的额外损伤⁶。这也允许对由某些临床干预引起的软骨损伤引起的OA进展进行建模。与标准DMM模型相比，直接诱导的软骨损伤导致雄性小鼠持续加速突出的骨赘形成，增加软骨损伤和炎症以及可测量的替代疼痛。

该模型特别适用于早期创伤后OA的研究，重点是骨赘形成，疼痛表现（雄性小鼠），滑膜炎和骨骼参数的早期变化。该模型中骨赘形成的一致性使得研究骨修复和软骨内骨化变得相关，因为骨赘形成是通过软骨内骨化 修复 的过程⁷。该模型还模拟了在临床干预（例如关节镜外科手术）中直接引入软骨的损伤，因此也适用于研究软骨损伤对整个关节的影响。

研究方案

所有实验程序均由格拉斯哥大学和西苏格兰大学的伦理审查小组批准，并按照1986年动物（科学程序）法（英国）指南进行。10周龄C57Bl6 / J雄性小鼠，重约25g，用于本研究。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 动物制备

注意:就研究目的考虑小鼠性别，因为创伤后OA模型根据性别⁸，^9，10显示出重要差异。

1. 确保麻醉试剂（2%异氟醚）准备就绪。
   注意:注射麻醉也可用于¹¹。鉴于手术持续时间快，建议使用吸入麻醉。
2. 使用单独的假手术年龄匹配组作为手术对照。
   注意:对侧膝盖不得用作手术对照（对侧腿上的假手术）。这可能会在动物福利方面存在问题，并且可能会影响步态和步态测量。对侧膝关节使内在骨骼参数¹² 正常化，并作为诱发性疼痛测试¹³ 的配对比较。
3. 使用骨骼成熟的小鼠。
   注意:大多数文献在 8-12 周龄时诱导 OA。在本研究中，小鼠为10周龄。

2. 术前护理（由外科助理进行）

1. 如果从不同的设施运输，在手术干预前至少允许小鼠1周适应新环境。
2. 在适当指定的无菌室进行手术，确保所有表面都是无菌的（例如，使用无菌窗帘覆盖手术区域）。
   注意:手术是无菌的。
3. 将无菌器械排列并放置在无菌窗帘上。
4. 称量鼠标。
5. 通过将小鼠引入麻醉笼中，然后使用标准麻醉装置引入2%异氟烷长达15分钟来诱导麻醉（参见 材料表）。
   注意:在引入鼠标之前，笼子不得有"残留"麻醉。
6. 麻醉后，将鼠标从麻醉室中取出，用小理发夹将毛从胫骨中部到大腿中部的膝盖、前侧和侧面夹住。
   注意:后肢膝盖的选择取决于操作员的偏好，他们认为哪一侧更容易进行手术。该协议在左腿上操作。
7. 确保鼠标完全麻醉（对捏脚无反应）。
8. 通过在剃光的暴露皮肤上涂抹抗菌皮肤清洁剂（例如，含有氯己定或碘伏尔，见 材料表）来消毒皮肤。
9. 对于镇痛，皮下注射0.05mg / kg丁丙诺啡。
10. 将鼠标放在背侧，让膝盖向上手术，然后将鼠标鼻子放在连接到麻醉装置的喷嘴中。
11. 用带有小钥匙孔开口的无菌窗帘覆盖鼠标。
12. 将要手术的腿放在膝关节弯曲小于 90° 的位置，髌韧带朝上，用手术胶带固定脚部。

3.内侧半月板手术不稳定，随后出现软骨划痕

1. 调整显微镜以聚焦于髌韧带。
2. 用锯齿状镊子捏住膝盖侧面的皮肤（见 材料表），用手术剪刀平行于髌腱远端做一个小切口，引入剪刀并将切口扩大到约1厘米。将皮肤移到内侧，露出髌韧带和胫骨平台近端（图1）。
3. 使用11号刀片，沿着髌韧带的内侧，从韧带的顶部到底部切开一个切口（图1A）。当到达髌韧带底部时，将刀片旋转 90°，并将切口从髌韧带向内侧延伸，以进入关节囊。
   注意:此过程或后续步骤可能会出血。如果发生出血，请使用无菌棉签并施加压力几秒钟（5至30秒）。
4. 用钝尖镊子捏住髌韧带，然后旋转手腕将髌韧带移动到外侧，刚好暴露髌下脂肪垫（IFP）。
   注意:为尽量减少对髌韧带的损伤，请勿将镊子握得太紧，刚好足以将韧带保持在一侧。
5. 在仍然轻轻握住髌韧带的同时，用微镊子捏住IFP（见 材料表）将其抬高并稍微向上移动。这允许可视化内侧半月板韧带。
6. 识别内侧半月板的内侧半月板韧带（MMTL），它将内侧半月板的颅角固定在胫骨前平台（图1B）。
7. 避免胫骨平台或股骨髁损伤和长时间接触软骨。
8. 用 2 毫米刀片 Vannas 弹簧剪刀小心地切断 MMTL，保持内侧半月板和其他韧带完好无损。此时，DMM模型的外科手术已完成（图1C）。
9. 用3毫米显微手术刀，在胫关节软骨上从后部到前部的方向上标记三个均匀分布的凹痕。
   注意:划痕长度约为1毫米，仅损坏软骨表面（图2D）。
   1. 不要用刀片在软骨上用力过猛（即确保划痕是表面的）。这个额外的步骤会造成软骨损伤，诱导DCS模型。
10. 用两个或三个小的7毫米伤口闭合金属夹或可吸收的6-0皮下手术缝合线关闭皮肤（见 材料表）。
    注意:皮下手术缝合线更好，因为它们避免了进一步的干预，但它们延长了手术时间。外部缝合线增加了小鼠啃咬伤口的风险。
11. 识别内侧半月板的内侧半月板韧带以进行假手术，但不要切断。
12. 对于仅接受软骨划痕的小鼠，在不切断韧带的情况下进行三个浅表划痕。
    注意:在每只鼠标之间，更换手套并通过高压灭菌器 对 仪器进行消毒。记得在重复使用前检查仪器是否已冷却。

4. 术后护理

1. 如果发生出血（>50uL），皮下注射500μL温热的无菌盐水（在小鼠背部）。
   注意:根据我们的经验，虽然小鼠有轻微的出血，但它永远不会超过一小滴，因此不需要补充液体。
2. 手术后，将小鼠放在干净的纸巾上的恢复笼中，并从麻醉中恢复（5-10分钟）。
3. 手术后将完全清醒的小鼠转移到带有新鲜床上用品的干净笼子中。
4. 在手术干预后72小时内，监测任何疼痛或痛苦的迹象。注意:
   1. 体重变化。虽然体重可能会在第一天和第二天下降，但这通常不超过术前体重的5%。
   2. 切口周围普遍缺乏梳理或过度梳理。
   3. 一般健康状况恶化的迹象，例如驼背姿势、面部鬼脸和/或呼吸异常。
   4. 伤口感染，表现为伤口的任何肿胀、分泌物或开口。
      注意:如果手术伤口打开，可能会发生感染。由于手术伤口修复（例如，更换缺失的金属夹或重新缝合）是一项受监管的程序，因此请确保在进行修复之前获得相关批准。
5. 在手术后 5-7 天之间取下金属夹。
6. 根据研究设计，通常在术后2-52周维持小鼠。
7. 在研究过程中的任何时候评估疼痛/步态。
   注:本研究使用步骤5.1中所述的动态承重。
8. 根据国家许可协议、当地指南和实验批准，通过批准的方法对动物实施安乐死。
   注意:在本研究中，在终末麻醉下通过放血（心脏穿刺） 对 动物实施安乐死，然后进行颈椎脱位¹⁴。

5.骨关节炎疾病的评估

1. 按照以下步骤测量动态负重作为疼痛的替代测量。
   注意:由于小鼠是猎物，它们倾向于隐藏疼痛行为。这使得疼痛的测量变得困难。有许多方法可以测量诱发性疼痛，例如冯弗雷¹⁵ 和步态分析¹⁶。本研究测量了当小鼠在笼子中时，手术的骨关节炎腿和未手术的控制腿在压力垫上的差异负荷（见 材料表， 图2A）。
   1. 称量鼠标。根据制造商的具体说明去皮和校准压力垫（参见 材料表中的动态承重设备）。将鼠标引入笼子中。
   2. 记录小鼠在笼子中的运动和爪子压力5分钟。按照制造商的说明分析采集的数据以验证 1 分钟。
      注意:制造商对DWB软件的自动分析（参见 材料表中的动态承重设备）提供了与身体总重量成比例的每只爪子的测量值，每个爪子留在垫子上的验证时间，以及每个爪子占用的垫子面积的估计值。这允许计算两个后爪之间的差分负载，前后爪之间的差分负载，前爪负载的增加（如果在一段时间内测量了相同的鼠标），与对侧腿和爪子表面相比，抬起OA腿所花费的时间。
2. 通过显微计算机断层扫描 （μCT） 量化钙化组织。
   注意:虽然软骨下骨硬化和骨赘形成可以在组织学切片中测量，但μCT提供了三维量化的机会。在5μm处以μCT为单位捕获图像的分辨率就足够了，因为这允许可视化较小的结构，例如骨赘，尽管分辨率越高越好。
   1. 将膝关节固定在4%多聚甲醛溶液中24小时，然后转移到70%EtOH。
   2. 在μCT扫描仪中扫描膝关节。
      注意:在本研究中，样品在μCT扫描仪（见 材料表）上扫描，0.5铝滤波器设置为50 kV和200 μA。2 μm，0.2°旋转角用于成像，0.5°旋转角用于定量。
   3. 重建扫描以实现 3D 可视化。这里展示的扫描是使用兼容软件重建的（见 材料表）。
   4. 按照以下步骤分析软骨下骨硬化症（图2B）。
      1. 在胫骨内侧平台¹⁷的负荷中心选择0.5毫米×0.9毫米×0.9毫米的兴趣体积（VOI）。
      2. 通过分析未手术的腿来针对小鼠的内在骨表型进行归一化。
      3. 通过使用CTan软件在堆栈的二维冠状视图中选择描绘胫骨骺内小梁结构，软骨下板或总软骨下骨的感兴趣区域（ROI），确定软骨下骨密度和微结构（参见 材料表）。
         注意:随着疾病的进展，软骨下板和软骨下小梁区域之间的分离变得更加难以区分。然后建议分析从关节间隙到生长板选择的软骨下骨区域。
   5. 按照以下步骤量化骨赘（图2C）。
      1. 使用CTvol软件识别重建的三维图像堆栈中的骨赘（见 材料表）。
         注意:矿化骨赘是类似于软骨下骨内侧可见的编织骨的突起¹⁸。其中一个例子在 图2C中用黄色箭头表示。
      2. 手动计算膝关节内侧已识别的骨赘数量。
      3. 在 2D 顺序图像分析（使用 CT 分析仪）中测量骨赘体积，方法是手动描绘骨赘的边缘，从软骨下板突出作为分析的感兴趣区域 （ROI）。
      4. 使用CT分析仪软件计算骨赘骨密度为骨体积与骨赘体积的比率（参见 材料表）。
3. 根据石蜡包埋的 6 μm 切片上的 OARSI 软骨损伤评分¹⁹ 和滑膜炎评分²⁰，评估软骨损伤和滑膜炎（图 2D）。
   1. 扫描后，在4°C下在10%EDTA中脱钙膝关节至少2周，每周更换溶液两次。
   2. 将样品嵌入石蜡中。有关处理和潜伏期，请参阅 补充文件1。
   3. 在旋转切片机上切割石蜡包埋样品的5μm冠状切片（见 材料表）。
   4. 选择胫骨和股骨髁相交区域的部分（图2D）。在关节的三个等距区域中选取两个截面。
      注意:本研究中评分的部分是在相距80-100μm的区域选择的。
   5. 按照以下步骤用Safranin-O和Fast绿色（见 材料表）染色切片。
      1. 通过将切片（按上述顺序）浸没在二甲苯中5分钟（2x），100%乙醇2分钟，95%乙醇2分钟，80%乙醇2分钟和70%乙醇2分钟来脱蜡切片。
      2. 用过滤的苏木精（见 材料表）染色30秒。然后用自来水冲洗5分钟（三次）。
      3. 用斯科特缓冲液（2g碳酸氢钠和10g硫酸镁在1L蒸馏水中）洗涤2分钟。用"自来水"冲洗5分钟（三次）。
      4. 用0.2%快绿染色4分钟。浸入1%冰醋酸中，五次（每次新鲜制作）。用自来水快速冲洗。
      5. 用0.5%Safranin-O染色5分钟。用95%乙醇冲洗。在100%乙醇中脱水切片3分钟，然后在二甲苯中脱水3分钟。
   6. Glasson等人对软骨¹⁹ 和Jackson等人对滑膜炎²⁰的评分部分如中所述。
      注意:存在其他定量方法，例如Pinamont等人基于计算机的定量²¹。
   7. 使用两个不同的评分器验证评分系统，对实验视而不见。

结果

将后部手术/OA腿的每体重负荷百分比与对侧/控制腿进行比较。尽管其他参数也可能产生显着差异，例如手术干预后前爪负荷的增加，但后爪负荷的持续变化表明更喜欢使用一条腿而不是另一条腿，并且是小鼠由于OA发展而显着不适的更直接指标。在诱导后8周内，DMM模型中的后腿负荷没有显着变化，而DCS小鼠在干预后2周显着偏爱对侧/对照腿（图3A）。

通过聚焦胫骨髁内侧负荷区域下的体积来分析软骨下骨。在这里，我们通过确定感兴趣区域内矿化骨的百分比来评估该区域的骨密度，并计算对侧和同侧腿之间的比率。该比率表明，两种模型在诱导后 4 周均增加了患肢的骨密度（比率高于 1）（图 3B）。骨赘的出现在DCS模型中更为突出，与干预后2周的DMM模型相比，骨赘的数量和体积显着增加（图3C，D）。DCS在诱导后4周出现内侧胫骨和股骨间室软骨损伤升高以及滑膜炎（图3E，F）。

图1:诱导小鼠创伤后OA的手术干预。 连续图像代表程序的不同阶段。（A） 通过在髌韧带内侧并远离韧带插入 11 号手术刀刀片来切割膝盖周围浅膜的关节囊暴露。这将暴露髌下脂肪垫。（B）内侧半月板韧带的识别和横切。要识别韧带，请将髌韧带向外侧移动，然后将脂肪垫向上推。这允许将韧带可视化为胫骨髁上方的一条小水平白线（此处用黑色箭头表示）。为了切断韧带，将弹簧剪刀的下刀片放在韧带下方，注意不要损坏软骨。将半月板向内侧移动以显示胫骨髁。（C）刮擦暴露的软骨表面并闭合伤口。为了刮擦软骨，将微刀片插入后侧，在那里它接触软骨，然后向前向关节的前部移动。划痕完成后，将皮肤拉过膝盖，并通过皮下缝合或伤口夹缝合伤口。 请点击此处查看此图的大图。

图2:小鼠骨关节炎的评估 。 （A）动态承重包括将压力垫上的载荷与相应的爪子相匹配。然后，负载表示为总重量的百分比。（B）通过选择内侧胫骨髁负荷区域中感兴趣的体积并选择软骨下板或小梁骨来测量软骨下骨。这些图像的分辨率为4.5μm。 （C）在采集的μCT图像的三维视图中鉴定和量化骨赘。通过选择描绘骨赘边缘的ROI来测量骨赘的体积。骨密度计算为每个骨赘体积的骨体积。这里展示的图像以2μm的分辨率拍摄，但定量通常以4.5μm的分辨率完成。（D）软骨和滑膜炎评分取自用Safranin-O和Fast Green染色的6μm切片。小鼠膝盖的冠状部分，所有象限都用黑框标记，可见以进行评分，并显示内侧的放大倍数。膝关节内侧周围的滑膜炎也可见，尤其是移位半月板上方和下方。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:DMM 和 DCS 模型中 OA 的代表性评估。 （A） 在诱导后长达 8 周内测量的 DWB，由同一专家操作员进行的实验。负载表示为操作/OA负载与对侧/控制负载之间的比率。两条腿的配对 t 检验也显示在假（灰色）、DMM（蓝色）和 DCS（粉红色）模型中。手术干预后 4 周进行 μCT 分析。（B）手术干预后4周分析软骨下骨，表示为同侧与对侧%BV / TV的比率。（C）诱导后2周分析骨赘数量和（D）骨赘体积。诱导（E）内侧胫骨和股骨关节软骨软骨软骨损伤和（F）滑膜炎后4周的组织学评估使用标准化方法^{评分19，20}。数据表示为平均值±标准差，n ≥ 5。通过重复测量方差分析与Šídák检验校正（A）、配对t检验（A）或标准学生t检验（B-F）对数据进行比较。*P < 0.05， **P < 0.01， ****P < 0.001， ns = 不显著。请点击此处查看此图的大图。

补充文件1:石蜡包埋的处理和孵育条件。请点击此处查看此图的大图。

讨论

为了进行创伤后骨关节炎（PTOA）的手术诱导，强烈建议助手的支持（例如，在操作者专注于手术时准备小鼠）。这有助于无菌手术，从而降低感染风险并使干预在大型实验中更有效。在手术过程中很容易失去焦点平面，因此包括用于聚焦的踏板的显微镜是帮助在整个手术过程中保持无菌的宝贵功能。鼠标和膝盖的位置至关重要。膝盖必须朝上并充分弯曲，以最大限度地打开膝关节空间，便于更容易进入韧带，以引入微刀片来刮擦髁突表面。识别MMTL可能具有挑战性，特别是当脂肪垫比平时大或有少量出血时。为避免出血，请向上推动脂肪垫以防止撕裂和随后的出血。如果脂肪垫很大，这可能需要更长的时间，但耐心地继续向上推。

MMTL非常靠近胫骨髁，因此在将弯曲弹簧剪刀的下刀片放置在MMTL下方时，必须注意不要伤害软骨。弯曲的叶片应指向内侧，略微向上，平行于髁突。为了最好地切割MMTL，请确保剪刀锋利。检查半月板在切断韧带后是否可以向内侧移动，因为有时会留下需要进一步切割的小附件。当引入微刀片刮擦髁突时，它必须垂直于髁突。使第一次划痕靠近关节中间，但注意不要损坏前交叉韧带。然后向内侧移动，然后在半月板后面移动。划痕可能在软骨上显示为微弱的白线。因为我们通常使用夹子，所以初始切口是在侧面进行的，因此在闭合伤口后将夹子定位在腿的一侧。这样可以避免夹子在鼠标恢复运动时摩擦膝盖。使用缝合线时，强烈建议使用皮下缝合。如果使用外部缝线，小鼠很可能会啃缝线并打开伤口，这将增加感染的机会。如果做得好，这种手术从切口到伤口闭合的时间不得超过5-10分钟，从而最大限度地减少软骨的暴露和可能发生的任何其他不受控制的损伤。手术后，小鼠恢复得非常快，几乎可以立即爬进笼子并正常走动。如果小鼠不活跃，应咨询该单位的适当专家。

对于疼痛的行为评估，评估了动态负重。然而，这种方法可能被认为不如其他诱发性疼痛试验（如冯弗雷试验¹⁵）敏感。建议使用多种方法来监测和评估疼痛。干预DCS后2周观察到的变化，即使短暂，也表明与健康腿相比，OA腿的负荷普遍降低。因此，DCS干预后2周可用于评估小鼠模型中的早期骨关节炎或损伤疼痛。通过μCT可视化矿化骨赘可以进行三维定量，也可以与组织学切片¹²相匹配，为骨赘出现和进化的研究增加了另一个维度。在我们的组中，在DMM模型中，操作员之间和内部的骨赘存在是可变的（2.3 ± 1 vs. 1.2 ± 1，n > 7，P = 0.0183），而DCS的诱导在所有情况下都强烈导致骨赘生成，而与操作员无关（2.6 ± 0.7 vs. 2.4 ± 0.5，n > 7，P = 0.711）。 此外，与DMM相比，DCS模型中的骨赘明显更多，更大。因此，DCS是研究骨赘形成的理想模型。骨硬化症的定量仅限于软骨下骨的负荷区域也是检测微小变化的改进。将手术腿的内侧隔室与对侧腿进行比较也提供了一种针对该特定小鼠的内在骨表型进行标准化的方法¹²。在DCS模型中添加软骨划痕是在手术过程中诱导聚焦软骨损伤的受控手段，从而加速疾病的许多方面。涉及故意损伤软骨本身的实验程序的后果之一是，需要在软骨分级系统中排除或调整这种人为损伤。由于这种限制，如果研究的主要目的是了解骨关节炎对软骨本身的影响，我们不推荐这种模型。最后，还强烈建议至少两名盲法评分员对软骨损伤和滑膜炎评分进行评分。这验证并增强了评分系统的标准化。

这项研究的一个局限性是，比较DCS和DMM模型的所有参数的变异程度没有得到充分评估。未来将通过更广泛的研究来解决这个问题，其中还可能包括评估不同机构经营者之间的差异。

总之，当前DCS模型中加速的OA发病机制允许表征创伤后OA，并提供了一个强大而强大的研究工具来研究和阐明驱动这种慢性衰弱关节疾病的潜在OA病理生理机制。此外，它使OA能够在更短的时间内被探索，重点是骨植物发生，OA疼痛以及软骨损伤对整个关节的影响。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 scalpel blade (and scalpel handle).	World precision instruments	500240	access the joint capsule
15° Cutting Angle microsurgical stab knife	MSP	REF7503	scratch the cartilage
6-0 vicryl rapide	Any medical supplies provider	-	alternative method to close wound
Anaesthetic rig	Generic (many different suppliers)	-
Antibacterial skin clenser (Hibiscrub)	Amazon	-	To sterilise surgical skin area
Applicator for 7 mm clips	World precision instruments	500343	close the wound
Balance	Generic (many different suppliers)	-	To weigh mouse
Blunt curved forceps	Fine science tools	500232	move the patellar ligament to the side
Buprenorphine (Vetergesic)	Supplied by unit as it is a prescription drug	-	Analgesia
CT analyser	Bruker	3D.SUITE software	Software
Ctvol	Bruker	3D.SUITE software	Software
Data viewer	Bruker	3D.SUITE software	Software
Dynamic weight bearing equipment	Bioseb	BIO-DWB-DUAL	Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis
EDTA	Merck	E9884	10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4
Ethanol	Generic (many different suppliers)	-	for embedding decalcified bones
Fast Green FCF	Merck	F7252	For staining sections
Glacial acetic acid	Merck	1005706	For stianing sections
Haematoxylin solution	Merck	GHS132	Nuclear staining in paraffin sections.
Hoskins #21 micro-tweezers.	Cameron surgical limited	PHF1085	move the fat pad
Isofluorane	Supplied by unit as it is a prescription drug	-
Mice	Charles river	-	C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit)
Microcomputed tomography scanner	Bruker	SKYSCAN 1272 CMOS	µCT
Micropore surgical paper tape	FisherScientific	12787597	hold leg in position
Paraffin wax	Generic (many different suppliers)	-	for embedding decalcified bones
Reflex 7 mm stainless steel wound clips or	Fine science tools	12032-07	close the wound
Remover for 7 mm clips	World precision instruments	500347	remove wound clips
Rotary Microtome	Generic (many different suppliers)	-	To cut section of Paraffin embedded tissue.
Safranin-O	Merck	S2255	For staining sections
Serrated curved forceps	Fine science tools	15915	hold the skin
Sterile Drape	Generic (many different suppliers)	-	To ensure sterility of surgical area
Sterile Drape with key hole	Generic (many different suppliers)	-	To cover mouse and expose leg
Sterile saline	Generic (many different suppliers)
Sterile surgical drape	Generic (many different suppliers)	-	maintain sterile environment for surgical tools
Sterile surgical drape with key hole	Generic (many different suppliers)	-	cover the mouse and keep leg through key hole
Straight Scissors	World precision instruments	14393	open the wound
Surgical microscope.	Generic (many different suppliers)	-	Adjustable focus.
Vannas spring scissors with 2 mm blades.	Fine science tools	15000-04	cut the MMTL
Xylene	Generic (many different suppliers)	-	for embedding decalcified bones