JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح هذا البروتوكول الحقن الدقيق لعديد السكاريد الشحمي في منطقة بطين الدماغ في نموذج يرقات الزرد لدراسة الاستجابة الالتهابية العصبية الناتجة والسمية العصبية.

Abstract

الالتهاب العصبي هو لاعب رئيسي في الاضطرابات العصبية المختلفة ، بما في ذلك الأمراض التنكسية العصبية. لذلك ، من الأهمية بمكان البحث وتطوير نماذج بديلة للالتهابات العصبية في الجسم الحي لفهم دور الالتهاب العصبي في التنكس العصبي. في هذه الدراسة ، تم تطوير نموذج يرقات الزرد للالتهاب العصبي بوساطة الحقن المجهري البطيني لعديد السكاريد الشحمي (LPS) للحث على الاستجابة المناعية والسمية العصبية والتحقق من صحته. تم استخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا elavl3: mCherry و ETvmat2: GFP و mpo: EGFP للقياس الكمي في الوقت الفعلي لصلاحية الخلايا العصبية في الدماغ عن طريق التصوير المباشر الفلوري المدمج مع تحليل شدة التألق. تم تسجيل السلوك الحركي ليرقات الزرد تلقائيا باستخدام مسجل تتبع الفيديو. تم التحقيق في محتوى أكسيد النيتريك (NO) ، ومستويات تعبير mRNA للسيتوكينات الالتهابية بما في ذلك interleukin-6 (IL-6) ، interleukin-1β (IL-1β) ، وعامل نخر الورم البشري α (TNF-α) لتقييم الاستجابة المناعية التي يسببها LPS في رأس الزرد اليرقات. في 24 ساعة بعد حقن البطين الدماغي من LPS ، لوحظ فقدان الخلايا العصبية ونقص الحركة في يرقات الزرد. بالإضافة إلى ذلك ، زاد الالتهاب العصبي الناجم عن LPS من عدم إطلاق وتعبير mRNA ل IL-6 و IL-1β و TNF-α في رأس يرقات الزرد بعد 6 أيام من الإخصاب (dpf) ، وأدى إلى تجنيد العدلات في دماغ الزرد. في هذه الدراسة ، تم تحديد حقن الزرد مع LPS بتركيز 2.5-5 مجم / مل عند 5 dpf كحالة مثالية لمقايسة الالتهاب العصبي الدوائي. يقدم هذا البروتوكول منهجية جديدة وسريعة وفعالة للحقن المجهري للبطين الدماغي من LPS للحث على التهاب عصبي بوساطة LPS والسمية العصبية في يرقة الزرد ، وهو أمر مفيد لدراسة الالتهاب العصبي ويمكن استخدامه أيضا كفحص عالي الإنتاجية في الجسم الحي لفحص المخدرات.

Introduction

تم وصف الالتهاب العصبي بأنه عامل حاسم مضاد للأعصاب يشارك في التسبب في العديد من الأمراض التنكسية العصبية في الجهاز العصبي المركزي (CNS)1. بعد الإهانات المرضية ، قد يؤدي الالتهاب العصبي إلى عواقب سلبية مختلفة ، بما في ذلك تثبيط تكوين الخلايا العصبية وتحريض موت الخلايا العصبية 2,3. في العملية الكامنة وراء الاستجابة لتحريض الالتهاب ، يتم إفراز العديد من السيتوكينات الالتهابية (مثل TNF-α و IL-1β و IL-6) في الفضاء خارج الخلية وتعمل كمكونات حاسمة في موت الخلايا العصبية وقمع تكوين الخلايا العصبية4،5،6.

الحقن الدقيق لوسطاء الالتهاب (مثل IL-1β و L-arginine والسموم الداخلية) في الدماغ يمكن أن يسبب تقليل الخلايا العصبية والتهاب الأعصاب7،8،9. عديد السكاريد الشحمي (LPS ، الشكل 1) ، وهو سم داخلي ممرض موجود في جدار الخلية للبكتيريا سالبة الجرام ، يمكن أن يحفز الالتهاب العصبي ، ويؤدي إلى تفاقم التنكس العصبي ، ويقلل من تكوين الخلايا العصبية في الحيوانات10. أدى حقن LPS مباشرة في الجهاز العصبي المركزي لدماغ الفأر إلى زيادة مستويات أكسيد النيتريك والسيتوكينات المؤيدة للالتهابات ومنظمات أخرى11. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي الحقن التجسيمي ل LPS في بيئة الدماغ المحلية إلى الإفراط في إنتاج الجزيئات السمية العصبية ، مما يؤدي إلى ضعف الوظيفة العصبية والتطور اللاحق للأمراض التنكسية العصبية10،12،13،14،15. في مجال علم الأعصاب ، تعد الملاحظات المجهرية الحية والزمنية للعمليات الخلوية والبيولوجية في الكائنات الحية ضرورية لفهم الآليات الكامنة وراء التسبب في المرض والعمل الدوائي16. ومع ذلك ، فإن التصوير المباشر لنماذج الفئران من الالتهابات العصبية والسمية العصبية مقيد بشكل أساسي بعمق الاختراق البصري المحدود للفحص المجهري ، والذي يمنع التصوير الوظيفي والمراقبة الحية للعمليات التنموية17،18،19. لذلك ، فإن تطوير نماذج بديلة للالتهابات العصبية له أهمية كبيرة لتسهيل دراسة التطور المرضي ، والآلية الكامنة وراء الالتهاب العصبي والتنكس العصبي ، عن طريق التصوير الحي.

برز الزرد (Danio rerio) كنموذج واعد لدراسة الالتهاب العصبي والتنكس العصبي بسبب نظام المناعة الفطري المحفوظ تطوريا ، والشفافية البصرية ، وحجم القابض الجنيني الكبير ، وقابلية السحب الجيني ، ومدى ملاءمته للتصوير في الجسم الحي 19،20،21،22،23 . قامت البروتوكولات السابقة إما بحقن LPS مباشرة في صفار وبطين الدماغ الخلفي لأسماك الزرد اليرقية دون تقييم ميكانيكي ، أو ببساطة إضافة LPS إلى مياه الأسماك (وسط الاستزراع) للحث على استجابة مناعية جهازية قاتلة24،25،26،27. هنا ، قمنا بتطوير بروتوكول للحقن الدقيق ل LPS في البطينين الدماغيين ، لتحفيز استجابة مناعية فطرية أو سمية عصبية في يرقات الزرد بعد 5 أيام من الإخصاب (dpf). تتجلى هذه الاستجابة من خلال فقدان الخلايا العصبية ، وعجز السلوك الحركي ، وزيادة إطلاق أكسيد النتريت ، وتفعيل التعبير الجيني الالتهابي ، وتجنيد العدلات في دماغ الزرد في 24 ساعة بعد الحقن.

Protocol

تم الحصول على سلالات الزرد من النوع البري AB والزرد المعدلة وراثيا elavl3: mCherry و ETvmat2: GFP و mpo: EGFP من معهد العلوم الطبية الصينية (ICMS). تم منح الموافقة الأخلاقية (UMARE-030-2017) للتجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات البحوث الحيوانية ، جامعة ماكاو ، ويتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوان.

1. جنين الزرد وتربية اليرقات

  1. توليد أجنة الزرد (200-300 جنين لكل تزاوج) عن طريق التزاوج الزوجي الطبيعي كما ورد سابقا28.
  2. تحضير ماء البيض (E3) مرق متوسط (60×) عن طريق إذابة 34.8 جم من كلوريد الصوديوم ، 1.6 جم من KCl ، 5.8 جم من CaCl 2 · 2H 2 O ، و 9.78 جم من MgCl 2 · 6H 2 O في ddH 2 O إلى حجم نهائي قدره 2 لتر وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 باستخدام NaOH و HCl. لتحضير تركيز العمل لوسط E3 (1×) ، قم بتخفيف المخزون 60 مرة في ddH2O. يخزن عند 28.5 درجة مئوية عندما لا يكون قيد الاستخدام.
  3. استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل أجنة الزرد إلى طبق يحتوي على وسط E3. رفع الأجنة عند 28.5 درجة مئوية في حاضنة ومراقبة نموها وصحتها. قم بإزالة الأجنة الميتة واستبدل وسط E3 غير النظيف بوسط طازج يوميا.
  4. بالنسبة لتجارب تصوير أسماك الزرد ، استخدم ماصة نقل بلاستيكية لجمع أجنة 0-2 ساعة بعد الإخصاب (hpf) (حوالي 200 بيضة) في حوالي 15 مل من وسط 1× E3 يحتوي على 0.003٪ N-phenylthiourea (PTU).
    ملاحظة: PTU يمكن أن تمنع تشكيل الميلانوفورات أثناء التطور الجنيني29. يمكن أن يؤدي علاج الأجنة باستخدام PTU أثناء التطور الجنيني إلى تحسين اكتشاف الإشارات في الفحص المجهري أو التعبير عن التألق30.
  5. الحفاظ على أجنة الزرد في ظل الظروف المذكورة أعلاه حتى تصل الأجنة إلى مرحلة اليرقات التنموية المطلوبة.

2. التحضير للحقن المجهري

  1. استعد للحقن عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجتذب الماصة الدقيقة (انظر جدول المواد) ، باتباع بروتوكول الخطوات الخمس لسحب الأنبوب الشعري الزجاجي (الجدول 1).
  2. افتح طرف الإبرة (الشعيرات الدموية الزجاجية ذات الجدار الرقيق [3.5 بوصة] بخيوط ، OD 1.14 مم) إلى الحجم المناسب بزاوية باستخدام ملقط (الشكل 2 أ).
  3. املأ الإبرة ب 0.1 مل من الزيت المعدني لضمان عدم وجود فقاعات.
  4. قم بإزالة الغطاء اللولبي للإبرة الفولاذية لجهاز الحقن المجهري. قم بمحاذاة فتحة الإبرة الزجاجية مع الإبرة الفولاذية ثم شد الغطاء اللولبي. قم بتركيب جهاز الحقن المجهري بالإبرة المحمل في مناور دقيق (انظر جدول المواد).
  5. اضبط موضع جهاز الحقن المجهري بحيث يمكن للمناور الدقيق تحريك الجهاز بمرونة تحت المجهر. تفريغ كمية معينة من زيت البارافين لجعل الإبرة الفولاذية تدخل الأنبوب الزجاجي الشعري.
  6. قم بإسقاط محلول الحقن (مثل 1× PBS أو 5 مجم / مل LPS) على شريحة زجاجية معقمة بنسبة 70٪ من الإيثانول واضبط جهاز الحقن الدقيق بحيث يتم إدخال الطرف في قطرة السائل. تحميل ~ 2 ميكرولتر من محلول الحقن في الإبرة.
  7. قم بإعداد المعالج الدقيق (إعدادات الضبط الدقيقة لأعلى ولأسفل ولليسار ولليمين) بحيث يكون طرف إبرة جهاز الحقن المجهري في نفس مجال الرؤية مثل اليرقات عند التكبير العالي (الشكل 2 ب).

3. تصاعد الزرد للحقن المجهرية

ملاحظة: يحدث نمو دماغ الزرد في حدود 3 dpf وينضج عند 5 dpf مع نظام عصبي مركزي متطور31,32. لذلك ، فإن 5 يرقات dpf مناسبة بالفعل لدراسة الأضرار العصبية بوساطة LPS بالإضافة إلى الاستجابات السلوكية والالتهابية.

  1. حقن يرقات الزرد في غضون 30 دقيقة تقريبا من الوصول إلى مرحلة الاهتمام ، للحفاظ على اتساق توقيت الحقن.
  2. لتخدير يرقات الزرد ، يمزج التريكايين مع ماء حوض السمك النظيف (التركيز النهائي 0.02٪ وزن / وزن التريكائين).
  3. تذوب محلول 2٪ أغاروز في ddH2O باستخدام الميكروويف. صب الأغاروز المنصهر في طبق بلاستيكي. يمكن تخزين الطبق البلاستيكي المطلي بالأغاروز بنسبة 2٪ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  4. استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل اليرقات المخدرة إلى وسط الطبق البلاستيكي المطلي بالأغاروز بنسبة 2٪. قم بتوجيه اليرقات المركبة بحيث يكون جانب الدماغ لأعلى للوصول إلى الإبرة.

4. حقن البطين الدماغي

  1. اضبط تكبير المجهر بحيث يتم عرض بنية البطين الدماغي لسمك الزرد بوضوح في مجال الرؤية (الشكل 2 ب).
  2. ضع الإبرة بعناية فوق نسيج الدماغ (الشكل 2 ج).
  3. ثقب جلد دماغ الزرد بطرف الإبرة ببطء باستخدام micromanipulator.
  4. اضغط على دواسة القدم لإخراج 1 nL من 1x PBS أو تركيزات مختلفة من LPS (1.0 و 2.5 و 5.0 مجم / مل) (انظر جدول المواد). يتم عرض صور حقن البطين الناجحة التي تم فيها حقن البطين الدماغي ب 1 nL من صبغة إيفانز الزرقاء بنسبة 1٪ (مخففة في PBS) كمثال (الشكل 2D). نقل اليرقات لتنظيف وسط E3 مباشرة بعد الحقن. بعد 24 ساعة ، اجمع اليرقات للتصوير المجهري ، والفحص السلوكي للقاطرة ، وتحديد المؤشرات الأخرى.

5. التصوير

  1. تحضير محلول أغاروز منخفض الذوبان بنسبة 1.5٪ في وسط E3 وتسخينه في الميكروويف لتشكيل سائل صاف.
  2. استخدم ماصة نقل بلاستيكية نظيفة لنقل اليرقات إلى شريحة زجاجية وإزالة أكبر قدر ممكن من الماء.
  3. استخدم ماصة نقل بلاستيكية لإضافة قطرة من 1.5٪ من الأغاروز منخفض الذوبان إلى اليرقات.
    ملاحظة: قم بتبريد الأغاروز منخفض الذوبان في الماصة لفترة من الوقت قبل إضافته حتى لا تجرح اليرقات.
  4. استخدم إبرة حقنة سعة 1 مل لتوجيه اليرقات. انتظر حتى يبرد الأغاروز ويتصلب قبل بدء التصوير.
  5. مراقبة وتصوير منطقة الخلايا العصبية في الدماغ كله من Tg (ETvmat2: EGFP) و Tg (elavl3: mCherry) الزرد ، وكذلك تجنيد العدلات في دماغ الزرد Tg (mpo: EGFP) تحت مجهر ستيريو مضان (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: إعدادات المجهر الفلوري المستخدمة للتصوير موضحة أدناه. Tg (ETvmat2: EGFP) دماغ الزرد (الطول الموجي للإثارة: 450-490 نانومتر ، الطول الموجي للانبعاث: 500-550 نانومتر ، التكبير البصري: 100x) ؛ Tg (elavl3: mCherry) دماغ الزرد (الطول الموجي للإثارة: 541-551 نانومتر ، الطول الموجي للانبعاث: 590 نانومتر ، التكبير البصري: 100x) ؛ Tg (mpo: EFGP) دماغ الزرد (الطول الموجي للإثارة: 450-490 نانومتر ، الطول الموجي للانبعاث: 500-550 نانومتر ، التكبير البصري: 63x).
  6. قياس وتحليل شدة التألق وطول منطقة الخلايا العصبية Ra في Tg (ETvmat2: EGFP) الزرد وشدة التألق للخلايا العصبية في دماغ الزرد Tg (elavl3: mCherry) باستخدام برنامج ImageJ. عد يدويا العدلات في منطقة الدماغ من الزرد Tg (mpo: EFGP).

6. تحديد علامات التعبير الجيني

  1. في 24 ساعة بعد حقن البطين الدماغي LPS ، تابع تحديد علامات التعبير الجيني. للقيام بذلك ، تخدير يرقات الزرد بنسبة 0.02٪ تريكايين (كما هو مذكور في الخطوة 3.2).
  2. استخدم حقنتين سعة 1 مل لفصل أجزاء الرأس من اليرقات (40 يرقة لكل مجموعة) بدون مناطق كيس العين والصفار (الشكل 2E).
  3. استخراج الحمض النووي الريبي من أجزاء رأس اليرقات.
    1. لاستخراج الحمض النووي الريبي ، قم بتجانس جزء الرأس مع 200 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد) باستخدام مطحنة الأنسجة (انظر جدول المواد) بسرعة دوران تبلغ 11000 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان.
    2. إجراء استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة الكلوروفورم الأيزوبروبانول. للقيام بذلك ، أضف 40 ميكرولتر كلوروفورم ، وهز الأنابيب بقوة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أجهزة الطرد المركزي للعينات عند 12000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    3. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد (حوالي 100 ميكرولتر) وإضافة 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول. احتضان لمدة 10 دقائق ثم أجهزة الطرد المركزي عند 12000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف .
    4. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 75٪ لغسل حبيبات الحمض النووي الريبي. دوامة العينات لفترة وجيزة ثم الطرد المركزي في 7500 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واغسل حبيبات الحمض النووي الريبي مرة أخرى.
    5. جفف حبيبات الحمض النووي الريبي في الهواء لمدة 5-10 دقائق ، ثم أضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase لإذابة حبيبات الحمض النووي الريبي. تحقق من نقاء (نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر و 280 نانومتر) وسلامة الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير (انظر جدول المواد).
  4. توليف cDNA من الحمض النووي الريبي المستخرج في الخطوة 6.3 ، باستخدام النسخ العكسي مع البادئات العشوائية (انظر جدول المواد).
    1. أضف 1 ميكرولتر من البادئات العشوائية ، و 1 ميكرولتر من dNTPs ، و 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ، والماء المقطر (الحجم الكلي إلى 12 ميكرولتر) إلى أنبوب خال من النيوكلياز. سخني الخليط إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم تبرد بسرعة على الثلج.
    2. أضف 1 ميكرولتر من 0.1 M DTT ، و 1 ميكرولتر من مثبط RNase ، و 4 ميكرولتر من 5× المخزن المؤقت للشريط الأول ، و 1 ميكرولتر من النسخ العكسي M-MLV (الحجم الكلي: 20 ميكرولتر) إلى الأنبوب. امزج الأنبوب برفق واحتضانه عند 25 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، تليها 42 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة. قم بتعطيل التفاعل عن طريق التسخين عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  5. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي على نظام qPCR (انظر جدول المواد) باستخدام مجموعة RT-qPCR المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) لتحديد التعبير عن الجينات المستهدفة (IL-1β و IL-6 و TNF-α). احتوى خليط التفاعل (20 ميكرولتر) على 10 ميكرولتر من SYBR الأخضر ، و 0.4 ميكرولتر من صبغة ROX المرجعية ، و 0.8 ميكرولتر لكل من البادئات الأمامية والخلفية ، و 6 ميكرولتر من ddH 2 O ، و2ميكرولتر من قالب cDNA (1 ميكروغرام). قم بإجراء تضخيم PCR في ظل الظروف: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 34 ثانية ، وبمرحلة تفكك 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، و 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية.
  6. تطبيع مستويات mRNA للجينات المستهدفة إلى مستويات جين التدبير المنزلي ، عامل الاستطالة 1 α (Ef1α). احسب مستويات التعبير لكل جين مستهدف بالطريقة 2−ΔΔCT33. يتم وصف تسلسل التمهيدي لكل جين في الجدول 2.
  7. لتحديد أكسيد النيتريك ، قم بتجانس جزء الرأس (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 6.2) في 100 ميكرولتر من PBS البارد باستخدام مطحنة الأنسجة. قم بالطرد المركزي لنظام PBS الناتج وتعليق جزء الرأس عند 12000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المحللات وقم بإجراء فحص تركيز النتريت34 باستخدام مجموعة متاحة تجاريا (انظر جدول المواد).

7. الفحص السلوكي لقاطرة الزرد

  1. في 24 ساعة بعد حقن البطين الدماغي LPS ، انقل يرقات الزرد إلى آبار صفيحة مجهرية مربعة من 96 بئرا بشكل فردي. أضف 300 ميكرولتر من وسط E3 إلى كل بئر ثم احتضن اليرقات لمدة 4 ساعات لتتأقلم مع لوحة الاختبار.
  2. انقل الصفيحة الدقيقة المحملة باليرقات إلى صندوق تتبع الزرد (انظر جدول المواد). قم بتشغيل مصدر الضوء ثم احتضان اليرقات في صندوق الاختبار لمدة 30 دقيقة للتأقلم مع البيئة.
  3. مراقبة وتسجيل سلوك الزرد باستخدام نظام تتبع الفيديو الآلي. سجل 12 جلسة (5 دقائق لكل منها ، إجمالي 1 ساعة) لكل زرك. حدد المسافة الإجمالية (تتكون من مسافات غير نشطة وصغيرة وكبيرة) على أنها المسافة (بالملليمتر) التي تحركت فيها كل سمكة خلال فترة تتبع مدتها 60 دقيقة.

8. التحليل الإحصائي

  1. إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج التحليل القياسي (انظر جدول المواد).
  2. إجراء تحليل إحصائي للاختلافات بين مجموعتين باستخدام ANOVA العادي أحادي الاتجاه. احسب معامل ارتباط بيرسون لإيجاد قوة الارتباطات. واعتبر P < 0.05 معنويا في جميع التحليلات.

النتائج

يقدم سير العمل الموصوف هنا منهجية جديدة وسريعة وفعالة لإحداث التهاب عصبي بوساطة LPS والسمية العصبية في يرقات الزرد. في هذا البروتوكول الموصوف ، تم حقن 5 أسماك الزرد dpf مع LPS (الشكل 1) في بطينات الدماغ باستخدام حاقن دقيق (الشكل 2A-C). تم التحقق من ...

Discussion

تشير كمية متزايدة من البيانات الوبائية والتجريبية إلى تورط الالتهابات البكتيرية والفيروسية المزمنة كعوامل خطر محتملة للأمراض التنكسية العصبية36. تؤدي العدوى إلى تنشيط العمليات الالتهابية والاستجابات المناعية للمضيف37. حتى لو كانت الاستجابة بمثابة آلية دفاعية ?...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصلحة مالية متنافسة.

Acknowledgements

ودعمت هذه الدراسة بمنح مقدمة من صندوق تنمية العلم والتكنولوجيا (FDCT) التابع لمنطقة ماكاو الإدارية الخاصة (المرجع رقم. FDCT0058/2019/A1 and 0016/2019/AKP)، ولجنة البحوث، جامعة ماكاو (MYRG2020-00183-ICMS and CPG2022-00023-ICMS)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81803398).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA6361
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter InjectorDrummond Scientific3-000-207
Fluorescence stereo microscopesLeicaM205 FA
GraphPad Prism softwareGraphPad SoftwareVer. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4Sigma-AldrichL3024
Manual micromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Mineral oilSigma-AldrichM5904
Mx3005P qPCR systemAgilent TechnologiesMx3005P
Nanovue plus spectrophotometerBiochrom80-2140-46
Nitrite concentration assay kitBeyotime BiotechnologyS0021M
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP4417
Programmable Horizontal Pipette PullerWorld Precision InstrumentsPMP-102
PTU (N-Phenylthiourea)Sigma-AldrichP7629
Random primersTakara3802
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064014
SYBR Premix Ex Taq II kitAccurate BiologyAG11701
The 3rd Gen TgrinderTiangenOSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mmWorld Precision InstrumentsTW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester)Sigma-AldrichA-5040
TRNzol Universal reagentTiangenDP424
Zebrafish tracking boxViewPoint Behavior Technology

References

  1. Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
  2. Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
  3. Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
  4. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  5. Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
  6. Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
  7. Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
  8. Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
  9. Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
  10. Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson's disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
  11. Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
  12. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  13. Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
  14. Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
  15. Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson's disease. Parkinson's Disease. 2011, 327089 (2011).
  16. Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
  17. Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
  18. Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
  19. Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer's disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
  20. Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
  21. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
  22. Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
  23. Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
  24. Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
  25. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
  26. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  27. Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9'-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
  28. He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
  29. Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
  30. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
  31. d'Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
  32. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  33. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  34. Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
  35. Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
  36. De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
  37. Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
  38. Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
  39. Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
  40. Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
  41. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
  42. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
  43. Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
  44. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  45. Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
  46. Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
  47. Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer's disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer's Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
  48. Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
  49. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
  50. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
  51. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  52. Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
  53. Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
  54. Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved