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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo dimostra la microiniezione di lipopolisaccaride nella regione ventricolare del cervello in un modello larvale di zebrafish per studiare la risposta neuroinfiammatoria risultante e la neurotossicità.

Abstract

La neuroinfiammazione è un attore chiave in vari disturbi neurologici, comprese le malattie neurodegenerative. Pertanto, è di grande interesse ricercare e sviluppare modelli alternativi di neuroinfiammazione in vivo per comprendere il ruolo della neuroinfiammazione nella neurodegenerazione. In questo studio, è stato sviluppato e convalidato un modello larvale di zebrafish di neuroinfiammazione mediata da microiniezione ventricolare di lipopolisaccaride (LPS) per indurre una risposta immunitaria e neurotossicità. Le linee transgeniche di zebrafish elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP sono state utilizzate per la quantificazione in tempo reale della vitalità dei neuroni cerebrali mediante imaging live a fluorescenza integrato con l'analisi dell'intensità di fluorescenza. Il comportamento locomotore delle larve di zebrafish è stato registrato automaticamente utilizzando un registratore di tracciamento video. Il contenuto di ossido nitrico (NO) e i livelli di espressione dell'mRNA delle citochine infiammatorie tra cui l'interleuchina-6 (IL-6), l'interleuchina-1β (IL-1β) e il fattore di necrosi tumorale umano α (TNF-α) sono stati studiati per valutare la risposta immunitaria indotta da LPS nella testa larvale del pesce zebra. A 24 ore dopo l'iniezione ventricolare cerebrale di LPS, sono stati osservati perdita di neuroni e deficit di locomozione nelle larve di zebrafish. Inoltre, la neuroinfiammazione indotta da LPS ha aumentato il rilascio di NO e l'espressione di mRNA di IL-6, IL-1β e TNF-α nella testa delle larve di zebrafish 6 giorni dopo la fecondazione (DPF) e ha portato al reclutamento di neutrofili nel cervello del pesce zebra. In questo studio, l'iniezione di zebrafish con LPS ad una concentrazione di 2,5-5 mg/ml a 5 dpf è stata determinata come condizione ottimale per questo test farmacologico di neuroinfiammazione. Questo protocollo presenta una metodologia nuova, rapida ed efficiente per la microiniezione di LPS nel ventricolo cerebrale per indurre neuroinfiammazione e neurotossicità mediate da LPS in una larva di zebrafish, che è utile per studiare la neuroinfiammazione e potrebbe anche essere utilizzata come test di screening farmacologico in vivo ad alto rendimento.

Introduzione

La neuroinfiammazione è stata descritta come un fattore antineurogeno cruciale coinvolto nella patogenesi di diverse malattie neurodegenerative del sistema nervoso centrale (SNC)1. A seguito di insulti patologici, la neuroinfiammazione può provocare varie conseguenze avverse, tra cui l'inibizione della neurogenesi e l'induzione della morte delle cellule neuronali 2,3. Nel processo alla base della risposta all'induzione dell'infiammazione, citochine infiammatorie multiple (come TNF-α, IL-1β e IL-6) sono secrete nello spazio extracellulare e agiscono come componenti cruciali nella morte neuronale e nella soppressione della neurogenesi 4,5,6.

La microiniezione di mediatori dell'infiammazione (come IL-1β, L-arginina ed endotossine) nel cervello può causare riduzione delle cellule neuronali e neuroinfiammazione 7,8,9. Il lipopolisaccaride (LPS, Figura 1), un'endotossina patogena presente nella parete cellulare dei batteri Gram-negativi, può indurre neuroinfiammazione, esacerbare la neurodegenerazione e ridurre la neurogenesi negli animali10. L'iniezione di LPS direttamente nel SNC del cervello del topo ha aumentato i livelli di ossido nitrico, citochine pro-infiammatorie e altri regolatori11. Inoltre, l'iniezione stereotassica di LPS nell'ambiente cerebrale locale può indurre un'eccessiva produzione di molecole neurotossiche, con conseguente compromissione della funzione neuronale e successivo sviluppo di malattie neurodegenerative 10,12,13,14,15. Nel campo delle neuroscienze, le osservazioni microscopiche dal vivo e nel tempo dei processi cellulari e biologici negli organismi viventi sono cruciali per comprendere i meccanismi alla base della patogenesi e dell'azione farmacologica16. Tuttavia, l'imaging dal vivo di modelli murini di neuroinfiammazione e neurotossicità è fondamentalmente limitato dalla limitata profondità di penetrazione ottica della microscopia, che preclude l'imaging funzionale e l'osservazione dal vivo dei processi di sviluppo17,18,19. Pertanto, lo sviluppo di modelli alternativi di neuroinfiammazione è di grande interesse per facilitare lo studio dello sviluppo patologico e del meccanismo alla base della neuroinfiammazione e della neurodegenerazione, mediante live imaging.

Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un modello promettente per studiare la neuroinfiammazione e la neurodegenerazione grazie al suo sistema immunitario innato evolutivamente conservato, alla trasparenza ottica, alle grandi dimensioni della frizione embrionale, alla trattabilità genetica e all'idoneità per l'imaging in vivo 19,20,21,22,23 . I protocolli precedenti hanno iniettato direttamente LPS nel tuorlo e nel ventricolo posteriore del pesce zebra larvale senza valutazione meccanicistica, o semplicemente aggiunto LPS all'acqua del pesce (terreno di coltura) per indurre una risposta immunitaria sistemica letale24,25,26,27. Qui, abbiamo sviluppato un protocollo per la microiniezione di LPS nei ventricoli cerebrali, per innescare una risposta immunitaria innata o neurotossicità nelle larve di zebrafish 5 giorni dopo la fecondazione (DPF). Questa risposta è evidenziata dalla perdita di cellule neuronali, dal deficit del comportamento locomotore, dall'aumento del rilascio di ossido di nitrito, dall'attivazione dell'espressione genica infiammatoria e dal reclutamento di neutrofili nel cervello del pesce zebra a 24 ore dopo l'iniezione.

Protocollo

Le linee di zebrafish selvatico AB e zebrafish transgenico elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP sono state ottenute dall'Istituto di scienze mediche cinesi (ICMS). L'approvazione etica (UMARE-030-2017) per gli esperimenti sugli animali è stata concessa dal Comitato etico per la ricerca sugli animali, Università di Macao, e il protocollo segue le linee guida istituzionali per la cura degli animali.

1. Embrioni di zebrafish e allevamento larvale

  1. Generare embrioni di zebrafish (200-300 embrioni per accoppiamento) mediante accoppiamento naturale a coppie come precedentemente riportato28.
  2. Preparare il brodo medio di acqua d'uovo (E3) (60×) sciogliendo 34,8 g di NaCl, 1,6 g di KCl, 5,8 g di CaCl 2·2H 2 O e 9,78 g di MgCl 2·6H 2 O in ddH 2 O fino ad un volume finale di 2 L e regolare il pH a 7,2 utilizzando NaOH e HCl. Per preparare la concentrazione di lavoro del mezzo E3 (1×), diluire il brodo 60 volte in ddH2O. Conservare a 28,5 °C quando non in uso.
  3. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per trasferire gli embrioni di zebrafish in un piatto contenente terreno E3. Allevare gli embrioni a 28,5 °C in un'incubatrice e monitorarne lo sviluppo e la salute. Rimuovere gli embrioni morti e sostituire quotidianamente il mezzo E3 sporco con il terreno fresco.
  4. Per gli esperimenti di imaging del pesce zebra, utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per raccogliere embrioni post-fecondazione (HPF) 0-2 ore (circa 200 uova) in circa 15 ml di terreno 1× E3 contenente 0,003% di N-feniltiourea (PTU).
    NOTA: PTU può inibire la formazione di melanofori durante l'embriogenesi29. Il trattamento degli embrioni con PTU durante l'embriogenesi può migliorare la rilevazione del segnale in microscopia o l'espressione della fluorescenza30.
  5. Mantenere gli embrioni di zebrafish nelle condizioni di cui sopra fino a quando gli embrioni raggiungono lo stadio larvale di sviluppo desiderato.

2. Preparazione per la microiniezione

  1. Prepararsi per l'iniezione tirando i capillari di vetro usando un estrattore di micropipette (vedere Tabella dei materiali), seguendo il protocollo in cinque fasi per la trazione del tubo capillare di vetro (Tabella 1).
  2. Aprire la punta dell'ago (capillari di vetro a parete sottile [3,5 pollici] con filamento, OD 1,14 mm) alla dimensione appropriata ad angolo usando una pinza (Figura 2A).
  3. Riempire l'ago con 0,1 ml di olio minerale per assicurarsi che non ci siano bolle.
  4. Rimuovere il tappo a vite dell'ago in acciaio dell'apparecchio di microiniezione. Allineare il foro dell'ago di vetro con l'ago in acciaio e quindi serrare il tappo a vite. Montare l'apparecchio di microiniezione con ago caricato in un micromanipolatore (vedere Tabella dei materiali).
  5. Regolare la posizione dell'apparecchio di microiniezione in modo che il micromanipolatore possa spostare in modo flessibile l'apparecchio al microscopio. Scaricare un certo volume di olio di paraffina per far entrare l'ago d'acciaio nel tubo di vetro capillare.
  6. Far cadere la soluzione di iniezione (come 1× PBS o 5 mg/mL LPS) su un vetrino sterilizzato con etanolo al 70% e regolare l'apparecchio di microiniezione in modo che la punta venga inserita nella goccia liquida. Caricare ~2 μL di soluzione iniettabile nell'ago.
  7. Impostare il micromanipolatore (impostazioni di regolazione fine di su, giù, sinistra e destra) in modo che la punta dell'ago dell'apparecchio di microiniezione si trovi nello stesso campo visivo delle larve ad alto ingrandimento (Figura 2B).

3. Montaggio di zebrafish per microiniezioni

NOTA: Lo sviluppo cerebrale del pesce zebra avviene entro 3 dpf e matura a 5 dpf con un sistema nervoso centrale ben sviluppato31,32. Pertanto, le larve di 5 dpf sono già adatte per lo studio del danno neuronale mediato da LPS e delle risposte comportamentali e infiammatorie.

  1. Iniettare le larve di zebrafish entro circa 30 minuti dal raggiungimento dello stadio di interesse, per mantenere la coerenza dei tempi di iniezione.
  2. Per anestetizzare le larve di zebrafish, combinare la tricaina con acqua pulita dell'acquario (concentrazione finale dello 0,02% p/v di tricaina).
  3. Sciogliere una soluzione di agarosio al 2% in ddH2O usando un forno a microonde. Versare l'agarosio fuso in un piatto di plastica. Il piatto in plastica rivestito di agarosio al 2% può essere conservato a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
  4. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per trasportare le larve anestetizzate al centro del piatto di plastica rivestito di agarosio al 2%. Orientare le larve montate con il cervello rivolto verso l'alto per l'accesso all'ago.

4. Iniettare il ventricolo cerebrale

  1. Regolare l'ingrandimento del microscopio in modo che la struttura ventricolare cerebrale del pesce zebra sia chiaramente visualizzata nel campo visivo (Figura 2B).
  2. Posizionare l'ago con attenzione sopra il tectum cerebrale (Figura 2C).
  3. Forare lentamente la pelle del cervello del pesce zebra con la punta dell'ago usando il micromanipolatore.
  4. Premere il pedale per espellere 1 nL di 1x PBS o diverse concentrazioni di LPS (1,0, 2,5 e 5,0 mg/ml) (vedere Tabella dei materiali). Le immagini di iniezione ventricolare di successo in cui il ventricolo cerebrale è stato iniettato con 1 nL di colorante blu Evans all'1% (diluito in PBS) sono mostrate come esempio (Figura 2D). Trasferire le larve al mezzo E3 pulito immediatamente dopo l'iniezione. Dopo 24 ore, raccogliere le larve per l'imaging microscopico, il saggio comportamentale della locomotiva e la determinazione di altri indicatori.

5. Imaging

  1. Preparare una soluzione di agarosio a basso punto di fusione all'1,5% in mezzo E3 e riscaldarla in un forno a microonde per formare un liquido trasparente.
  2. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica pulita per trasportare le larve su un vetrino e rimuovere quanta più acqua possibile.
  3. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per aggiungere una goccia di agarosio a basso punto di fusione all'1,5% alle larve.
    NOTA: Raffreddare l'agarosio a basso punto di fusione nella pipetta per un po 'prima di aggiungere in modo da non ferire le larve.
  4. Utilizzare un ago da siringa da 1 mL per orientare le larve. Attendere che l'agarosio si raffreddi e si solidifichi prima di iniziare l'imaging.
  5. Osservare e fotografare la regione neuronale in tutto il cervello del pesce zebra Tg(ETvmat2:EGFP) e Tg(elavl3:mCherry), così come il reclutamento di neutrofili nel cervello del pesce zebra Tg(mpo:EGFP) al microscopio stereoscopico a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali).
    NOTA: le impostazioni del microscopio a fluorescenza utilizzate per l'imaging sono mostrate di seguito. Tg(ETvmat2:EGFP) cervello di zebrafish (lunghezza d'onda di eccitazione: 450-490 nm, lunghezza d'onda di emissione: 500-550 nm, ingrandimento visivo: 100x); Tg(elavl3:mCherry) cervello di zebrafish (lunghezza d'onda di eccitazione: 541-551 nm, lunghezza d'onda di emissione: 590 nm, ingrandimento visivo: 100x); Tg(mpo:EFGP) cervello di zebrafish (lunghezza d'onda di eccitazione: 450-490 nm, lunghezza d'onda di emissione: 500-550 nm, ingrandimento visivo: 63x).
  6. Misurare e analizzare l'intensità e la lunghezza della fluorescenza della regione del neurone Ra nel pesce zebra Tg(ETvmat2:EGFP) e l'intensità di fluorescenza dei neuroni cerebrali del pesce zebra Tg(elavl3:mCherry) utilizzando il software ImageJ. Contare manualmente i neutrofili nella regione del cervello del pesce zebra Tg (mpo: EFGP).

6. Determinazione dei marcatori di espressione genica

  1. A 24 ore dopo l'iniezione ventricolare cerebrale LPS, procedere con la determinazione dei marcatori di espressione genica. Per fare ciò, anestetizzare le larve di zebrafish con lo 0,02% di tricaina (come menzionato nel passaggio 3.2).
  2. Utilizzare due siringhe da 1 mL per separare le parti della testa delle larve (40 larve per gruppo) senza le regioni dell'occhio e del sacco vitellino (Figura 2E).
  3. Estrarre l'RNA dalle porzioni larvali della testa.
    1. Per l'estrazione dell'RNA, omogeneizzare la porzione della testa con 200 μL di reagente di estrazione dell'RNA (vedi Tabella dei materiali) usando una smerigliatrice tissutale (vedi Tabella dei materiali) ad una velocità di rotazione di 11.000 giri / min per 5 s.
    2. Eseguire l'estrazione dell'RNA utilizzando il metodo cloroformio-isopropanolo. Per fare ciò, aggiungere 40 μL di cloroformio, agitare vigorosamente i tubi e incubarli a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
    3. Trasferire la fase acquosa in un tubo fresco (circa 100 μL) e aggiungere 100 μL di isopropanolo. Incubare per 10 minuti e quindi centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
    4. Aggiungere 200 μL di etanolo al 75% per lavare il pellet di RNA. Vortice brevemente i campioni e quindi centrifugare a 7500 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e lavare nuovamente il pellet di RNA.
    5. Asciugare all'aria il pellet di RNA per 5-10 minuti, quindi aggiungere 30 μL di acqua priva di RNasi per sciogliere il pellet di RNA. Controllare la purezza (rapporto di assorbanza a 260 nm e 280 nm) e l'integrità dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume (vedi Tabella dei materiali).
  4. Sintetizzare il cDNA dall'RNA estratto nel passo 6.3, usando la trascrittasi inversa con primer casuali (vedi Tabella dei materiali).
    1. Aggiungere 1 μL di primer casuali, 1 μL di dNTPs, 1 μg di RNA e acqua distillata (volume totale a 12 μL) in una provetta priva di nucleasi. Riscaldare la miscela a 65 °C per 5 minuti e raffreddare rapidamente sul ghiaccio.
    2. Aggiungere 1 μL di 0,1 M DTT, 1 μL di inibitore della RNasi, 4 μL di tampone di primo filamento 5× e 1 μL di trascrittasi inversa M-MLV (volume totale: 20 μL) alla provetta. Mescolare delicatamente e incubare il tubo a 25 °C per 2 minuti, quindi a 42 °C per 50 minuti. Inattivare la reazione riscaldando a 70 °C per 15 minuti.
  5. Eseguire la PCR in tempo reale su un sistema qPCR (vedi Tabella dei materiali) utilizzando un kit RT-qPCR disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) per determinare l'espressione dei geni bersaglio (IL-1β, IL-6 e TNF-α). La miscela di reazione (20 μL) conteneva 10 μL di verde SYBR, 0,4 μL di colorante di riferimento ROX, 0,8 μL ciascuno degli inneschi diretti e inversi, 6 μL di ddH 2 O e2μL di cDNA modello (1 μg). Eseguire l'amplificazione PCR nelle condizioni: 95 °C per 30 s, seguiti da 40 cicli di 95 °C per 5 s e 60 °C per 34 s, e con uno stadio di dissociazione di 95 °C per 15 s, 60 °C per 60 s e 95 °C per 15 s.
  6. Normalizzare i livelli di mRNA dei geni bersaglio a quelli di un gene housekeeping, fattore di allungamento 1 α (Ef1α). Calcolare i livelli di espressione per ciascun gene bersaglio con il metodo 2−ΔΔCT33. Le sequenze di primer di ciascun gene sono descritte nella Tabella 2.
  7. Per la determinazione dell'ossido nitrico, omogeneizzare la porzione di testa (ottenuta al punto 6.2) in 100 μL di PBS freddo utilizzando una smerigliatrice tissutale. Centrifugare il PBS risultante e la sospensione della porzione di testa a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Raccogliere i lisati ed eseguire il saggio di concentrazione di nitriti34 utilizzando un kit disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).

7. Saggio comportamentale della locomotiva zebrafish

  1. A 24 ore dopo l'iniezione ventricolare cerebrale LPS, trasferire individualmente le larve di zebrafish nei pozzetti di una micropiastra quadrata a 96 pozzetti. Aggiungere 300 μL di terreno E3 a ciascun pozzetto e quindi incubare le larve per 4 ore per acclimatarsi alla piastra di prova.
  2. Trasferire la micropiastra caricata con larve nella scatola di tracciamento del pesce zebra (vedere Tabella dei materiali). Accendere la sorgente luminosa e quindi incubare le larve nella scatola di prova per 30 minuti per acclimatare l'ambiente.
  3. Monitora e registra il comportamento del pesce zebra utilizzando un sistema di tracciamento video automatizzato. Registra 12 sessioni (5 minuti ciascuna, totale 1 ora) per ogni zebrafish. Definisci la distanza totale (costituita da distanze inattive, piccole e grandi) come la distanza (in mm) che ciascun pesce ha spostato durante un periodo di tracciamento di 60 minuti.

8. Analisi statistica

  1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software di analisi standard (vedi Tabella dei materiali).
  2. Eseguire analisi statistiche delle differenze tra due gruppi utilizzando ANOVA unidirezionale ordinario. Calcolare il coefficiente di correlazione di Pearson per valutare la forza delle correlazioni. P < 0,05 è stato considerato significativo in tutte le analisi.

Risultati

Il flusso di lavoro qui descritto presenta una metodologia nuova, rapida ed efficiente per indurre neuroinfiammazione e neurotossicità mediate da LPS nelle larve di zebrafish. In questo protocollo descritto, 5 dpf zebrafish sono stati iniettati con LPS (Figura 1) nei ventricoli cerebrali utilizzando un microiniettore (Figura 2A-C). L'iniezione riuscita nel sito del ventricolo cerebrale è stata verificata utilizzando la coloraz...

Discussione

Una quantità crescente di dati epidemiologici e sperimentali implica infezioni batteriche e virali croniche come possibili fattori di rischio per le malattie neurodegenerative36. L'infezione innesca l'attivazione dei processi infiammatori e delle risposte immunitarie dell'ospite37. Anche se la risposta agisce come meccanismo di difesa, l'infiammazione iperattivata è dannosa per la neurogenesi e l'ambiente infiammatorio non consente la sopravvivenza dei neuroni neonatali

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrente.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Science and Technology Development Fund (FDCT) di Macao SAR (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 e 0016/2019/AKP), Comitato di ricerca, Università di Macao (MYRG2020-00183-ICMS e CPG2022-00023-ICMS) e National Natural Science Foundation of China (n. 81803398).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA6361
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter InjectorDrummond Scientific3-000-207
Fluorescence stereo microscopesLeicaM205 FA
GraphPad Prism softwareGraphPad SoftwareVer. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4Sigma-AldrichL3024
Manual micromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Mineral oilSigma-AldrichM5904
Mx3005P qPCR systemAgilent TechnologiesMx3005P
Nanovue plus spectrophotometerBiochrom80-2140-46
Nitrite concentration assay kitBeyotime BiotechnologyS0021M
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP4417
Programmable Horizontal Pipette PullerWorld Precision InstrumentsPMP-102
PTU (N-Phenylthiourea)Sigma-AldrichP7629
Random primersTakara3802
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064014
SYBR Premix Ex Taq II kitAccurate BiologyAG11701
The 3rd Gen TgrinderTiangenOSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mmWorld Precision InstrumentsTW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester)Sigma-AldrichA-5040
TRNzol Universal reagentTiangenDP424
Zebrafish tracking boxViewPoint Behavior Technology

Riferimenti

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