JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מדגים את המיקרו-הזרקה של ליפופוליסכריד לאזור חדר המוח במודל של זחל דג זברה כדי לחקור את התגובה הנוירו-דלקתית והרעילות העצבית המתקבלות כתוצאה מכך.

Abstract

דלקת עצבית היא שחקן מפתח בהפרעות נוירולוגיות שונות, כולל מחלות נוירודגנרטיביות. לכן, יש עניין רב לחקור ולפתח מודלים חלופיים של דלקת עצבית in vivo כדי להבין את התפקיד של דלקת עצבית בניוון עצבי. במחקר זה פותח מודל של דגי זברה זחליים של דלקת עצבית בתיווך מיקרו-הזרקה חדרית של ליפופוליסכריד (LPS) כדי לגרום לתגובה חיסונית ורעילות עצבית. קווי דגי הזברה המהונדסים elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP ו- mpo:EGFP שימשו לכימות בזמן אמת של כדאיות נוירונים במוח על ידי הדמיה חיה פלואורסצנטית המשולבת עם ניתוח עוצמת פלואורסצנטיות. ההתנהגות התנועתית של זחלי דגי זברה נרשמה באופן אוטומטי באמצעות מקליט מעקב וידאו. התוכן של תחמוצת החנקן (NO), ורמות ביטוי ה-mRNA של ציטוקינים דלקתיים, כולל אינטרלוקין-6 (IL-6), אינטרלוקין-1β (IL-1β) וגורם נמק של גידול אנושי α (TNF-α) נחקרו כדי להעריך את התגובה החיסונית הנגרמת על-ידי LPS בראש דג הזברה. ב 24 שעות לאחר הזרקת חדר המוח של LPS, אובדן של נוירונים וחוסר תנועה נצפו זחלי דגי זברה. בנוסף, דלקת עצבית הנגרמת על ידי LPS הגבירה את שחרור ה-NO ואת ביטוי ה-mRNA של IL-6, IL-1β ו-TNF-α בראש של זחלי דגי זברה לאחר ההפריה (dpf), והביאה לגיוס נויטרופילים במוח של דגי הזברה. במחקר זה, הזרקה של דגי זברה עם LPS בריכוז של 2.5-5 מ"ג/מ"ל ב-5 dpf נקבעה כתנאי האופטימלי לבדיקה פרמקולוגית זו של דלקת עצבית. פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה חדשה, מהירה ויעילה למיקרו-הזרקה של LPS בחדרי המוח כדי לגרום לדלקת עצבית בתיווך LPS ורעילות עצבית בזחל דג זברה, שהיא שימושית לחקר דלקת עצבית ויכולה לשמש גם כבדיקת סינון תרופות in vivo בתפוקה גבוהה.

Introduction

דלקת עצבית תוארה כגורם אנטי-נוירוגני חיוני המעורב בפתוגנזה של מספר מחלות נוירודגנרטיביות של מערכת העצבים המרכזית (CNS)1. בעקבות עלבונות פתולוגיים, דלקת עצבית עלולה לגרום לתוצאות שליליות שונות, כולל עיכוב של נוירוגנזה והשראת מוות של תאי עצב 2,3. בתהליך העומד בבסיס התגובה להשראת דלקת, ציטוקינים דלקתיים מרובים (כגון TNF-α, IL-1β ו-IL-6) מופרשים לחלל החוץ-תאי ופועלים כמרכיבים חיוניים במוות של תאי עצב ובדיכוי של נוירוגנזה 4,5,6.

מיקרו-הזרקה של מתווכי דלקת (כגון IL-1β, L-ארגינין ואנדוטוקסינים) למוח יכולה לגרום להפחתת תאי עצב ולדלקת עצבית 7,8,9. ליפופוליסכריד (LPS, איור 1), אנדוטוקסין פתוגני שנמצא בדופן התא של חיידקים גראם-שליליים, יכול לגרום לדלקת עצבית, להחמיר ניוון עצבי ולהפחית נוירוגנזה בבעלי חיים10. הזרקת LPS ישירות למערכת העצבים המרכזית של מוח העכבר העלתה את הרמות של תחמוצת החנקן, ציטוקינים מעודדי דלקת ומווסתים אחרים11. יתר על כן, הזרקה סטריאוטקסית של LPS לסביבת המוח המקומית עלולה לגרום לייצור מופרז של מולקולות נוירוטוקסיות, וכתוצאה מכך לתפקוד עצבי לקוי ולהתפתחות לאחר מכן של מחלות נוירודגנרטיביות 10,12,13,14,15. בתחום מדעי המוח, תצפיות מיקרוסקופיות חיות ומבוססות זמן על תהליכים תאיים וביולוגיים באורגניזמים חיים הן חיוניות להבנת המנגנונים העומדים בבסיס הפתוגנזה והפעולה הפרמקולוגית16. עם זאת, הדמיה חיה של מודלים עכבריים של דלקת עצבית ורעילות עצבית מוגבלת ביסודה על ידי עומק החדירה האופטי המוגבל של מיקרוסקופיה, המונעת הדמיה תפקודית ותצפית חיה על תהליכים התפתחותיים17,18,19. לכן, פיתוח מודלים חלופיים של דלקת עצבית הוא בעל עניין רב כדי להקל על המחקר של התפתחות פתולוגית, ואת המנגנון העומד בבסיס neuroinflammation ו ניוון עצבי, על ידי הדמיה חיה.

דג זברה (Danio rerio) התגלה כמודל מבטיח לחקר דלקת עצבית וניוון עצבי בשל מערכת החיסון המולדת השמורה אבולוציונית, שקיפות אופטית, גודל מצמד עובר גדול, אחיזה גנטית והתאמה להדמיית in vivo 19,20,21,22,23 . פרוטוקולים קודמים הזריקו LPS ישירות לחדר החלמון והמוח האחורי של דגי זברה זחליים ללא הערכה מכניסטית, או פשוט הוסיפו LPS למי דגים (מדיום תרבית) כדי לגרום לתגובה חיסונית מערכתית קטלנית24,25,26,27. כאן, פיתחנו פרוטוקול למיקרו-הזרקה של LPS לחדרי המוח, כדי לעורר תגובה חיסונית מולדת או רעילות עצבית ב-5 הימים שלאחר ההפריה (dpf) זחלי דגי הזברה. עדות לתגובה זו היא אובדן תאי עצב, גירעון בהתנהגות תנועתית, שחרור מוגבר של תחמוצת ניטריט, הפעלת ביטוי גנים דלקתיים וגיוס נויטרופילים במוח דגי הזברה 24 שעות לאחר ההזרקה.

Protocol

דגי זברה מסוג AB וקווי דגי זברה מהונדסים elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP ו- mpo:EGFP התקבלו מהמכון למדעי הרפואה הסינית (ICMS). אישור אתי (UMARE-030-2017) לניסויים בבעלי חיים ניתן על ידי ועדת האתיקה למחקר בבעלי חיים, אוניברסיטת מקאו, והפרוטוקול תואם את ההנחיות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים.

1. עובר דג זברה וגידול זחלים

  1. יצירת עוברי דגי זברה (200-300 עוברים לכל הזדווגות) על ידי הזדווגות זוגית טבעית כפי שדווח קודםלכן 28.
  2. הכינו ציר בינוני של מי ביצים (E3) (60×) על ידי המסת 34.8 גרם של NaCl, 1.6 גרם של KCl, 5.8 גרם של CaCl 2·2H 2 O, ו-9.78 גרם של MgCl 2·6H 2 O ב-ddH 2 O לנפח סופי של 2 L והתאימו את ה-pH ל-7.2 באמצעות NaOH ו-HCl. כדי להכין ריכוז עבודה של מדיום E3 (1×), יש לדלל את המלאי 60 פעמים ב-ddH2O. יש לאחסן בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש.
  3. השתמשו בפיפטה להעברת פלסטיק כדי להעביר את עוברי דגי הזברה לצלחת המכילה מדיום E3. לגדל את העוברים ב 28.5 מעלות צלזיוס באינקובטור ולעקוב אחר התפתחותם ובריאותם. הסר עוברים מתים והחלף מדיום E3 לא נקי במדיום טרי מדי יום.
  4. עבור ניסויי הדמיה של דגי זברה, השתמש בפיפטה להעברת פלסטיק כדי לאסוף עוברים של 0-2 שעות לאחר ההפריה (hpf) (כ-200 ביציות) בכ-15 מ"ל של מדיום 1× E3 המכיל 0.003% N-פנילתיוראה (PTU).
    הערה: PTU יכול לעכב היווצרות של מלנופורים במהלך embryogenesis29. טיפול בעוברים עם PTU במהלך העובר יכול לשפר את זיהוי האותות במיקרוסקופיה או ביטוי של פלואורסצנציה30.
  5. שמרו על עוברי דגי הזברה בתנאים הנ"ל עד שהעוברים יגיעו לשלב הזחל ההתפתחותי הרצוי.

2. הכנה למיקרו הזרקה

  1. התכוננו להזרקה על ידי משיכת נימי זכוכית באמצעות מושך מיקרופיפטה (ראו טבלת חומרים), בהתאם לפרוטוקול חמשת השלבים למשיכת צינור נימי זכוכית (טבלה 1).
  2. פתח את קצה המחט (נימי זכוכית דקים [3.5 אינץ'] עם נימה, OD 1.14 מ"מ) לגודל המתאים בזווית באמצעות מלקחיים (איור 2A).
  3. מלא את המחט עם 0.1 מ"ל של שמן מינרלי כדי להבטיח כי אין בועות.
  4. הסר את מכסה הבורג של מחט הפלדה של מנגנון המיקרו-הזרקה. יישר את חור מחט הזכוכית עם מחט הפלדה ולאחר מכן הידק את מכסה הבורג. הרכיבו את מנגנון המיקרו-הזרקה של המחט הטעונה במיקרומניפולטור (ראו טבלת חומרים).
  5. התאם את המיקום של מנגנון המיקרו-הזרקה כך שהמיקרומניפולטור יוכל להזיז בגמישות את המנגנון מתחת למיקרוסקופ. לפרוק נפח מסוים של שמן פרפין כדי להפוך את מחט פלדה להיכנס צינור זכוכית נימי.
  6. זרוק את תמיסת ההזרקה (כגון 1× PBS או 5 מ"ג/מ"ל LPS) על שקופית זכוכית מעוקרת ב-70% אתנול והתאם את מנגנון המיקרו-הזרקה כך שהקצה יוכנס לתוך טיפת הנוזל. טען ~ 2 μL של תמיסת הזרקה לתוך המחט.
  7. הגדר את המיקרומניפולטור (הגדרות כוונון עדינות של למעלה, למטה, שמאלה וימינה) כך שקצה המחט של מנגנון המיקרו-הזרקה נמצא באותו שדה ראייה כמו הזחלים בהגדלה גבוהה (איור 2B).

3. הרכבה של דגי זברה למיקרו-הזרקות

הערה: התפתחות המוח של דגי זברה מתרחשת בטווח של 3 dpf ומבשילה ב-5 dpf עם מערכת עצבים מרכזית מפותחתהיטב 31,32. לכן, זחלי 5 dpf כבר מתאימים לחקר נזק עצבי בתיווך LPS, כמו גם תגובות התנהגותיות ודלקתיות.

  1. להזריק לזחלי דגי הזברה תוך כ-30 דקות מרגע ההגעה לשלב העניין, כדי לשמור על עקביות תזמון ההזרקה.
  2. כדי להרדים את זחלי דגי הזברה, יש לשלב טריקיין עם מי מיכל דגים נקיים (ריכוז סופי של 0.02% w/v tricaine).
  3. ממיסים תמיסה של 2% אגרוז ב-ddH2O באמצעות מיקרוגל. יוצקים את האגרוז המותך לתוך צלחת פלסטיק. ניתן לאחסן את צלחת הפלסטיק המצופה ב-2% אגרוז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.
  4. השתמשו בפיפטה מפלסטיק כדי להעביר זחלים מורדמים למרכז צלחת הפלסטיק המצופה 2% אגרוז. כוון את הזחלים הרכובים עם צד המוח כלפי מעלה לגישה למחט.

4. הזרקת חדר המוח

  1. התאימו את ההגדלה של המיקרוסקופ כך שהמבנה החדרי במוח של דגי זברה יוצג בבירור בשדה הראייה (איור 2B).
  2. הניחו את המחט בזהירות מעל טקטום המוח (איור 2C).
  3. לנקב את העור של המוח דג זברה עם קצה המחט לאט באמצעות micromanipulator.
  4. לחץ על דוושת הרגל כדי להוציא 1 nL של 1x PBS או ריכוזים שונים של LPS (1.0, 2.5, ו 5.0 מ"ג / מ"ל) (ראה טבלת חומרים). תמונות מוצלחות של הזרקת חדרים שבהן חדר המוח הוזרק עם 1 nL של 1% צבע כחול של אוונס (מדולל ב-PBS) מוצגות כדוגמה (איור 2D). מעבירים את הזחלים למדיום E3 נקי מיד לאחר ההזרקה. לאחר 24 שעות, לאסוף את הזחלים עבור הדמיה מיקרוסקופית, בדיקה התנהגותית קטר, וקביעת אינדיקטורים אחרים.

5. הדמיה

  1. הכינו תמיסת אגרוז עם 1.5% נמס נמוך במדיום E3 וחממו אותה במיקרוגל ליצירת נוזל צלול.
  2. השתמשו בפיפטה נקייה מפלסטיק כדי להעביר את הזחלים למגלשת זכוכית ולהסיר כמה שיותר מים.
  3. השתמשו בפיפטה מפלסטיק כדי להוסיף לזחלים טיפה של 1.5% אגרוז שנמס נמוך.
    הערה: מצננים את האגרוז הנמס נמוך בפיפטה לזמן מה לפני שמוסיפים כדי לא לפצוע את הזחלים.
  4. השתמש במחט מזרק 1 מ"ל כדי לכוון את הזחלים. המתן עד שהאגרוז יתקרר ויתמצק לפני שתתחיל בהדמיה.
  5. התבונן וצלם את אזור הנוירונים בכל המוח של דגי זברה Tg(ETvmat2:EGFP) ו-Tg(elavl3:mCherry), כמו גם גיוס של נויטרופילים במוח דגי הזברה Tg(mpo:EGFP) תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים).
    הערה: הגדרות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המשמשות להדמיה מוצגות להלן. Tg(ETvmat2:EGFP) מוח דג זברה (אורך גל עירור: 450-490 ננומטר, אורך גל פליטה: 500-550 ננומטר, הגדלה חזותית: 100x); Tg(elavl3:mCherry) מוח דג זברה (אורך גל עירור: 541-551 ננומטר, אורך גל פליטה: 590 ננומטר, הגדלה חזותית: 100x); Tg(mpo:EFGP) מוח דג זברה (אורך גל עירור: 450-490 ננומטר, אורך גל פליטה: 500-550 ננומטר, הגדלה חזותית: 63x).
  6. מדוד ונתח את העוצמה והאורך הפלואורסצנטיים של אזור נוירוני Ra בדגי זברה Tg(ETvmat2:EGFP) ואת עוצמת הפלואורסצנטיות של תאי עצב במוח של דגי זברה Tg(elavl3:mCherry) באמצעות תוכנת ImageJ. ספירה ידנית של הנויטרופילים באזור המוח של דגי זברה מסוג Tg(mpo:EFGP).

6. קביעת סמני ביטוי גנים

  1. ב 24 שעות לאחר הזרקת חדר המוח LPS, להמשיך עם קביעת סמני ביטוי גנים. כדי לעשות זאת, להרדים זחלי דגי זברה עם 0.02% tricaine (כאמור בשלב 3.2).
  2. השתמשו בשני מזרקים של 1 מ"ל כדי להפריד את חלקי הראש של הזחלים (40 זחלים לקבוצה) ללא אזורי שק העיניים והחלמון (איור 2E).
  3. חלצו RNA מחלקי ראש הזחל.
    1. עבור מיצוי RNA, הומוגניות של חלק הראש עם 200 μL של מגיב מיצוי RNA (ראו טבלת חומרים) באמצעות מטחנת רקמות (ראו טבלת חומרים) במהירות סיבוב של 11,000 סל"ד למשך 5 שניות.
    2. בצע מיצוי RNA בשיטת כלורופורם-איזופרופנול. כדי לעשות זאת, להוסיף 40 μL כלורופורם, לנער את הצינורות במרץ, לדגור אותם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. מעבירים את הפאזה המימית לצינור טרי (כ-100 μL) ומוסיפים 100 μL של איזופרופנול. דגירה במשך 10 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט.
    4. הוסף 200 μL של 75% אתנול כדי לשטוף את גלולת RNA. מערבלים את הדגימות לזמן קצר ולאחר מכן צנטריפוגה ב 7500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו שוב את גלולת ה-RNA.
    5. יש לייבש באוויר את גלולת הרנ"א למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן להוסיף 30 מיקרון של מים נטולי RNase כדי להמיס את גלולת הרנ"א. בדוק את הטוהר (יחס הספיגה ב-260 ננומטר ו-280 ננומטר) ואת שלמות הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח (ראו טבלת חומרים).
  4. סינתזה של cDNA מהרנ"א שחולץ בשלב 6.3, באמצעות טרנסקריפטאז הפוך עם פריימרים אקראיים (ראו טבלת חומרים).
    1. הוסף 1 μL של פריימרים אקראיים, 1 μL של dNTPs, 1 מיקרוגרם של RNA, ומים מזוקקים (נפח כולל עד 12 μL) לצינור ללא נוקלאז. מחממים את התערובת ל-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומצננים במהירות על קרח.
    2. הוסף 1 μL של 0.1 M DTT, 1 μL של מעכב RNase, 4 μL של 5× חיץ גדיל ראשון, ו 1 μL של M-MLV טרנסקריפטאז הפוך (נפח כולל: 20 μL) לצינור. מערבבים בעדינות ודוגרים את הצינור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ולאחר מכן 42 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות. השבת את התגובה על ידי חימום ב 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  5. בצע PCR בזמן אמת במערכת qPCR (ראה טבלת חומרים) באמצעות ערכת RT-qPCR הזמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי לקבוע את הביטוי של גני המטרה (IL-1β, IL-6 ו- TNF-α). תערובת התגובה (20 μL) הכילה 10 μL של ירוק SYBR, 0.4 μL של צבע ייחוס ROX, 0.8 μL כל אחד של פריימרים קדימה ואחורה, 6 μL של ddH 2 O, ו2μL של תבנית cDNA (1 מיקרוגרם). בצע הגברה של PCR בתנאים: 95 °C למשך 30 שניות, ולאחר מכן 40 מחזורים של 95 °C למשך 5 שניות ו- 60 °C למשך 34 שניות, ועם שלב דיסוציאציה של 95 °C למשך 15 שניות, 60 °C למשך 60 שניות, ו- 95 °C למשך 15 שניות.
  6. לנרמל את רמות ה-mRNA של גני המטרה לזו של גן משק בית, גורם התארכות 1 α (Ef1α). חשב את רמות הביטוי עבור כל גן מטרה בשיטת 2−ΔΔCT33. רצפי הפריימר של כל גן מתוארים בטבלה 2.
  7. לקביעת תחמוצת החנקן, הומוגניזציה של חלק הראש (המתקבל בשלב 6.2) ב 100 μL של PBS קר באמצעות מטחנת רקמות. צנטריפוגה PBS וכתוצאה מכך מתלה חלק הראש ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. אסוף את הליזאטים ובצע בדיקת ריכוז ניטריט34 באמצעות ערכה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).

7. בדיקה התנהגותית של קטר דג זברה

  1. ב-24 שעות לאחר הזרקת חדר המוח LPS, העבירו את זחלי דגי הזברה לבארות של מיקרו-פלטה מרובעת בגודל 96 בארות בנפרד. הוסיפו 300 μL של מדיום E3 לכל באר ולאחר מכן דגרו את הזחלים למשך 4 שעות כדי להתאקלם לצלחת הבדיקה.
  2. העבירו את המיקרו-פלטה עמוסת הזחלים לתיבת המעקב של דגי הזברה (ראו טבלת חומרים). הפעל את מקור האור ולאחר מכן דגירה של הזחלים בתיבת הבדיקה במשך 30 דקות כדי לאקלם את הסביבה.
  3. נטר ותעד את התנהגות דגי הזברה באמצעות מערכת מעקב וידאו אוטומטית. הקלט 12 מפגשים (5 דקות כל אחד, סה"כ שעה) עבור כל דג זברה. הגדר את המרחק הכולל (המורכב ממרחקים לא פעילים, קטנים וגדולים) כמרחק (במ"מ) שכל דג נע במהלך תקופת מעקב של 60 דקות.

8. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנת ניתוח סטנדרטית (ראה טבלת חומרים).
  2. בצע ניתוח סטטיסטי של הבדלים בין שתי קבוצות באמצעות ANOVA חד כיווני רגיל. חשב את מקדם המתאם של פירסון כדי להעריך את חוזק המתאמים. P < 0.05 נחשב משמעותי בכל הניתוחים.

תוצאות

תהליך העבודה המתואר כאן מציג מתודולוגיה חדשה, מהירה ויעילה לגרימת דלקת עצבית בתיווך LPS ורעילות עצבית בזחלי דגי זברה. בפרוטוקול המתואר הזה, 5 דגי זברה dpf הוזרקו עם LPS (איור 1) לחדרי מוח באמצעות מיקרו-אינז'קטור (איור 2A-C). הזרקה מוצלחת לאתר חדר המ...

Discussion

כמות הולכת וגדלה של נתונים אפידמיולוגיים וניסיוניים מצביעים על זיהומים חיידקיים ונגיפיים כרוניים כגורמי סיכון אפשריים למחלות נוירודגנרטיביות36. הזיהום מעורר את ההפעלה של תהליכים דלקתיים ותגובות חיסוניות מארח37. גם אם התגובה פועלת כמנגנון הגנה, דלקת מופעלת יתר ע...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כספי מתחרה.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן לפיתוח מדע וטכנולוגיה (FDCT) של מקאו SAR (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 ו- 0016/2019/AKP), ועדת מחקר, אוניברסיטת מקאו (MYRG2020-00183-ICMS ו- CPG2022-00023-ICMS), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81803398).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA6361
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter InjectorDrummond Scientific3-000-207
Fluorescence stereo microscopesLeicaM205 FA
GraphPad Prism softwareGraphPad SoftwareVer. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4Sigma-AldrichL3024
Manual micromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Mineral oilSigma-AldrichM5904
Mx3005P qPCR systemAgilent TechnologiesMx3005P
Nanovue plus spectrophotometerBiochrom80-2140-46
Nitrite concentration assay kitBeyotime BiotechnologyS0021M
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP4417
Programmable Horizontal Pipette PullerWorld Precision InstrumentsPMP-102
PTU (N-Phenylthiourea)Sigma-AldrichP7629
Random primersTakara3802
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064014
SYBR Premix Ex Taq II kitAccurate BiologyAG11701
The 3rd Gen TgrinderTiangenOSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mmWorld Precision InstrumentsTW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester)Sigma-AldrichA-5040
TRNzol Universal reagentTiangenDP424
Zebrafish tracking boxViewPoint Behavior Technology

References

  1. Xanthos, D. N., Sandkuhler, J. Neurogenic neuroinflammation: inflammatory CNS reactions in response to neuronal activity. Nature Reviews Neuroscience. 15 (1), 43-53 (2014).
  2. Fan, L. W., Pang, Y. Dysregulation of neurogenesis by neuroinflammation: key differences in neurodevelopmental and neurological disorders. Neural Regeneration Research. 12 (3), 366-371 (2017).
  3. Kwon, H. S., Koh, S. H. Neuroinflammation in neurodegenerative disorders: the roles of microglia and astrocytes. Translational Neurodegeneration. 9 (1), 42 (2020).
  4. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nature Reviews Neuroscience. 8 (1), 57-69 (2007).
  5. Tan, E. K., et al. Parkinson disease and the immune system-associations, mechanisms and therapeutics. Nature Reviews Neurology. 16 (6), 303-318 (2020).
  6. Borsini, A., Zunszain, P. A., Thuret, S., Pariante, C. M. The role of inflammatory cytokines as key modulators of neurogenesis. Trends in Neurosciences. 38 (3), 145-157 (2015).
  7. Kouhsar, S. S., Karami, M., Tafreshi, A. P., Roghani, M., Nadoushan, M. R. Microinjection of l-arginine into corpus callosum cause reduction in myelin concentration and neuroinflammation. Brain Research. 1392, 93-100 (2011).
  8. Couch, Y., Davis, A. E., Sá-Pereira, I., Campbell, S. J., Anthony, D. C. Viral pre-challenge increases central nervous system inflammation after intracranial interleukin-1β injection. Journal of Neuroinflammation. 11, 178 (2014).
  9. Zhao, J., et al. Neuroinflammation induced by lipopolysaccharide causes cognitive impairment in mice. Scientific Reports. 9 (1), 5790 (2019).
  10. Deng, I., Corrigan, F., Zhai, G., Zhou, X. F., Bobrovskaya, L. Lipopolysaccharide animal models of Parkinson's disease: Recent progress and relevance to clinical disease. Brain Behavior and Immunity-Health. 4, 100060 (2020).
  11. Hernandez Baltazar, D., et al. Does lipopolysaccharide-based neuroinflammation induce microglia polarization. Folia Neuropathologica. 58 (2), 113-122 (2020).
  12. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental and Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  13. Castaño, A., Herrera, A. J., Cano, J., Machado, A. Lipopolysaccharide intranigral injection induces inflammatory reaction and damage in nigrostriatal dopaminergic system. Journal of Neurochemistry. 70 (4), 1584-1592 (1998).
  14. Perez-Dominguez, M., Avila-Munoz, E., Dominguez-Rivas, E., Zepeda, A. The detrimental effects of lipopolysaccharide-induced neuroinflammation on adult hippocampal neurogenesis depend on the duration of the pro-inflammatory response. Neural Regeneration Research. 14 (5), 817-825 (2019).
  15. Liu, M., Bing, G. Lipopolysaccharide animal models for Parkinson's disease. Parkinson's Disease. 2011, 327089 (2011).
  16. Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 32, 435-506 (2009).
  17. Huang, S. H., et al. Optical volumetric brain imaging: speed, depth, and resolution enhancement. Journal of Physics D: Applied Physics. 54 (32), 323002 (2021).
  18. Ahn, C., et al. Overcoming the penetration depth limit in optical microscopy: Adaptive optics and wavefront shaping. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12 (04), 1930002 (2019).
  19. Saleem, S., Kannan, R. R. Zebrafish: an emerging real-time model system to study Alzheimer's disease and neurospecific drug discovery. Cell Death Discovery. 4, 45 (2018).
  20. Hung, M. W., et al. From omics to drug metabolism and high content screen of natural product in zebrafish: a new model for discovery of neuroactive compound. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2012, 605303 (2012).
  21. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299, 157-171 (2018).
  22. Sonawane, P. M., et al. A water-soluble boronate masked benzoindocyanin fluorescent probe for the detection of endogenous mitochondrial peroxynitrite in live cells and zebrafish as inflammation models. Dyes and Pigments. 191, 109371 (2021).
  23. Sonawane, P. M., et al. Phosphinate-benzoindocyanin fluorescent probe for endogenous mitochondrial peroxynitrite detection in living cells and gallbladder access in inflammatory zebrafish animal models. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 267, 120568 (2022).
  24. Yang, L. L., et al. Endotoxin molecule lipopolysaccharide-induced zebrafish inflammation model: a novel screening method for anti-inflammatory drugs. Molecules. 19 (2), 2390-2409 (2014).
  25. Rojas, A. M., Shiau, C. E. Brain-localized and intravenous microinjections in the larval zebrafish to assess innate immune response. Bio-Protocol. 11 (7), 3978 (2021).
  26. Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental and Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
  27. Kim, E. A., et al. Anti-inflammatory effect of Apo-9'-fucoxanthinone via inhibition of MAPKs and NF-kB signaling pathway in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages and zebrafish model. International Immunopharmacology. 59, 339-346 (2018).
  28. He, Y. L., et al. Angiogenic effect of motherwort (Leonurus japonicus) alkaloids and toxicity of motherwort essential oil on zebrafish embryos. Fitoterapia. 128, 36-42 (2018).
  29. Lister, J. A. Development of pigment cells in the zebrafish embryo. Microscopy Research and Technique. 58 (6), 435-441 (2002).
  30. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
  31. d'Amora, M., Giordani, S. The utility of zebrafish as a model for screening developmental neurotoxicity. Frontiers in Neuroscience. 12, 976 (2018).
  32. Kalueff, A. V., Stewart, A. M., Gerlai, R. Zebrafish as an emerging model for studying complex brain disorders. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (2), 63-75 (2014).
  33. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  34. Zhang, B., et al. Effects of a dammarane-type saponin, ginsenoside Rd, in nicotine-induced vascular endothelial injury. Phytomedicine. 79, 153325 (2020).
  35. Chen, Y., Li, G., Law, H. C. H., Chen, H., Lee, S. M. Determination of oxyphylla A enantiomers in the fruits of Alpinia oxyphylla by a chiral high-performance liquid chromatography-multiple reaction monitoring-mass spectrometry method and comparison of their in vivo biological activities. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (40), 11170-11181 (2020).
  36. De Chiara, G., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 46 (3), 614-638 (2012).
  37. Sochocka, M., Diniz, B. S., Leszek, J. Inflammatory response in the CNS: friend or foe. Molecular Neurobiology. 54 (10), 8071-8089 (2017).
  38. Whitney, N. P., Eidem, T. M., Peng, H., Huang, Y., Zheng, J. C. Inflammation mediates varying effects in neurogenesis: relevance to the pathogenesis of brain injury and neurodegenerative disorders. Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1343-1359 (2009).
  39. Terzi, M., et al. The use of non-steroidal anti-inflammatory drugs in neurological diseases. Journal of Chemical Neuroanatomy. 87, 12-24 (2018).
  40. Shohayeb, B., Diab, M., Ahmed, M., Ng, D. C. H. Factors that influence adult neurogenesis as potential therapy. Translational Neurodegeneration. 7, 4 (2018).
  41. Sullivan, C., Kim, C. H. Zebrafish as a model for infectious disease and immune function. Fish and Shellfish Immunology. 25 (4), 341-350 (2008).
  42. Meeker, N. D., Trede, N. S. Immunology and zebrafish: spawning new models of human disease. Developmental and Comparative Immunology. 32 (7), 745-757 (2008).
  43. Morales Fenero, C. I., Colombo Flores, A. A., Camara, N. O. Inflammatory diseases modelling in zebrafish. World Journal of Experimental Medicine. 6 (1), 9-20 (2016).
  44. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  45. Novoa, B., Bowman, T. V., Zon, L., Figueras, A. LPS response and tolerance in the zebrafish (Danio rerio). Fish and Shellfish Immunology. 26 (2), 326-331 (2009).
  46. Garcia-Alloza, M., Bacskai, B. J. Techniques for brain imaging in vivo. Neuromolecular Medicine. 6 (1), 65-78 (2004).
  47. Ford, J., et al. At a glance: An update on neuroimaging and retinal imaging in Alzheimer's disease and related research. Journal of Prevention of Alzheimer's Disease. 9 (1), 67-76 (2022).
  48. Bercier, V., Rosello, M., Del Bene, F., Revenu, C. Zebrafish as a model for the study of live in vivo processive transport in neurons. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 17 (2019).
  49. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
  50. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (93), e52063 (2014).
  51. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  52. Chi, Z., Xu, Q., Zhu, L. A review of recent advances in robotic cell microinjection. Ieee Access. 8, 8520-8532 (2020).
  53. Wang, W., Liu, X., Gelinas, D., Ciruna, B., Sun, Y. A fully automated robotic system for microinjection of zebrafish embryos. PLoS One. 2 (9), 862 (2007).
  54. Fu, H. Q., et al. Prolonged neuroinflammation after lipopolysaccharide exposure in aged rats. PLoS One. 9 (8), 106331 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved