منصة عالية الإنتاجية للثقافة والتصوير 3D من المواد العضوية

Summary

يقدم هذا البحث بروتوكول تصنيع لنوع جديد من الركيزة المستزرعة مع مئات الحاويات الدقيقة لكل مم² ، حيث يمكن استزراع الكائنات العضوية ومراقبتها باستخدام الفحص المجهري عالي الدقة. كما يتم تفصيل بروتوكولات بذر الخلايا وتلطيخ المناعة.

Abstract

إن توصيف عدد كبير من الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد (3D) (organoids) بمقاييس دقة مختلفة محدود حاليا بواسطة مناهج التصوير القياسية. يصف هذا البروتوكول طريقة لإعداد رقائق الثقافة العضوية الدقيقة ، والتي تتيح التصوير المباشر متعدد المقاييس 3D على أداة سهلة الاستخدام تتطلب الحد الأدنى من التلاعب وقادرة على ما يصل إلى 300 من إنتاجية التصوير العضوي / ساعة. تتوافق رقائق الاستزراع هذه مع كل من أهداف الهواء والغمر (الهواء والماء والزيت والسيليكون) ومجموعة واسعة من المجاهر الشائعة (على سبيل المثال ، القرص الدوار ، والماسح الضوئي المحوري ، والمجال الواسع ، والحقل الساطع). علاوة على ذلك ، يمكن استخدامها مع طرائق ورقة الضوء مثل تقنية مجهر الإضاءة أحادي الهدف أحادي المستوى (SPIM).

يقدم البروتوكول الموصوف هنا خطوات مفصلة لإعداد رقائق الاستزراع الدقيقة وزراعة وتلطيخ المواد العضوية. لا يلزم سوى فترة زمنية قصيرة للتعرف عليها ، ويمكن العثور بسهولة على المواد الاستهلاكية والمعدات في المختبرات الحيوية العادية. هنا ، سيتم عرض قدرات التصوير ثلاثي الأبعاد فقط باستخدام المجاهر القياسية التجارية (على سبيل المثال ، القرص الدوار لإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد والفحص المجهري واسع المجال للمراقبة الروتينية).

Introduction

في ثقافات الخلايا العضوية 3D ، المشار إليها فيما يلي باسم organoids ، تتمايز الخلايا الجذعية وتنظم نفسها في هياكل مكانية تشترك في أوجه تشابه مورفولوجية ووظيفية قوية مع الأعضاء الحقيقية. تقدم الكائنات العضوية نماذج قيمة لدراسة البيولوجيا البشرية والتنمية خارج الجسم¹،^2،3. يتم تطوير عدد متزايد من النماذج التي تحاكي الكبد والدماغ والكلى والرئة والعديد من الأعضاء الأخرى²،^4،5. يتم توجيه التمايز في المواد العضوية عن طريق إضافة عوامل نمو قابلة للذوبان ومصفوفة خارج الخلية في تسلسل زمني دقيق. ومع ذلك ، في تناقض ملحوظ مع الأعضاء ، فإن تطور المواد العضوية غير متجانس تماما.

بالإضافة إلى العديد من التحديات البيولوجية⁶،⁷ ، تشكل الثقافات العضوية أيضا تحديات تكنولوجية من حيث طرق زراعة الخلايا ، وتوصيف النسخ ^، والتصوير. يحدث تطور الأعضاء في الجسم الحي في بيئة بيولوجية تؤدي إلى تنظيم ذاتي نمطي للغاية لترتيبات الخلايا. يمكن استخدام أي تغيير في النمط الظاهري كوكيل لتشخيص حالة مريضة. في المقابل ، تتطور الكائنات العضوية في المختبر في بيئات دقيقة يتم التحكم فيها بالحد الأدنى ومتوافقة مع ظروف زراعة الخلايا ، مما يؤدي إلى تباين كبير في مسار التطوير وتشكيل الشكل لكل عضو عضوي فردي.

أظهرت دراسة حديثة⁸ أن التصوير الكمي للشكل العضوي (واصفات النمط الظاهري) إلى جانب تقييم عدد قليل من العلامات الجينية يسمح بتعريف المناظر الطبيعية لتطور النمط الظاهري. يمكن القول إن القدرة على ربط تنوع التعبير الجيني في الكائنات العضوية بسلوكها الظاهري هي خطوة رئيسية نحو إطلاق العنان للإمكانات الكاملة للثقافات العضوية. وبالتالي ، فإنه يطرح لتطوير مناهج تصوير مخصصة وعالية المحتوى تسمح بتوصيف الميزات العضوية في المقاييس تحت الخلوية والمتعددة الخلايا والعضوية الكاملة في 3D ^9,10.

لقد طورنا منصة فحص عالية المحتوى (HCS) متعددة الاستخدامات تسمح بزراعة عضوية مبسطة (من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المعزولة [hESCs] ، أو الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان [hIPSCs] ، أو الخلايا الأولية إلى 3D ، متعددة الخلايا ، عضويات متباينة) وتصوير ثلاثي الأبعاد سريع وغير جراحي. إنه يدمج الجيل التالي ، مصغر ، جهاز زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد ، يسمى رقاقة JeWells ( الشريحة فيما بعد) ، والتي تحتوي على الآلاف من الآبار الدقيقة المصفوفة جيدا والمحاطة بمرايا 45 درجة تسمح بتصوير سريع وثلاثي الأبعاد وعالي الدقة بواسطة الفحص المجهري^{أحادي الهدف 11}. متوافق مع أي مجهر قياسي تجاري مقلوب ، يتيح هذا النظام تصوير 300 مادة عضوية ثلاثية الأبعاد بدقة تحت الخلوية في <1 ساعة.

يبدأ التصنيع الدقيق لجهاز زراعة الخلايا من قالب منظم دقيق موجود ، والذي يحتوي على مئات الأهرامات الدقيقة (الشكل 1 أ) مع قاعدة مربعة وجدران جانبية عند 45 درجة فيما يتعلق بالقاعدة. يوضح الشكل 1C صور المجهر الإلكتروني (EM) لمثل هذه الهياكل. القالب نفسه مصنوع من بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) (PDMS) ويمكن صنعه كنسخة طبق الأصل من قالب أولي (غير موضح هنا) مع الميزات المقابلة (كتجاويف) باستخدام إجراءات الطباعة الحجرية اللينة القياسية. يمكن إنتاج القالب الأساسي بإجراءات مختلفة. تم إجراء البروتوكول المستخدم لهذا البروتوكول باستخدام النقش الرطب السيليكوني كما ورد في Galland et al. ¹¹ ؛ إجراء تصنيع القالب الأساسي ليس بالغ الأهمية لهذا البروتوكول. يتم ترتيب الأهرامات في مصفوفة مربعة ، مع نفس الملعب لاتجاهات X و Y (في هذه الحالة تكون درجة الصوت 350 ميكرومتر).

على سبيل التوضيح ، تم نشر تجارب إثبات المفهوم¹² لإثبات أن الشريحة تسمح بالزراعة طويلة المدى (أشهر) وبروتوكولات التمايز مع تحديد عدد الخلايا الأولية في الآبار بدقة. يمكن مراقبة التطوير الفردي لعدد كبير من الكائنات العضوية تلقائيا على الهواء مباشرة باستخدام مجاهر مضان ساطعة قياسية و 3D ذات صفائح ضوئية. علاوة على ذلك ، يمكن استرجاع المواد العضوية لإجراء مزيد من التحقيقات البيولوجية (على سبيل المثال ، تحليل النسخ). تحدد هذه الورقة البروتوكولات التفصيلية لتصنيع أغطية زراعة الخلايا ، وإجراء البذر والتلوين للفحص المجهري الفلوري ، وكذلك استرجاع المواد العضوية.

Protocol

ملاحظة: يفصل الجزء الأول من هذا البروتوكول التصنيع الدقيق لجهاز زراعة الخلايا. يمكن إنتاج قالب أولي أصلي مع تجاويف هرمية داخليا - إذا كانت مرافق التصنيع الدقيقة متاحة - أو الاستعانة بمصادر خارجية لشركات خارجية. يتم إنتاج القالب الأساسي المستخدم في هذا العمل داخليا ، مع خطوات عملية التصنيع الموضحة في مكان آخر^11،13. يتوفر بروتوكول أساسي للتصنيع الدقيق للقالب في الملف التكميلي 1. حرجة: يجب إجراء العمليات في الخطوات من 1 إلى 6 في بيئة خالية من الغبار. يفضل استخدام غطاء تدفق رقائقي أو غرفة نظيفة ، إن وجدت. من خلال كل هذه الخطوات ، يجب استخدام معدات الحماية الشخصية (PPE) ، مثل القفازات ومعطف المختبر ونظارات السلامة.

1. تقطيع قالب PDMS

1. قطع أجزاء صغيرة من قالب PDMS إلى البعد المطلوب للجهاز النهائي (على سبيل المثال ، 1 سم × 1 سم [الشكل 1B]). قصها بالتوازي مع اتجاهات XY للمصفوفة.
   حرج: عند قطع قالب PDMS في نرد 1 سم × 1 سم ، قم بتنفيذ القطع في خطوات واحدة ؛ باستخدام شفرة حلاقة من جانب واحد ، اضغط وقطع PDMS في خطوة واحدة. هذا لمنع تكوين جزيئات صغيرة من PDMS ، والتي يمكن أن تترسب على سطح القالب وتؤثر على جودة خطوات النسخ المتماثلة (الخطوة 3).

2. إعداد ركائز PDMS المسطحة

1. تزن ~ 15-20 جم من راتنج قاعدة PDMS و 1.5-2 جم من عامل الشبكة (أي نسبة 10: 1) ، واخلطها بعناية ، وقم بالتخلص من الغازات في وعاء مفرغ لمدة ~ 20 دقيقة.
2. صب ببطء PDMS المفرغة على طبق بتري بلاستيكي بعرض 15 سم.
3. عالج PDMS عن طريق حفظ طبق بتري في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. بعد انتظار اكتمال المعالجة ، يكون فيلم PDMS المسطح بسمك ~ 1.5 مم (الموجود في طبق بتري) جاهزا للاستخدام (الشكل 2 أ).
4. باستخدام شفرة حادة ، قم بقص قطع 2 سم × 2 سم من PDMS (الشكل 2B-D).
   ملاحظة: السماكة الدقيقة لورقة PDMS هذه ليست حرجة ؛ ~ 1-2 مم هو نطاق مناسب. يجب أن يكون بعد القطع أكبر من القالب المحكم ولكن ليس أكبر بكثير ، مما قد يؤدي إلى إهدار المواد.

3. إنتاج طبقة محكم مصنوعة من لاصق قابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية

1. ضع نرد قالب PDMS واحد (كما هو موضح في الخطوة 1) ووجهه لأسفل أعلى قطع PDMS المسطح (كما هو موضح في الخطوة 2) (الشكل 3 أ ، ب).
   ملاحظة: تأكد من أن النتوءات الهرمية في القالب موجهة نحو ركيزة PDMS المسطحة وأن السطح العلوي للأهرامات المقطوعة فقط على اتصال. قم بتقييم الموضع الصحيح باستخدام المجهر الضوئي (الشكل 3C ، D).
2. على جانب واحد من القالب ، باستخدام ماصة ، قم بإسقاط كمية صغيرة (قطرتان ، حوالي 0.1-0.2 مل) من مادة لاصقة قابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية (الشكل 4 أ).
   ملاحظة: عندما يتلامس السائل مع حافة القالب ، ستدفع الشعيرات الدموية السائل لملء التجويف بين القالب نفسه والقطع المسطح ل PDMS المستخدم كركيزة.
   1. اتبع تقدم السائل داخل التجويف ، على سبيل المثال ، باستخدام مجهر بصري مقلوب بهدف تكبير 10x (الشكل 4B ، C).
3. تعريض المادة اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية لضوء الأشعة فوق البنفسجية لعلاجها. اضبط وقت التعرض اعتمادا على كثافة الطاقة لمصدر الأشعة فوق البنفسجية المستخدم (على سبيل المثال ، صندوق UV-LED بكثافة طاقة 35 ميجاوات / سم 2 ؛² دقيقة بقوة 50٪ في هذا البروتوكول لمعالجة المادة اللاصقة تماما).
4. باستخدام الكمية الزائدة من المادة اللاصقة على حافة واحدة ، أمسك المادة اللاصقة المعالجة على ركيزة PDMS المسطحة عن طريق الضغط برفق بإصبع (الشكل 5 أ ، ب). في هذه الأثناء ، استخدم الملقط لقرص زاوية واحدة من القالب بجوار نفس الحافة التي يتم الضغط عليها لأسفل وقشرها ببطء مع التأكد من عدم رفع الفيلم المحكم أيضا.
   ملاحظة: يوضح الشكل 5C نتيجة إجراء إزالة العفن المناسب ؛ يوضح الشكل 5E-G الإجراء الخاطئ.
5. قم بقص المادة اللاصقة الزائدة وركيزة PDMS الزائدة باستخدام شفرة حلاقة لترك الطبقة اللاصقة المعالجة والمنسوجة مسطحة على PDMS مع PDMS الزائد على حافة واحدة فقط (الشكل 5D) ، والتي ستكون مطلوبة في الخطوة 5.

4. إعداد الركيزة Coverslip

ملاحظة: كركيزة للجهاز النهائي ، يتم استخدام أغطية قياسية مستديرة 1.5H بقطر 25 مم. قبل استخدامها ، يجب تنظيفها لإزالة الغبار و / أو بقايا العضوية من سطحها.

1. تنظيف الغطاء
   1. اغمر الأغطية في الماء والصابون لمدة 5 دقائق أثناء تطبيق الموجات فوق الصوتية (40 كيلو هرتز ، 110 واط طاقة صوتية).
   2. اغسل الأغطية بماء نظيف منزوع الأيونات (DI) ، أولا عن طريق الغمر وأخيرا بمياه DI الجارية من الصنبور. جفف أغطية الأغطية بمسدس نفخ غاز N₂ .
   3. اغمر الأغطية في حمام الأسيتون لمدة 5 دقائق ؛ انتقل على الفور إلى حمام 2-بروبانول (IPA) لمدة 5 دقائق إضافية.
   4. اشطف أغطية الأغطية باستخدام IPA نظيف باستخدام زجاجة ضغط. جفف أغطية الغطاء باستخدام مسدس النفخ الغازي N₂ .
      ملاحظة: يمكن تخزين أغطية الأغطية التي يتم تنظيفها باستخدام هذا الإجراء في حاوية مغلقة لحين الحاجة. احتفظ بها في خزانة جافة لتجنب ترسب الرطوبة على سطحها.
2. عندما تكون جاهزا للاستخدام ، عالج غطاء نظيفا بعملية بلازما O 2 قصيرة لتحسين حمودتها للماء: O₂ 20 sccm ، وضغط 3 ملي بار ، و 60 واط في مولد طاقة التردد اللاسلكي ، ومدة 60 ثانية.
3. مباشرة بعد تنشيط البلازما ، تابع طلاء الطبقة الرقيقة من المادة اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية عن طريق وضع الغطاء على ظرف الفراغ لطبقة الدوران القياسية وسكب قطرة صغيرة من المادة اللاصقة في وسط غطاء الغطاء (الشكل 6). قم بتشغيل عملية الطلاء الدوراني: الانتشار لمدة 5 ثوان عند 500 دورة في الدقيقة ، والطلاء عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية (مع ضبط التسارع والتباطؤ على 100 دورة في الدقيقة / ثانية).
   1. في حالة عدم توفر طلاء الدوران ، استخدم الطريقة البديلة التالية لإنتاج طبقة رقيقة من لاصق الأشعة فوق البنفسجية على أغطية الغطاء:
      1. على غطاء نظيف ، قم بإسقاط ~ 0.1 مل من مادة لاصقة قابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية باستخدام ماصة (الشكل 7 أ).
      2. خذ غطاء ثان وضعه فوق الغطاء الأول لجعل المادة اللاصقة السائلة تنتشر بالتساوي بين الغطاءين (الشكل 7B-D).
      3. بمجرد وصول المادة اللاصقة المنتشرة إلى حواف أغطية الغطاء ، افصلها برفق عن طريق تحريك واحدة فوق الأخرى. بمجرد فصلهما ، يتم طلاء كلا الغطاءين بالكامل بطبقة رقيقة من المادة اللاصقة السائلة (الشكل 7E).
         ملاحظة: قد لا يكون الطلاء موحدا وسلسا فقط إذا لم يتم الفصل بحركة سلسة ومستمرة.
4. المعالجة المسبقة للمواد اللاصقة القابلة للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية
   1. بعد طلاء الدوران ، قم بمعالجة المادة اللاصقة عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية. اضبط وقت التعرض اعتمادا على كثافة طاقة مصدر الأشعة فوق البنفسجية المستخدم (هنا ، تم استخدام صندوق UV-LED بكثافة طاقة 35 ميجاوات / سم² لمدة 1 دقيقة بطاقة 50٪).
      حرج: المادة اللاصقة المستخدمة هنا هي غراء بصري. انظر المناقشة لمعرفة النقاط الرئيسية المتعلقة بجرعات الطاقة لمعالجتها.

5. نقل الفيلم المحكم إلى الركيزة النهائية

1. خذ أحد الأفلام المحكم (المعد في الخطوة 3) وضعه على اتصال مع غطاء الغطاء المطلي باللاصق (المحضر في الخطوة 4). تأكد من أن التلامس بين المادة اللاصقة المعالجة جزئيا على غطاء الغطاء والفيلم المحكم موحد قدر الإمكان (الشكل 8A-C).
   حرج: في هذه المرحلة ، يجب أن تكون المادة اللاصقة الموجودة على غطاء الغطاء صلبة بما يكفي لتجنب إعادة التدفق ، والتي من شأنها أن تملأ التجاويف الهرمية للفيلم المحكم عند وضعها في اتصال ولكن أيضا تكون بلاستيكية ولاصقة بدرجة كافية بحيث يمكن تحسين الاتصال عن طريق الضغط برفق على الفيلم المحكم.
2. قم بتعريض أغطية الغطاء لضوء الأشعة فوق البنفسجية حتى يتم علاج الطبقة اللاصقة المطلية على الغطاء بالكامل. سيؤدي ذلك إلى إغلاق الفيلم المحكم على غطاء الغطاء وتوفير عزل مانع للتسرب بين التجاويف الهرمية.
3. أخيرا ، انزع الركيزة المسطحة PDMS (الشكل 8D-F). باستخدام الملقط ، اضغط على PDMS في زاوية واحدة عند الحافة حيث تركت المواد الزائدة بعد التشذيب (الخطوة 3.5). بهذه الطريقة ، يتم ترك طبقة الفيلم المحكم لاصقة على غطاء الغطاء مع وصول مفتوح في الأعلى لبذر الخلايا. حرج: عند تقشير PDMS المسطح ، يجب أن يظل الفيلم المحكم متصلا جيدا بغطاء الغطاء. يتم تأكيد فشل الالتصاق بسهولة إذا كان من الممكن تقشير الفيلم المحكم من الغطاء بعد التعرض النهائي للأشعة فوق البنفسجية دون أي جهد.

6. التخميل طويل الأجل لغطاء زراعة الخلايا لزراعة الخلايا

ملاحظة: يتم تحقيق التخميل عن طريق توليد طلاء مطابق ومستمر لبوليمر مشترك محاكي حيوي بهيكل مشابه للمجموعة القطبية من الدهون الفوسفاتية في غشاء الخلية. يمنع هذا الطلاء المطابق التصاق الخلايا بجهاز زراعة الخلايا

1. تحضير محلول يحتوي على 0.5٪ (وزن / حجم) من البوليمر المشترك المحاكي الحيوي المذاب في الإيثانول النقي. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل.
2. ضع غطاء زراعة الخلية في طبق بتري 35 مم وقم بتغطيته بالكامل بمحلول البوليمر المشترك المحاكي الحيوي.
3. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة غطاء زراعة الخلايا من الحاوية بمحلول البوليمر المشترك المحاكي حيويا واتركه حتى يجف في درجة حرارة الغرفة داخل الطبق النهائي في غطاء السلامة الحيوية (>1 ساعة).
   ملاحظة: يمكن إنتاج طلاء أكثر سمكا عن طريق زيادة تركيز البوليمر المشترك المحاكي الحيوي في محلول الطلاء ؛ تظهر نتائج الطلاء السميك تحت مجهر برايت فيلد (الشكل 9 أ).

7. بذر الخلية

1. التفريغ والتعقيم
   1. قبل بذر الخلية مباشرة ، قم بتوزيع محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) في أطباق زراعة الخلايا (عادة 1 مل لطبق بتري 35 مم). قم بإزالة الطبق باستخدام PBS المعقم باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية لمدة ~ 10 دقائق ، تليها عدة جولات من السحب لإزالة جميع الفقاعات.
      حرج: إذا كان الهواء محاصرا داخل التجاويف الهرمية ، فسوف يمنع الخلايا من دخولها. للتأكد من عدم وجود هواء محبوس في الهرم قبل بذر الخلية ، يوصى بالتأكد بصريا (تحت مجهر برايت فيلد على الطاولة عند تكبير 10x أو 20x) من عدم وجود هواء في هذه التجاويف (الشكل 10).
   2. استبدل PBS بوسط زراعة معقم وقم بتعقيم اللوحة بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة تحت غطاء زراعة الخلية.
      ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، يجب اعتبار الطبق معقما والتلاعب به باستخدام تقنيات معقمة. هناك طريقة بديلة لإزالة الهواء المحبوس من جهاز زراعة الخلايا وهي استخدام جرة تفريغ مع مضخة تفريغ.
2. إعداد تعليق الخلية
   ملاحظة: يمكن زرع الخلايا كمجاميع خلية مفردة أو صغيرة ودخول آبار العينة من خلال الفتحة العلوية. بمرور الوقت ، تتجمع الخلايا المدرجة وتنمو داخل آبار العينة إلى كرويات بحجم أكبر من حجم الفتحة. كنماذج خط خلية تم التحقق من صحتها ، استخدم خلايا سرطانية HCT116 (CCL-247 ATCC) أو MCF7 (HTB-22 ATCC) محفوظة في وسط المزرعة الموصى به (إرشادات ATCC).
   1. قم بإعداد معلق خلوي (على سبيل المثال ، باستخدام عملية التربسين باتباع إرشادات ATCC). اتبع توصيات إعداد التربسين / تعليق الخلية للخلايا ذات الاهتمام.
   2. عد واضبط تركيز الخلية إلى 0.5 × 10⁶ خلايا / مل في وسط الاستزراع الموصى به.
3. الاستغناء عن الخلايا
   1. قم بإزالة المخزن المؤقت PBS من طبق زراعة الخلايا 35 مم ثم قم بتوزيع 1 مل من تعليق الخلية المعدل. انظر الشكل 11A للحصول على صورة مجهر ضوئي لإجراء بذر الخلية بكثافة خلية وتجانس كافيين.
   2. ضع طبق زراعة الخلايا مرة أخرى في حاضنة الخلية (37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ ، و 100٪ رطوبة) لمدة 10 دقائق. ما يقرب من 80-100 خلية ستدخل كل تجويف هرمي.
      ملاحظة: من الممكن زيادة عدد الخلايا لكل طبق زراعة خلوي عن طريق زيادة تركيز الخلية أو الوقت الذي يقضيه قبل إزالة تعليق الخلية. عادة ، يستغرق تكوين كروي عدة ساعات (حسب نوع الخلية) بعد بذر الخلية ويمكن متابعته بمجهر برايتفيلد (4x إلى 40x الأهداف ؛ الشكل 11). من هنا ، يمكن تغيير وسط الاستزراع والمصفوفات خارج الخلية وعوامل نمو التمايز أو إضافتها إلى طبق زراعة الخلايا الذي يحتوي على الأجسام الكروية وفقا لبروتوكولات التمايز النموذجية التي يمكن أن تستمر بضعة أيام أو أسابيع أو أشهر.
   3. بعد الحضانة لمدة 10 دقائق ، استرجع طبق زراعة الخلايا من الحاضنة واستنشق المعلق الخلوي برفق لإزالة الخلايا غير المحاصرة. أضف 1 مل من وسط الاستزراع إلى طبق 35 مم وضعه مرة أخرى في حاضنة الخلية.
      حرج: في هذه المرحلة ، نظرا لأن الأجسام الكروية لم تتشكل بعد ، من المهم جدا تجنب الطموح القوي أو الاستغناء الذي سيؤدي إلى فقدان الخلايا. يوصى بشدة بالتحكم البصري باستخدام مجهر برايت فيلد على الطاولة في هذه الخطوة.

8. التلوين المناعي والتصوير

1. التثبيت والتلوين
   ملاحظة: الإجراءات الكلاسيكية المختلفة للتثبيت والتلوين المناعي متوافقة تماما مع طبق زراعة الخلايا. يتم وصف بروتوكول نموذجي واحد هنا.
   1. ثبت العضويات / الكروية في طبق زراعة الخلايا لمدة 20 دقيقة في 4٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة.
   2. تغلغل المواد العضوية لمدة 24 ساعة في محلول خافض للتوتر السطحي بنسبة 1٪ في PBS معقم عند 4 درجات مئوية على شاكر مداري واحتضان لمدة 24 ساعة في المخزن المؤقت المانع (2٪ ألبومين مصل بقري [BSA] و 1٪ خافض للتوتر السطحي في PBS معقم) عند 4 درجات مئوية على شاكر مداري.
   3. احتضان العينات بالأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية عند التخفيف بين 1/50 و 1/200 (أو وفقا لتوصيات الشركة المصنعة) في محلول تخفيف الأجسام المضادة (2٪ BSA و 0.2٪ خافض للتوتر السطحي في PBS المعقم) عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة.
   4. شطف العينات 3x مع عازلة الغسيل على شاكر المداري (3٪ كلوريد الصوديوم و 0.2٪ الفاعل بالسطح في PBS معقمة) واحتضان الأجسام المضادة الثانوية المقابلة في عازلة تخفيف الأجسام المضادة (التخفيف بين 1/100 و 1/300 أو وفقا لتوصيات الشركة المصنعة) ، 0.5 ميكروغرام / مل 4'،6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) ، و 0.2 ميكروغرام / مل Alexa Fluor 647 أو 488 Phalloidin عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة على شاكر مداري ، تليها خمس خطوات شطف مع برنامج تلفزيوني. اختياريا ، قم بتركيب العينات باستخدام عامل إزالة قابل للذوبان في الماء تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
2. التصوير
   ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن اعتبار المواد العضوية الموجودة في لوحة microwell بمثابة طبق استزراع عادي يحتوي على عينات ثابتة وملطخة للتصوير: يمكن استخدام أي إجراء تصوير قياسي دون الحاجة إلى تكييف أو تعديل. يوضح الشكل 12 نتيجة تمثيلية للصور وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار ، مع هدف هوائي 40x (فتحة عددية 0.75).
   1. استخدم برنامج المنشئ لعملية الحصول التلقائي على الصور بالإعدادات التالية: وقت التعرض = 50 مللي ثانية ، مع مرحلة آلية z للحصول على مكدس z (1 ميكرومتر Z-step ، لارتفاع إجمالي يبلغ 70 ميكرومتر).
   2. إجراء إعادة بناء 3D باستخدام برنامج تحليل الصور.

9. الافراج عن وجمع المواد العضوية

ملاحظة: يمكن فصل الطبقة اللاصقة المحكم لطبق زراعة الخلايا عن الغطاء لتحرير الأجسام الكروية / العضوية الحية (قبل التثبيت) الموجودة داخل التجاويف الهرمية لتحليل الخلايا بإجراءات أخرى مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، ونهج -omic ، والتجارب في المختبر ، وزرع الجسم الحي .

1. مع بقاء العينة في طبق بتري وفي غطاء السلامة الحيوية ، استخدم شفرة مثل مشرط لقطع زاوية من الطبقة اللاصقة المنسوجة.
2. باستخدام الملقط ، اضغط على الطبقة اللاصقة المحكم على الحافة المقطوعة وقشرها برفق من الغطاء الزجاجي ولكن احتفظ بها مغمورة في الوسط (قد تبقى بعض المواد العضوية مع الطبقة اللاصقة ، الشكل 13).
3. شطف 3x مع وسط الاستزراع وجمع المواد العضوية عن طريق ماصة العين.

النتائج

يوضح الشكل 8F الجانب النموذجي لغطاء زراعة الخلية بعد التصنيع الناجح. تظهر الطبقة اللاصقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية مسطحة وتلتصق جيدا بغطاء الغطاء. قد يفشل نقل الطبقة اللاصقة على غطاء الغطاء إذا تم تجاوز الطبقة الموجودة على غطاء الغطاء ، أو إذا تمت إزالة ركيزة ...

Discussion

تم وصف الإجراء الخاص بتصنيع طبق استزراع البئر الصغير ، والذي يسمح بالثقافة العضوية عالية الكثافة والتمايز ، في هذه الورقة. نظرا لهندسة وترتيب التجاويف الدقيقة ، يمكن استزراع الآلاف من الأجسام الكروية وتلطيخها في لوحة واحدة لفترات طويلة من الزمن (عدة أسابيع أو أكثر) دون أي فقد للمواد تقريب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Thermofisher scientific	AA19397K7
Acetone	Thermofisher scientific	AA19392K7
BC43 Benchtop Confocal Microscope	Andor Technology		spinning disk confocal microscope
bovine serum albumin	Thermofisher scientific	37525
Buffered oxide etching solution	Merck	901621-1L
CEE Spin Coater	Brewer Science	200X
DAPI	Thermofisher scientific	62248
Developer AZ400K	Merck	18441223164
DI Milliq water	Millipore
Fetal Bovine Serum (FBS)	Invitrogen	10082147
Glass coverslips	Marienfled	117650	1.5H, round 25 mm diameter
Hepes	Invitrogen	15630080
Imaris software	BitPlane		image analysis software
Inverted Transmission optical microscope	Nikon	TSF100-F
Labsonic M	Sartorius Stedium Biotech		Ultrasonic homogenizer
Lipidure	NOF America	CM5206	bio-mimetic copolymer
NOA73	Norland Products	17-345	UV curable adhesive
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063
Phalloidin	Thermofisher scientific	A12379	Alexa Fluor
Phosphate Buffer Solution	Thermofisher scientific	10010023
Photo Resist AZ5214E	Merck	14744719710
Pico Plasma tool	Diener Electronic GmbH + Co. KG	Pico Plasma	For O2 plasma treatment
RapiClear 1.52	Sunjin lab	RC 152001	water-soluble clearing agent
RCT Hot Plate/Stirrer	IKA (MY)
Reactive Ion Etching tool	Samco Inc. (JPN)	RIE-10NR
RPMI 1640	Invitrogen	11875093	culture medium for HCT116 cells
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	4019862	Polydimethylsiloxane or in short, PDMS
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	448931-10G
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	surfactant
Trypsin EDTA	Thermofisher scientific	15400054
Ultrasonic Cleaner	Bransonic	CPX2800
UV-KUB 2	KLOE		UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density
UV mask aligner	SUSS Microtec Semiconductor (DE)	MJB4