用于类器官培养和 3D 成像的高通量平台

摘要

本文提出了一种新型培养基质的制造方案，每mm²具有数百个微容器，其中可以使用高分辨率显微镜培养和观察类器官。还详细介绍了细胞接种和免疫染色方案。

摘要

目前，不同分辨率尺度的大量三维（3D）器官型培养物（类器官）的表征受到标准成像方法的限制。该协议描述了一种制备微加工类器官培养芯片的方法，该方法可在用户友好的仪器上实现多尺度，3D实时成像，需要最少的操作，并且能够达到300个类器官/ h的成像通量。这些培养芯片与空气物镜和浸没物镜（空气、水、油和硅）以及各种常见显微镜（例如转盘、点扫描仪共聚焦、广视场和明场）兼容。此外，它们可以与光片模式一起使用，例如单物镜、单平面照明显微镜（SPIM）技术（soSPIM）。

此处描述的方案给出了制备微加工培养芯片以及类器官培养和染色的详细步骤。只需要很短的时间就可以熟悉，消耗品和设备可以在正常的生物实验室中轻松找到。在这里，3D成像功能将仅使用商业标准显微镜（例如，用于3D重建的转盘和用于常规监测的宽视场显微镜）进行演示。

引言

在器官型3D细胞培养物（以下简称类器官）中，干细胞分化并自组织成与真实器官具有强烈形态和功能相似性的空间结构。类器官为研究人类生物学和体外发育提供了有价值的模型¹，^2，3。越来越多的模型正在开发中，这些模型可以模仿肝脏，大脑，肾脏，肺和许多其他器官²，^4，5。类器官的分化是通过在精确的时间序列中添加可溶性生长因子和细胞外基质来指导的。然而，与器官形成鲜明对比的是，类器官的发育是相当异质的。

除了众多生物学挑战⁶，⁷之外^，类器官培养在细胞培养方法、转录组学表征和成像方面也带来了技术挑战。体内器官发育发生在生物环境中，导致细胞排列的高度刻板的自组织。任何表型改变都可以用作诊断患病状态的代理。相比之下，类器官在与细胞培养条件兼容的最小受控微环境中体外发育，导致每个个体类器官的发育路径和形状形成存在很大差异。

最近的一项研究⁸表明，类器官形状（表型描述符）的定量成像与一些遗传标记的评估相结合，可以定义表型发育景观。可以说，将类器官中基因组表达的多样性与其表型行为联系起来的能力是释放器官型培养物全部潜力的重要一步。因此，它乞求开发专用的高内涵成像方法，允许在3D⁹，¹⁰中表征亚细胞^，多细胞和全类器官尺度的类器官特征。

我们开发了一种多功能高内涵筛选（HCS）平台，允许简化类器官培养（从分离的人胚胎干细胞[hESCs]，人诱导多能干细胞[hIPSC]或原代细胞到3D，多细胞，分化的类器官）和快速，非侵入性的3D成像。它集成了下一代微型化3D细胞培养设备，称为JeWells芯片（以下简称 芯片 ），其中包含数千个排列良好的微孔，两侧是45°镜，可通过单物镜光片显微镜进行快速，3D，高分辨率成像¹¹。该系统与任何标准的商用倒置显微镜兼容，可在 <1 小时内以亚细胞分辨率对 300 个类器官进行 3D 成像。

细胞培养装置的微细加工从现有的微结构模具开始，该模具包含数百个微金字塔（图1A），其方形底座和相对于底座45°的侧壁。 图1C 显示了这种结构的电子显微镜（EM）图像。模具本身由聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）制成，可以使用标准的软光刻程序制成具有相应特征（作为型腔）的主模具（此处未显示）的复制铸件。主模具可以通过不同的程序生产。用于该协议的协议是使用硅湿法蚀刻制成的，如Galland等人所报道的那样。¹¹;主模具的制造程序对于该协议并不重要。金字塔排列成方形阵列，X 和 Y 方向的间距相同（在这种情况下，间距为 350 μm）。

作为例证，发表了概念验证实验¹² ，以证明该芯片允许长期培养（数月）和分化方案，同时精确定义孔中初始细胞的数量。使用标准明场和3D光片荧光显微镜可以自动实时监测大量类器官的个体发育。此外，可以检索类器官以进行进一步的生物学研究（例如，转录组学分析）。本文概述了细胞培养盖玻片制造的详细方案、荧光显微镜的接种和染色程序以及类器官的检索。

研究方案

注意:本协议的第一部分详细介绍了细胞培养装置的微细加工。带有金字塔形空腔的原始主模具可以在内部生产 - 如果有微加工设施 - 或外包给外部公司。这项工作中使用的主要模具是内部生产的，制造工艺步骤在其他地方描述^11，13。模具微细加工的基本协议可在 补充文件1中找到。关键:步骤 1 到 6 中的操作需要在无尘环境中进行。层流罩或洁净室（如果有）是首选。通过所有这些步骤，需要使用个人防护装备（PPE），例如手套，实验室外套和安全眼镜。

1. PDMS模具的切割

1. 将PDMS模具的一小部分切割成最终设备所需的尺寸（例如，1 cm x 1 cm [图1B]）。平行于阵列的 XY 方向切割它们。
   关键:将PDMS模具切割成1厘米x 1厘米的骰子时，分一步执行切割;使用单面剃须刀片，施加压力并一步切开PDMS。这是为了防止PDMS小颗粒的形成，这些颗粒会沉积在模具表面并影响复制步骤的质量（步骤3）。

2. 平板PDMS基板的制备

1. 称取~15-20gPDMS基础树脂和1.5-2g网状剂（即比例为10:1），小心混合，并在真空罐中脱气~20分钟。
2. 慢慢将脱气的PDMS倒入15厘米宽（直径）的塑料培养皿上。
3. 通过将培养皿保持在65°C的烤箱中2小时来固化PDMS。等待固化完成后，即可使用~1.5mm厚的扁平PDMS膜（包含在培养皿中）（图2A）。
4. 使用锋利的刀片，从PDMS中切出2厘米x 2厘米的碎片（图2B-D）。
   注意:此PDMS片材的确切厚度并不重要;~1-2毫米是一个合适的范围。切割的尺寸应大于纹理模具，但不要大多少，这会导致材料浪费。

3. 生产由UV固化粘合剂制成的纹理层

1. 将一个PDMS模具骰子（如步骤1中制备的那样）面朝下放在平面PDMS切割的顶部（如步骤2中制备的那样）（图3A，B）。
   注意: 确保模具中的金字塔突起朝向平坦的PDMS基板，并且只有截断金字塔的顶面接触。用光学显微镜评估正确的位置（图3C，D）。
2. 在模具的一侧，使用移液管滴入少量（两滴，约0.1-0.2mL）紫外光固化粘合剂（图4A）。
   注意:当液体与模具边缘接触时，毛细作用将驱动液体填充模具本身与用作基板的PDMS平面切割之间的空腔。
   1. 跟踪腔内液体的进展，例如，使用具有10倍放大镜的倒置光学显微镜（图4B，C）。
3. 将紫外光固化粘合剂暴露在紫外光下以固化。根据所用紫外线源的功率密度调整曝光时间（例如，功率密度为35 mW / cm 2的UV-LED盒;在此方案中以50%功率²分钟以完全固化粘合剂）。
4. 在一个边缘使用过量的粘合剂，用手指轻轻按压将固化的粘合剂固定在平坦的PDMS基材上（图5A，B）。同时，用镊子捏住模具的一角，紧挨着被压住的同一边缘，慢慢地将其剥离，同时确保纹理薄膜也不会被抬起。
   注意:图5C显示了正确脱模程序的结果;图5E-G显示了错误的过程。
5. 使用剃须刀片修剪多余的粘合剂和多余的PDMS基材，使固化的，有纹理的粘合剂层平放在PDMS上，仅在一个边缘上放置多余的PDMS（图5D），这将在步骤5中需要。

4. 盖玻片基材制备

注意:作为最终设备的基材，使用直径为25毫米的标准圆形1.5H盖玻片。在使用之前，需要清洁它们以去除其表面的灰尘和/或有机残留物。

1. 盖玻片清洁
   1. 在施加超声波（40 kHz，110 W声波功率）时，将盖玻片浸入肥皂水中5分钟。
   2. 用干净的去离子（DI）水清洗盖玻片，首先浸入水中，最后用水龙头中的去离子水清洗盖玻片。用N₂ 气体吹气枪擦干盖玻片。
   3. 将盖玻片浸入丙酮浴中5分钟;立即移至2-丙醇（IPA）浴中再加热5分钟。
   4. 使用挤压瓶用干净的 IPA 冲洗盖玻片。用N₂ 气体吹气枪擦干盖玻片。
      注意:使用此过程清洁的盖玻片可以存放在封闭的容器中，直到需要为止。将它们放在干燥的柜子里，以避免湿气沉积在它们的表面。
2. 准备使用时，用短的O 2等离子体工艺处理干净的盖玻片，以提高其亲水性:O_{2 20} sccm，3 mbar压力，RF发生器处60 W，持续时间60 s。
3. 等离子活化后，通过将盖玻片放在标准旋涂机的真空卡盘上并在盖玻片的中心倒入一小滴粘合剂，立即对薄层UV固化粘合剂进行旋涂（图6）。运行旋涂工艺:以 500 rpm 的速度涂布 5 秒，以 3，000 rpm 的速度涂布 45 秒（加速和减速设置为 100 rpm/s）。
   1. 如果没有旋涂，请使用以下替代方法在盖玻片上形成一层UV粘合剂薄膜:
      1. 在干净的盖玻片上，使用移液管滴下~0.1 mL的紫外光固化粘合剂（图7A）。
      2. 取第二张盖玻片并将其放在第一张盖玻片的顶部，使液体粘合剂均匀地散布在两个盖玻片之间（图7B-D）。
      3. 一旦铺展粘合剂到达盖玻片的边缘，通过将一个滑过另一个来轻轻地将它们分开。分离后，两个盖玻片都完全涂有一层薄薄的液体粘合剂（图7E）。
         注意: 只有当分离不是通过平稳和连续的运动完成时，涂层才可能不均匀和光滑。
4. 紫外光固化胶粘剂的预固化
   1. 旋涂后，通过暴露于紫外线来预固化粘合剂。根据所用紫外线源的功率密度调整曝光时间（此处，功率密度为35 mW /^{cm 2} 的UV-LED盒在50%功率下使用1分钟）。
      关键:这里使用的粘合剂是光学胶。有关其固化能量剂量的要点，请参阅讨论。

5. 将纹理薄膜转移到最终基材

1. 取其中一种纹理薄膜（在步骤3中制备）并将其与涂有粘合剂的盖玻片（在步骤4中制备）接触。确保盖玻片上部分固化的粘合剂与纹理薄膜之间的接触尽可能均匀（图8A-C）。
   关键:在这个阶段，盖玻片上的粘合剂应该足够牢固以避免回流，当接触时会填充纹理薄膜的金字塔形空腔，但也要具有足够的塑料和粘合剂，可以通过轻轻按压纹理薄膜来优化接触。
2. 将盖玻片暴露在紫外线下，直到盖玻片上涂有的粘合剂层完全固化。这将密封盖玻片上的纹理薄膜，并在金字塔腔之间提供防漏隔离。
3. 最后，剥离PDMS平面基板（图8D-F）。使用镊子将PDMS捏在修剪后留下多余材料的边缘的一角（步骤3.5）。这样，纹理薄膜层被粘附在盖玻片上，顶部有开放通道用于细胞接种。关键:剥离平坦的PDMS时，纹理薄膜应保持良好附着在盖玻片上。如果在最终暴露于紫外线后，纹理薄膜可以毫不费力地从盖玻片上剥离，则很容易确认粘合失败。

6. 细胞培养盖玻片的长期钝化

注意:钝化是通过产生仿生共聚物的保形和连续涂层来实现的，其结构类似于细胞膜中磷脂的极性基团。这种保形涂层可防止细胞粘附在细胞培养装置上

1. 用溶解在纯乙醇中的0.5%（w / v）仿生共聚物制备溶液。将溶液储存在4°C以备将来使用。
2. 将细胞培养盖玻片置于35mm培养皿中，并用仿生共聚物溶液完全覆盖。
3. 5分钟后，用仿生共聚物溶液从容器中取出细胞培养盖玻片，并将其在生物安全罩中的最终培养皿内室温下干燥（>1小时）。
   注意:通过增加涂料溶液中仿生共聚物的浓度，可以产生更厚的涂层;较厚涂层的结果在明场显微镜下可见（图9A）。

7. 细胞接种

1. 脱气和灭菌
   1. 在细胞接种之前，将无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）分配到细胞培养皿中（35 mm培养皿通常为1 mL）。使用超声波设备用无菌PBS对培养皿脱气~10分钟，然后进行几轮移液以去除所有气泡。
      关键:如果空气被困在锥体腔内，它将阻止细胞进入它们。为了确保在细胞接种前金字塔中没有空气被困，建议目视确保（在10倍或20倍放大倍率的台式明场显微镜下）这些腔中没有空气（图10）。
   2. 用无菌培养基替换PBS，并在细胞培养罩下用紫外线对板进行30分钟的灭菌。
      注意:从此步骤开始，应将培养皿视为无菌并使用无菌技术进行操作。从细胞培养装置中去除滞留空气的另一种方法是使用带有真空泵的真空罐。
2. 细胞悬液制备
   注意:细胞可以作为单个或小细胞聚集体接种，并通过顶部孔径进入样品孔。随着时间的推移，插入的细胞在样品孔内聚集并生长成大小大于孔径大小的球状体。作为经过验证的细胞系模型，使用在推荐培养基中维持的HCT116（CCL-247 ATCC）或MCF7（HTB-22 ATCC）癌细胞（ATCC指南）。
   1. 准备细胞悬液（例如，按照ATCC指南使用胰蛋白酶消化过程）。遵循针对目标细胞的胰蛋白酶消化/细胞悬液制备建议。
   2. 在推荐的培养基中计数并将细胞浓度调整至0.5×10⁶ 细胞/ mL。
3. 细胞分液
   1. 从 35 mm 细胞培养皿中取出 PBS 缓冲液，然后分配 1 mL 调整后的细胞悬液。参见 图11A ，了解具有足够细胞密度和均匀性的细胞接种过程的光学显微镜图像。
   2. 将细胞培养皿放回细胞培养箱（37°C，5%CO₂和100%湿度）中10分钟。大约80-100个细胞将进入每个锥体腔。
      注意:可以通过增加细胞浓度或去除细胞悬液之前花费的时间来增加每个细胞培养皿的细胞数量。通常，球体形成在细胞接种后需要几个小时（取决于细胞类型），可以使用明场显微镜（4倍至40倍物镜; 图 11）。从这里开始，可以根据可能持续几天、几周或几个月的典型分化方案，改变培养基、细胞外基质和分化生长因子或将其添加到含有球状体的细胞培养皿中。
   3. 孵育10分钟后，从培养箱中回收细胞培养皿并轻轻吸出细胞悬液以除去未捕获的细胞。将 1 mL 培养基加入 35 mm 培养皿中，然后将其放回细胞培养箱中。
      关键:在这个阶段，由于球状体尚未形成，因此避免导致细胞损失的强烈抽吸或分配非常重要。强烈建议在此步骤中使用台式明场显微镜进行视觉控制。

8. 免疫染色和成像

1. 固定和染色
   注意:不同的经典固定和免疫染色程序与细胞培养皿完全兼容。这里描述了一个典型的协议。
   1. 在室温下将细胞培养皿中的类器官/球状体固定在4%多聚甲醛中20分钟。
   2. 在轨道摇床上将类器官在无菌PBS中的1%表面活性剂溶液中透化24小时，并在封闭缓冲液（2%牛血清白蛋白[BSA]和无菌PBS中的1%表面活性剂）中孵育24小时在4°C的轨道摇床上。
   3. 将样品与感兴趣的一抗在抗体稀释缓冲液（无菌PBS中的2%BSA和0.2%表面活性剂）中的1/50至1/200（或根据制造商的建议）在4°C中孵育48小时。
   4. 在轨道摇床上用洗涤缓冲液冲洗样品 3 次（无菌 PBS 中的 3% NaCl 和 0.2% 表面活性剂），并在抗体稀释缓冲液中与相应的二抗一起孵育（稀释在 1/100 和 1/300 之间或根据制造商的建议）、0.5 μg/mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 和 0.2 μg/mL Alexa Fluor 647 或 488 鬼笔环肽在 4 °C 下在轨道摇床上孵育 24 小时， 然后用PBS进行五个冲洗步骤。或者，使用预热至37°C的水溶性清除剂安装样品。
2. 成像
   注意:在此阶段，微孔板中的类器官可被视为包含固定和染色样品以进行成像的正常培养皿:可以使用任何标准成像程序，无需调整或修改。 图12 显示了使用转盘共聚焦显微镜获得的图像和3D重建的代表性结果，具有40倍空气物镜（数值孔径0.75）。
   1. 使用以下设置使用构造函数软件进行自动图像采集过程:曝光时间= 50 ms，使用Z电动载物台获取z堆栈（1μm Z步长，总高度为70μm）。
   2. 使用图像分析软件执行 3D 重建。

9. 类器官的释放和收集

注意:细胞培养皿的纹理粘合层可以从盖玻片上分离，以释放锥体腔内包含的活球体/类器官（固定前），以便使用其他程序分析细胞，例如RNA测序，组学方法， 体外 实验和 体内 移植。

1. 将样品仍在培养皿和生物安全罩中，使用刀片（如手术刀）切割纹理粘合剂层的一角。
2. 用镊子捏住切割边缘上的纹理粘合剂层，然后将其从玻璃盖玻片上轻轻剥离，但将其浸入培养基中（一些类器官可能残留在粘合剂层中， 图 13）。
3. 用培养基冲洗3次，并通过移液收集类器官。

结果

图8F 显示了成功制造后细胞培养盖玻片的典型方面。紫外光固化的粘合剂层看起来很平坦，并且很好地粘附在盖玻片上。如果盖玻片上的粘合层过度固化，或者如果平坦的PDMS基材的去除不正确（如图 8G，H所示），则盖玻片上的粘合剂层的转移可能会失败。在这两种情况下，故障都是显而易见的，因为没有纹理薄膜转移到盖玻片上。

讨论

本文描述了微孔培养皿的制备方法，该培养皿允许高密度类器官培养和分化。由于微腔的几何形状和排列，可以在单个板中长时间（数周或更长时间）培养和染色数千个球体，几乎没有材料损失。相比之下，细胞培养板上4 mm x 2 mm的区域可以包含与单个384孔板一样多的球状体，面积为12 cm x 8 cm。

微腔的规律分布和用作基质的扁平标准盖玻片能够以 3D 方式监测数千个活的或固?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Thermofisher scientific	AA19397K7
Acetone	Thermofisher scientific	AA19392K7
BC43 Benchtop Confocal Microscope	Andor Technology		spinning disk confocal microscope
bovine serum albumin	Thermofisher scientific	37525
Buffered oxide etching solution	Merck	901621-1L
CEE Spin Coater	Brewer Science	200X
DAPI	Thermofisher scientific	62248
Developer AZ400K	Merck	18441223164
DI Milliq water	Millipore
Fetal Bovine Serum (FBS)	Invitrogen	10082147
Glass coverslips	Marienfled	117650	1.5H, round 25 mm diameter
Hepes	Invitrogen	15630080
Imaris software	BitPlane		image analysis software
Inverted Transmission optical microscope	Nikon	TSF100-F
Labsonic M	Sartorius Stedium Biotech		Ultrasonic homogenizer
Lipidure	NOF America	CM5206	bio-mimetic copolymer
NOA73	Norland Products	17-345	UV curable adhesive
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063
Phalloidin	Thermofisher scientific	A12379	Alexa Fluor
Phosphate Buffer Solution	Thermofisher scientific	10010023
Photo Resist AZ5214E	Merck	14744719710
Pico Plasma tool	Diener Electronic GmbH + Co. KG	Pico Plasma	For O2 plasma treatment
RapiClear 1.52	Sunjin lab	RC 152001	water-soluble clearing agent
RCT Hot Plate/Stirrer	IKA (MY)
Reactive Ion Etching tool	Samco Inc. (JPN)	RIE-10NR
RPMI 1640	Invitrogen	11875093	culture medium for HCT116 cells
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	4019862	Polydimethylsiloxane or in short, PDMS
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	448931-10G
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	surfactant
Trypsin EDTA	Thermofisher scientific	15400054
Ultrasonic Cleaner	Bransonic	CPX2800
UV-KUB 2	KLOE		UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density
UV mask aligner	SUSS Microtec Semiconductor (DE)	MJB4