Organoidlerin kültürü ve 3D görüntülenmesi için yüksek verimli bir platform

Özet

Bu yazıda, organoidlerin yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak kültürlenebildiği ve gözlemlenebildiği^mm2 başına yüzlerce mikro konteynere sahip yeni bir kültür substratı türü için bir üretim protokolü sunulmaktadır. Hücre tohumlama ve immün boyama protokolleri de detaylandırılmıştır.

Özet

Çok sayıda üç boyutlu (3D) organotipik kültürün (organoid) farklı çözünürlük ölçeklerinde karakterizasyonu günümüzde standart görüntüleme yaklaşımları ile sınırlıdır. Bu protokol, minimum manipülasyon gerektiren ve 300 organoid / s'ye kadar görüntüleme verimi yapabilen kullanıcı dostu bir cihazda çok ölçekli, 3D canlı görüntülemeye olanak tanıyan mikrofabrikasyonlu organoid kültür çipleri hazırlamanın bir yolunu açıklar. Bu kültür çipleri hem hava hem de daldırma hedefleriyle (hava, su, yağ ve silikon) ve çok çeşitli yaygın mikroskoplarla (örneğin, dönen disk, nokta tarayıcı konfokal, geniş alan ve parlak alan) uyumludur. Ayrıca, tek amaçlı, tek düzlemli aydınlatma mikroskobu (SPIM) teknolojisi (soSPIM) gibi ışık tabakası modaliteleri ile kullanılabilirler.

Burada açıklanan protokol, mikrofabrikasyon kültür çiplerinin hazırlanması ve organoidlerin kültürü ve boyanması için ayrıntılı adımlar vermektedir. Aşina olmak için sadece kısa bir süre gerekir ve sarf malzemeleri ve ekipmanlar normal biyolablarda kolayca bulunabilir. Burada, 3D görüntüleme yetenekleri yalnızca ticari standart mikroskoplarla gösterilecektir (örneğin, 3D rekonstrüksiyon için dönen disk ve rutin izleme için geniş alan mikroskobu).

Giriş

Bundan böyle organoidler olarak adlandırılacak olan organotipik 3B hücre kültürlerinde, kök hücreler farklılaşır ve gerçek organlarla güçlü morfolojik ve fonksiyonel benzerlikler paylaşan mekansal yapılara kendi kendini organize eder. Organoidler, insan biyolojisini ve vücut dışındaki gelişimini incelemek için değerli modeller sunar ^1,2,3. Karaciğeri, beyni, böbreği, akciğeri ve diğer birçok organı taklit eden giderek artan sayıda model geliştirilmektedir ^2,4,5. Organoidlerde farklılaşma, çözünür büyüme faktörlerinin ve hücre dışı bir matrisin kesin bir zaman dizisine eklenmesiyle yönlendirilir. Bununla birlikte, organların belirgin aksine, organoidlerin gelişimi oldukça heterojendir.

Çok sayıda^{biyolojik zorluğun 6,7} ötesinde, organoid kültürler hücre kültürü yöntemleri, transkriptomiklerin karakterizasyonu ve görüntüleme açısından teknolojik zorluklar da ortaya koymaktadır. İn vivo organ gelişimi, hücre düzenlemelerinin oldukça basmakalıp bir şekilde kendi kendine organizasyonu ile sonuçlanan biyolojik bir ortamda meydana gelir. Herhangi bir fenotipik değişiklik, hastalıklı bir durumu teşhis etmek için bir vekil olarak kullanılabilir. Buna karşılık, organoidler, hücre kültürü koşullarıyla uyumlu, minimal kontrollü mikro ortamlarda in vitro olarak gelişir ve bu da her bir organoid için gelişim yolunda ve şekil oluşumunda büyük değişkenliğe neden olur.

Yakın zamanda yapılan bir çalışma⁸, organoid şeklin (fenotip tanımlayıcıları) kantitatif görüntülenmesinin, birkaç genetik belirtecin değerlendirilmesine bağlı olarak, fenotipik gelişim manzaralarının tanımlanmasına izin verdiğini göstermiştir. Muhtemelen, organoidlerdeki genomik ekspresyon çeşitliliğini fenotipik davranışlarıyla ilişkilendirme yeteneği, organotipik kültürlerin tüm potansiyelini açığa çıkarmaya yönelik önemli bir adımdır. Bu nedenle, 3D ^9,10'da hücre altı, çok hücreli ve tüm organoid ölçeklerde organoid özelliklerin karakterizasyonuna izin veren özel, yüksek içerikli görüntüleme yaklaşımlarının geliştirilmesi için yalvarmaktadır.

Aerodinamik organoid kültürüne (izole insan embriyonik kök hücrelerinden [hESC'ler], insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden [hIPSC'ler] veya birincil hücrelerden 3D, çok hücreli, farklılaştırılmış organoidlere) ve hızlı, invaziv olmayan 3D görüntülemeye izin veren çok yönlü bir yüksek içerikli tarama (HCS) platformu geliştirdik. JeWells çipi (bundan böyle çip olarak anılacaktır) adı verilen yeni nesil, minyatürleştirilmiş, 3D hücre kültürü cihazını entegre eder ve tek nesneli ışık tabakası mikroskobu¹¹ ile hızlı, 3D, yüksek çözünürlüklü görüntülemeye izin veren 45 ° aynalarla çevrili binlerce iyi dizilmiş mikro kuyu içerir. Herhangi bir standart, ticari, ters çevrilmiş mikroskopla uyumlu olan bu sistem, 300 organoidin <1 saatte hücre altı çözünürlükle 3D olarak görüntülenmesini sağlar.

Hücre kültürü cihazının mikrofabrikasyonu, tabana göre kare tabanlı ve 45 ° 'de yan duvarlara sahip yüzlerce mikropiramit (Şekil 1A) içeren mevcut bir mikro yapılandırılmış kalıptan başlar. Şekil 1C, bu tür yapıların elektron mikroskobu (EM) görüntülerini göstermektedir. Kalıbın kendisi poli(dimetilsiloksan) (PDMS) 'den yapılmıştır ve standart yumuşak-litografik prosedürler kullanılarak karşılık gelen özelliklere (boşluklar olarak) sahip bir birincil kalıbın (burada gösterilmeyen) bir kopyası olarak yapılabilir. Birincil kalıp farklı prosedürlerle üretilebilir. Bu protokol için kullanılan, Galland ve ark.'da bildirildiği gibi silikon ıslak aşındırma kullanılarak yapılmıştır. ¹¹; birincil kalıbın imalat prosedürü bu protokol için kritik değildir. Piramitler, X ve Y yönleri için aynı perdeye sahip kare bir dizide düzenlenmiştir (bu durumda perde 350 μm'dir).

Örnek olarak, çipin kuyulardaki ilk hücrelerin sayısını tam olarak tanımlarken uzun vadeli kültür (aylar) ve farklılaşma protokollerine izin verdiğini göstermek için kavram kanıtı deneyleri¹² yayınlandı. Çok sayıda organoidin bireysel gelişimi, standart parlak alan ve 3D ışık tabakası floresan mikroskopları kullanılarak canlı olarak otomatik olarak izlenebilir. Ayrıca, organoidler daha ileri biyolojik araştırmalar yapmak için alınabilir (örneğin, transkriptomik analiz). Bu makale, hücre kültürü kapaklarının üretimi, floresan mikroskobu için tohumlama ve boyama prosedürü ve organoidlerin geri alınması için ayrıntılı protokolleri özetlemektedir.

Protokol

NOT: Bu protokolün ilk kısmı, hücre kültürü cihazının mikrofabrikasyonunu detaylandırır. Piramidal boşluklara sahip orijinal bir birincil kalıp, mikro üretim tesisleri mevcutsa şirket içinde üretilebilir veya dış şirketlere dış kaynak olarak sağlanabilir. Bu işte kullanılan birincil kalıp, başka bir yerde^11,13 olarak açıklanan imalat süreci adımları ile şirket içinde üretilmektedir. Kalıbın mikrofabrikasyonu için temel bir protokol Ek Dosya 1'de mevcuttur. KRİT: 1'den 6'ya kadar olan adımlardaki işlemlerin tozsuz bir ortamda yapılması gerekir. Laminer davlumbaz veya varsa temiz oda tercih edilir. Tüm bu adımlar boyunca, eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlükleri gibi kişisel koruyucu ekipmanların (KKD) kullanılması gerekir.

1. PDMS kalıbının doğranması

1. PDMS kalıbının küçük kısımlarını son cihaz için gereken boyuta kadar kesin (örneğin, 1 cm x 1 cm [Şekil 1B]). Bunları dizinin XY yönlerine paralel olarak kesin.
   KRİT: PDMS kalıbını 1 cm x 1 cm zarlarla keserken, kesimleri tek adımda uygulayın; tek taraflı bir tıraş bıçağı kullanarak, basınç uygulayın ve PDMS'yi tek bir adımda kesin. Bu, kalıbın yüzeyinde birikebilecek ve replika adımlarının kalitesini etkileyebilecek küçük PDMS parçacıklarının oluşumunu önlemek içindir (adım 3).

2. Düz PDMS substratlarının hazırlanması

1. ~ 15-20 g PDMS baz reçinesini ve 1.5-2 g retikülasyon ajanını (yani, 10: 1 oranında) tartın, dikkatlice karıştırın ve ~ 20 dakika boyunca bir vakum kavanozunda gazdan arındırın.
2. Gazdan arındırılmış PDMS'yi yavaşça plastik, 15 cm genişliğinde (çaplı) bir Petri kabına dökün.
3. Petri kabını 2 saat boyunca 65 ° C'de ayarlanmış bir fırında tutarak PDMS'yi iyileştirin. Kürlemenin tamamlanmasını bekledikten sonra, ~ 1,5 mm kalınlığında (Petri kabında bulunan) düz bir PDMS filmi kullanıma hazırdır (Şekil 2A).
4. Keskin bir bıçak kullanarak, PDMS'den 2 cm x 2 cm'lik parçalar kesin (Şekil 2B-D).
   NOT: Bu PDMS sayfasının tam kalınlığı kritik değildir; ~1-2 mm uygun bir aralıktır. Kesimin boyutu, dokulu kalıptan daha büyük olmalı, ancak çok daha büyük olmamalıdır, bu da malzemenin boşa harcanmasına neden olur.

3. UV kürlenebilir yapıştırıcıdan yapılmış dokulu tabakanın üretimi

1. Bir PDMS kalıp zarını (adım 1'de hazırlandığı gibi) düz PDMS kesiminin üzerine (adım 2'de hazırlandığı gibi) yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 3A, B).
   NOT: Kalıptaki piramidal çıkıntıların düz PDMS substratına doğru yönlendirildiğinden ve kesilmiş piramitlerin yalnızca üst yüzeyinin temas halinde olduğundan emin olun. Doğru yerleşimi optik mikroskopla değerlendirin (Şekil 3C,D).
2. Kalıbın bir tarafına, bir pipet kullanarak, az miktarda (iki damla, yaklaşık 0.1-0.2 mL) UV kürlenebilir yapıştırıcı bırakın (Şekil 4A).
   NOT: Sıvı kalıbın kenarı ile temas ettiğinde, kapillarite, kalıbın kendisi ile substrat olarak kullanılan PDMS'nin düz kesimi arasındaki boşluğu doldurmak için sıvıyı tahrik edecektir.
   1. Sıvının boşluk içindeki ilerlemesini takip edin, örneğin, 10x büyütme hedefine sahip ters çevrilmiş bir optik mikroskop kullanarak (Şekil 4B, C).
3. UV ile kürlenebilen yapıştırıcıyı kürlemek için UV ışığına maruz bırakın. Kullanılan UV kaynağının güç yoğunluğuna bağlı olarak maruz kalma süresini ayarlayın (örneğin, 35 mW /^cm2 güç yoğunluğuna sahip bir UV-LED kutusu; yapıştırıcıyı tamamen iyileştirmek için bu protokolde% 50 güçte 2 dakika).
4. Bir kenardaki fazla miktarda yapıştırıcıyı kullanarak, kürlenmiş yapıştırıcıyı düz PDMS substratı üzerinde parmağınızla hafifçe bastırarak tutun (Şekil 5A, B). Bu arada, kalıbın bir köşesini tutulan aynı kenarın yanına sıkıştırmak için cımbız kullanın ve dokulu filmin de yukarı kaldırılmadığından emin olurken yavaşça soyun.
   NOT: Şekil 5C, uygun bir kalıp çıkarma prosedürünün sonucunu göstermektedir; Şekil 5E-G yanlış prosedürü göstermektedir.
5. Kürlenmiş, dokulu, yapışkan tabakayı PDMS üzerinde düz bırakmak için fazla yapıştırıcıyı ve fazla PDMS substratını bir tıraş bıçağı kullanarak kesin ve yalnızca bir kenarda fazla PDMS (Şekil 5D), bu da adım 5'te gerekli olacaktır.

4. Coverslip substrat hazırlığı

NOT: Son cihaz için bir alt tabaka olarak, 25 mm çapında standart yuvarlak 1,5H kapak kayışları kullanılır. Kullanılmadan önce, yüzeylerinden toz ve / veya organik kalıntıları gidermek için temizlenmeleri gerekir.

1. Kapak kapağı temizliği
   1. Ultrason uygulanırken kapakları 5 dakika sabunlu suya batırın (40 kHz, 110 W sonik güç).
   2. Kapak kapaklarını temiz deiyonize (DI) suda, önce daldırarak ve son olarak bir musluktan akan DI suyuyla yıkayın. Kapak kapaklarını bir N₂ gaz üfleme tabancası ile kurulayın.
   3. Kapak kapaklarını 5 dakika boyunca bir aseton banyosuna batırın; hemen 5 dakika daha 2 propanol (IPA) banyosuna geçin.
   4. Bir sıkma şişesi kullanarak kapakları temiz IPA ile durulayın. Kapak kapaklarını N₂ gaz üfleme tabancası ile kurulayın.
      NOT: Bu prosedür kullanılarak temizlenen kapaklar, ihtiyaç duyulana kadar kapalı bir kapta saklanabilir. Yüzeylerinde nem birikmesini önlemek için kuru bir dolapta tutun.
2. Kullanıma hazır olduğunda, temiz bir kapak kapağını hidrofilikliğini iyileştirmek için kısa bir_O2 plazma işlemiyle işlemden geçirin: O₂ 20 sccm, 3 mbar basınç, RF güç jeneratöründe 60 W ve 60 s süre.
3. Plazma aktivasyonundan hemen sonra, kapak kaymasını standart bir spin-coater'ın vakum mandren üzerine yerleştirerek ve kapak kapağının ortasına küçük bir yapıştırıcı damlası dökerek ince UV kürlenebilir yapıştırıcı tabakasını spin kaplamaya devam edin (Şekil 6). Spin kaplama işlemini çalıştırın: 500 rpm'de 5 sn yayma, 45 s için 3.000 rpm'de kaplama (hızlanma ve yavaşlama 100 rpm / s'de ayarlanmışken).
   1. Spin kaplama mevcut değilse, kapak kapaklarında ince bir UV yapıştırıcı filmi üretmek için aşağıdaki alternatif yolu kullanın:
      1. Temiz bir kapak kapağı üzerine, bir pipet kullanarak ~ 0,1 mL UV kürlenebilir yapıştırıcı bırakın (Şekil 7A).
      2. İkinci bir kapak kapağı alın ve sıvı yapıştırıcının iki kapak kapağı arasında eşit olarak yayılmasını sağlamak için birincisinin üzerine yerleştirin (Şekil 7B-D).
      3. Yayılan yapıştırıcı kapak kapaklarının kenarlarına ulaştığında, birbiri üzerine kaydırarak yavaşça ayırın. Ayrıldıktan sonra, her iki kapak kapağı da ince bir sıvı yapıştırıcı tabakası ile tamamen kaplanır (Şekil 7E).
         NOT: Kaplama, yalnızca ayırma düzgün ve sürekli bir hareketle yapılmazsa düzgün ve pürüzsüz olmayabilir.
4. UV ile kürlenebilir yapıştırıcının kürlenmesi
   1. Spin kaplamadan sonra, yapıştırıcıyı UV'ye maruz bırakarak önceden kürleyin. Kullanılan UV kaynağının güç yoğunluğuna bağlı olarak maruz kalma süresini ayarlayın (burada, %50 güçte 1 dakika boyunca 35 mW/^cm2 güç yoğunluğuna sahip bir UV-LED kutusu kullanılmıştır).
      KRİT: Burada kullanılan yapıştırıcı optik bir yapıştırıcıdır. Tedavisi için enerji dozlarıyla ilgili kilit noktalar için tartışmaya bakın.

5. Dokulu filmin son substrata aktarılması

1. Dokulu filmlerden birini alın (adım 3'te hazırlanmış) ve yapışkan kaplı kapak kapağı ile temas ettirin (adım 4'te hazırlanmıştır). Kapak kapağı üzerindeki kısmen kürlenmiş yapıştırıcı ile dokulu film arasındaki temasın mümkün olduğunca homojen olduğundan emin olun (Şekil 8A-C).
   KRİT: Bu aşamada, kapak kayması üzerindeki yapıştırıcı, temas ettiğinde dokulu filmin piramidal boşluklarını dolduracak şekilde yeniden akmayı önleyecek kadar sağlam olmalı, aynı zamanda dokulu filme hafifçe bastırılarak temasın optimize edilebileceği kadar plastik ve yapışkan olmalıdır.
2. Kapak kapağı üzerindeki yapışkan tabaka tamamen kürlenene kadar kapak kaymalarını UV ışığına maruz bırakın. Bu, dokulu filmi kapak kayması üzerinde kapatacak ve piramidal boşluklar arasında sızdırmaz izolasyon sağlayacaktır.
3. Son olarak, PDMS düz substratını soyun (Şekil 8D-F). Cımbız kullanarak, PDMS'yi kırpmadan sonra fazla malzemenin bırakıldığı kenardaki bir köşeye sıkıştırın (adım 3.5). Bu şekilde, dokulu film tabakası, hücre tohumlaması için üstte açık erişimli kapak kapağına yapışkan olarak bırakılır. KRİT: Düz PDMS'yi soyarken, dokulu film kapak kaymasına iyi tutturulmuş kalmalıdır. Dokulu film, UV'ye son kez maruz kaldıktan sonra herhangi bir çaba sarf etmeden kapak kapağından soyulabiliyorsa, yapışma hataları kolayca doğrulanır.

6. Hücre kültürü kapağının hücre kültürü için uzun süreli pasivasyonu

NOT: Pasivasyon, hücre zarındaki polar fosfolipit grubuna benzer bir yapıya sahip bir biyomimetik kopolimerin konformal ve sürekli bir kaplamasının üretilmesiyle elde edilir. Bu konformal kaplama, hücrelerin hücre kültürü cihazına yapışmasını önler

1. Saf etanol içinde çözünmüş biyomimetik kopolimerin% 0.5'i (w / v) ile bir çözelti hazırlayın. Çözeltiyi ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
2. Hücre kültürü kapağını 35 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve biyomimetik kopolimer çözeltisi ile tamamen örtün.
3. 5 dakika sonra, hücre kültürü kapağını biyomimetik kopolimer çözeltisi ile kaptan çıkarın ve bir biyogüvenlik başlığında (>1 saat) son kabın içindeki oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   NOT: Kaplama çözeltisindeki biyomimetik kopolimerin konsantrasyonu artırılarak daha kalın bir kaplama üretilebilir; daha kalın bir kaplamanın sonuçları parlak alan mikroskobu altında görülebilir (Şekil 9A).

7. Hücre tohumlama

1. Gaz giderme ve sterilizasyon
   1. Hücre tohumlamadan hemen önce, steril fosfat tamponlu salin (PBS) hücre kültürü kaplarına (tipik olarak 35 mm'lik bir Petri kabı için 1 mL) dağıtın. Kabı steril PBS ile ~ 10 dakika boyunca ultrasonik bir cihaz kullanarak gazdan arındırın, ardından tüm kabarcıkları çıkarmak için birkaç tur pipetleme yapın.
      KRİT: Hava piramidal boşlukların içinde sıkışırsa, hücrelerin onlara girmesini önleyecektir. Hücre tohumlamadan önce piramitte sıkışmış hava olmadığından emin olmak için, bu boşluklarda hava bulunmadığından görsel olarak (10x veya 20x büyütmede bir tezgah üstü parlak alan mikroskobu altında) emin olmanız önerilir (Şekil 10).
   2. PBS'yi steril kültür ortamı ile değiştirin ve plakayı bir hücre kültürü başlığı altında 30 dakika boyunca UV ışığıyla sterilize edin.
      NOT: Bu adımdan itibaren, çanak steril olarak kabul edilmeli ve steril teknikler kullanılarak manipüle edilmelidir. Hücre kültürü cihazından sıkışmış havayı çıkarmanın alternatif bir yolu, vakum pompalı bir vakum kavanozu kullanmaktır.
2. Hücre süspansiyonu hazırlığı
   NOT: Hücreler tek veya küçük hücre agregaları olarak tohumlanabilir ve numune kuyucuklarına üst açıklıktan girilebilir. Zamanla, yerleştirilen hücreler toplanır ve numune kuyucuklarının içinde büyür ve açıklığın boyutundan daha büyük bir boyuttaki sferoidlere dönüşür. Doğrulanmış hücre hattı modelleri olarak, önerilen kültür ortamında (ATCC kılavuzları) tutulan HCT116 (CCL-247 ATCC) veya MCF7 (HTB-22 ATCC) kanser hücrelerini kullanın.
   1. Bir hücre süspansiyonu hazırlayın (örneğin, ATCC yönergelerini izleyerek bir tripsinizasyon işlemi kullanarak). İlgilenilen hücreler için tripsinizasyon/hücre süspansiyonu hazırlama önerilerini takip edin.
   2. Önerilen kültür ortamında hücre konsantrasyonunu 0,5 × 10⁶ hücre / mL'ye sayın ve ayarlayın.
3. Hücre dağıtımı
   1. PBS arabelleğini 35 mm'lik hücre kültürü kabından çıkarın ve ardından ayarlanmış hücre süspansiyonunun 1 mL'sini dağıtın. Yeterli hücre yoğunluğu ve homojenliğine sahip bir hücre tohumlama prosedürünün optik mikroskop görüntüsü için Şekil 11A'ya bakınız.
   2. Hücre kültürü kabını 10 dakika boyunca hücre inkübatörüne (37 ° C,% 5 CO₂ ve% 100 nem) geri yerleştirin. Her piramidal boşluğa yaklaşık 80-100 hücre girecektir.
      NOT: Hücre kültürü kabı başına düşen hücre sayısını, hücre konsantrasyonunu veya hücre süspansiyonunun çıkarılmasından önce harcanan süreyi artırarak artırmak mümkündür. Tipik olarak, sferoid oluşumu hücre tohumlamasından sonra birkaç saat sürer (hücre tipine bağlı olarak) ve parlak alan mikroskobu ile takip edilebilir (4x ila 40x hedefler; Şekil 11). Buradan, kültür ortamı, hücre dışı matrisler ve farklılaşma büyüme faktörleri, birkaç gün, hafta veya ay sürebilen tipik farklılaşma protokollerine uygun olarak sferoidleri içeren hücre kültürü kabına değiştirilebilir veya eklenebilir.
   3. 10 dakikalık inkübasyondan sonra, hücre kültürü çanağını inkübatörden geri kazanın ve sıkışmamış hücreleri çıkarmak için hücresel süspansiyonu yavaşça aspire edin. 35 mm'lik bir kaba 1 mL kültür ortamı ekleyin ve tekrar hücre inkübatörüne yerleştirin.
      KRİT: Bu aşamada, sferoidler henüz oluşmadığından, hücrelerin kaybına neden olacak güçlü aspirasyon veya dağıtımdan kaçınmak çok önemlidir. Masaüstü parlak alan mikroskobu kullanarak görsel kontrol bu adımda şiddetle tavsiye edilir.

8. İmmün boyama ve görüntüleme

1. Fiksasyon ve boyama
   NOT: Farklı klasik fiksasyon ve immün boyama prosedürleri, hücre kültürü kabı ile tamamen uyumludur. Burada tipik bir protokol açıklanmaktadır.
   1. Hücre kültürü kabındaki organoidleri / sferoidleri oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit içinde 20 dakika boyunca sabitleyin.
   2. Organoidleri, bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de steril PBS'de% 1 sürfaktan çözeltisinde% 1 yüzey aktif madde çözeltisinde 24 saat boyunca geçirgenleştirin ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de bloke edici tamponda (% 2 sığır serum albümini [BSA] ve% 1 yüzey aktif madde) 24 saat boyunca inkübe edin.
   3. 1/50 ile 1/200 arasında (veya üreticinin tavsiyelerine göre) antikor seyreltme tamponunda (steril PBS'de% 2 BSA ve% 0.2 yüzey aktif madde) 48 saat boyunca 4 °C'de seyreltmede ilgilenilen birincil antikorlara sahip numuneleri inkübe edin.
   4. Numuneleri bir orbital çalkalayıcı üzerinde yıkama tamponu ile 3 kat durulayın (steril PBS'de% 3 NaCl ve% 0.2 yüzey aktif madde) ve antikor seyreltme tamponunda karşılık gelen ikincil antikorlarla inkübe edin (1/100 ila 1/300 arasında veya üreticinin tavsiyelerine göre seyreltme), 0.5 μg / mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ve 0.2 μg / mL Alexa Fluor 647 veya 488 Phalloidin 4 °C'de orbital çalkalayıcıda 24 saat boyunca, PBS ile beş durulama adımını takip eder. İsteğe bağlı olarak, numuneleri 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmış suda çözünür bir temizleme maddesi kullanarak monte edin.
2. Görüntüleme
   NOT: Bu aşamada, mikrowell plakasındaki organoidler, görüntüleme için sabit ve lekeli numuneler içeren normal bir kültür kabı olarak düşünülebilir: herhangi bir standart görüntüleme prosedürü, adaptasyon veya modifikasyon gerektirmeden kullanılabilir. Şekil 12 , dönen disk konfokal mikroskop kullanılarak elde edilen görüntülerin ve 3D rekonstrüksiyonun, 40x hava hedefi (sayısal diyafram açıklığı 0.75) ile temsili bir sonucunu göstermektedir.
   1. Aşağıdaki ayarlarla otomatik görüntü alma işlemi için oluşturucu yazılımı kullanın: pozlama süresi = 50 ms, bir z-yığını elde etmek için z motorlu bir aşama ile (toplam 70 μm yükseklik için 1 μm Z-adımı).
   2. Görüntü analiz yazılımını kullanarak 3D rekonstrüksiyon gerçekleştirin.

9. Organoidlerin serbest bırakılması ve toplanması

NOT: Hücre kültürü çanağının dokulu yapışkan tabakası, RNA dizilimi, -omik yaklaşımlar, in vitro deneyler ve in vivo transplantasyon gibi diğer prosedürlerle hücrelerin analizi için piramidal boşlukların içinde bulunan canlı sferoidleri / organoidleri (fiksasyondan önce) serbest bırakmak için kapak kaymasından ayrılabilir.

1. Numune hala Petri kabında ve biyogüvenlik başlığındayken, dokulu yapışkan tabakanın bir köşesini kesmek için neşter gibi bir bıçak kullanın.
2. Cımbızla, dokulu yapışkan tabakayı kesilmiş kenara sıkıştırın ve cam kapak kaymasından yavaşça soyun, ancak ortama batırılmış halde tutun (bazı organoidler yapışkan tabaka ile kalıyor olabilir, Şekil 13).
3. Kültür ortamı ile 3x durulayın ve pipetleme yaparak organoidleri toplayın.

Sonuçlar

Şekil 8F, başarılı bir imalattan sonra bir hücre kültürü kapağının tipik yönünü göstermektedir. UV ile kürlenebilir yapışkan tabaka düz görünür ve kapak kaymasına iyi yapışır. Kapak kayması üzerindeki tabaka aşırı kürlenirse veya düz PDMS substratının çıkarılması yanlış yapılırsa (Şekil 8G, H'de gösterildiği gibi) yapışkan tabakanın kapak kayması üzerindeki transferi başarısız olabilir. Her i...

Tartışmalar

Yüksek yoğunluklu organoid kültür ve farklılaşmaya izin veren mikrowell kültür kabının üretim prosedürü bu makalede açıklanmıştır. Mikro boşlukların geometrisi ve düzenlenmesi sayesinde, binlerce sferoid, neredeyse hiç malzeme kaybı olmadan uzun süre (birkaç hafta veya daha fazla) tek bir plakada kültürlenebilir ve boyanabilir. Bir karşılaştırma olarak, hücre kültürü plakasındaki 4 mm x 2 mm'lik bir alan, 12 cm x 8 cm'lik bir alana sahip tek bir 384 kuyucuklu plaka kadar sferoid içere...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol	Thermofisher scientific	AA19397K7
Acetone	Thermofisher scientific	AA19392K7
BC43 Benchtop Confocal Microscope	Andor Technology		spinning disk confocal microscope
bovine serum albumin	Thermofisher scientific	37525
Buffered oxide etching solution	Merck	901621-1L
CEE Spin Coater	Brewer Science	200X
DAPI	Thermofisher scientific	62248
Developer AZ400K	Merck	18441223164
DI Milliq water	Millipore
Fetal Bovine Serum (FBS)	Invitrogen	10082147
Glass coverslips	Marienfled	117650	1.5H, round 25 mm diameter
Hepes	Invitrogen	15630080
Imaris software	BitPlane		image analysis software
Inverted Transmission optical microscope	Nikon	TSF100-F
Labsonic M	Sartorius Stedium Biotech		Ultrasonic homogenizer
Lipidure	NOF America	CM5206	bio-mimetic copolymer
NOA73	Norland Products	17-345	UV curable adhesive
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15070063
Phalloidin	Thermofisher scientific	A12379	Alexa Fluor
Phosphate Buffer Solution	Thermofisher scientific	10010023
Photo Resist AZ5214E	Merck	14744719710
Pico Plasma tool	Diener Electronic GmbH + Co. KG	Pico Plasma	For O2 plasma treatment
RapiClear 1.52	Sunjin lab	RC 152001	water-soluble clearing agent
RCT Hot Plate/Stirrer	IKA (MY)
Reactive Ion Etching tool	Samco Inc. (JPN)	RIE-10NR
RPMI 1640	Invitrogen	11875093	culture medium for HCT116 cells
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	4019862	Polydimethylsiloxane or in short, PDMS
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	448931-10G
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284	surfactant
Trypsin EDTA	Thermofisher scientific	15400054
Ultrasonic Cleaner	Bransonic	CPX2800
UV-KUB 2	KLOE		UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density
UV mask aligner	SUSS Microtec Semiconductor (DE)	MJB4