JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لتصميم مواد مساعدة فعالة بشكل عقلاني ، قمنا بتطوير مستحلب بيكرينغ المستقر بالجسيمات النانوية (PNPE) من حمض اللاكتيك والجليكوليك. يمتلك PNPE نعومة فريدة وواجهة كارهة للماء للاتصال الخلوي القوي وقدم تحميلا عالي المحتوى للمستضد ، مما أدى إلى تحسين التقارب الخلوي لنظام التوصيل إلى الخلايا المقدمة للمستضد وإحداث استيعاب فعال للمستضدات.

Abstract

التقارب الخلوي للجسيمات الدقيقة / النانوية هو الشرط المسبق للتعرف الخلوي ، والامتصاص الخلوي ، والتنشيط ، والتي تعتبر ضرورية لتوصيل الدواء والاستجابة المناعية. نشأت الدراسة الحالية من ملاحظة أن تأثيرات شحنة وحجم وشكل الجسيمات الصلبة على تقارب الخلية عادة ما يتم أخذها في الاعتبار ، لكننا نادرا ما ندرك الدور الأساسي للنعومة وظاهرة إعادة الهيكلة الديناميكية وتفاعل الواجهة المعقدة في التقارب الخلوي. هنا ، قمنا بتطوير مستحلب بيكرينغ المستقر بالجسيمات النانوية (PNPE) الذي تغلب على أوجه القصور في الأشكال الصلبة ومحاكاة مرونة وسيولة مسببات الأمراض. تم إعداد طريقة لاختبار تقارب PNPE مع أسطح الخلايا وتوضيح الاستيعاب اللاحق للخلايا المناعية. تم تحديد تقارب PNPE مع الحويصلات خارج الخلية المحاكية الحيوية (bEVs) - بديل الخلايا المتغصنة لنخاع العظم (BMDCs) - باستخدام توازن دقيق من بلورات الكوارتز مع مراقبة التبديد (QCM-D) ، مما سمح بالمراقبة في الوقت الفعلي للالتصاق مستحلب الخلية. بعد ذلك ، تم استخدام PNPE لتوصيل المستضد (ovalbumin ، OVA) ولوحظ امتصاص المستضدات بواسطة BMDCs باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM). أظهرت النتائج التمثيلية أن PNPE انخفض على الفور التردد (ΔF) عندما واجه bEVs ، مما يشير إلى الالتصاق سريع وتقارب عال ل PNPE مع BMDCs. أظهر PNPE ارتباطا أقوى بكثير بغشاء الخلية من الجسيمات الدقيقة PLGA (PMPs) ومساعد AddaVax (يشار إليه باسم مستحلب النانو المستقر بالسطحي [SSE]). علاوة على ذلك ، نظرا للتقارب الخلوي المعزز للخلايا المناعية من خلال تغيرات الانحناء الديناميكي والانتشار الجانبي ، تم تعزيز امتصاص المستضد لاحقا مقارنة ب PMPs و SSE. يوفر هذا البروتوكول رؤى لتصميم تركيبات جديدة ذات تقارب خلوي عالي واستيعاب فعال للمستضد ، مما يوفر منصة لتطوير لقاحات فعالة.

Introduction

لمكافحة الأمراض الوبائية والمزمنة والمعدية ، من الضروري تطوير مواد مساعدة فعالة للتطعيمات الوقائية والعلاجية 1,2. من الناحية المثالية ، يجب أن تمتلك المواد المساعدة أمانا ممتازا وتنشيطا مناعيا3،4،5. يعتقد أن الامتصاص الفعال وعملية المستضدات بواسطة الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) هي مرحلة أساسية في شلالات الإشارات النهائية وبدء الاستجابة المناعية6،7،8. ومن ثم ، فإن اكتساب فهم واضح لآلية تفاعل الخلايا المناعية مع المستضدات وتصميم المواد المساعدة لتعزيز الاستيعاب هي استراتيجيات فعالة لتعزيز كفاءة اللقاحات.

تم التحقيق سابقا في الجسيمات الدقيقة / النانوية ذات الخصائص الفريدة كأنظمة توصيل مستضد للتوسط في الامتصاص الخلوي للمستضدات والتفاعل الخلوي مع الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض 9,10. عند الاتصال بالخلايا ، تبدأ أنظمة التوصيل في التفاعل مع المصفوفة خارج الخلية وغشاء الخلية ، مما أدى إلى الاستيعاب والاستجابات الخلوية اللاحقة11,12. كشفت الدراسات السابقة أن استيعاب الجسيمات يحدث من خلال التصاق جسيمات غشاء الخلية13 ، يليه تشوه مرن لغشاء الخلية وانتشار المستقبل إلى الغشاء السطحي14,15. في ظل هذه الظروف ، تعتمد خصائص نظام التسليم على التقارب مع ناقلات الجنود المدرعة ، مما يؤثر لاحقا على كمية الامتصاص16,17.

للحصول على نظرة ثاقبة حول تصميم نظام التوصيل لتحسين الاستجابة المناعية ، تم تركيز جهود مكثفة على التحقيق في العلاقة بين خصائص الجسيمات والامتصاص الخلوي. نشأت الدراسة الحالية من ملاحظة أن الجسيمات الدقيقة / النانوية الصلبة ذات الشحنات والأحجام والأشكال المختلفة غالبا ما تتم دراستها في ضوء ذلك ، في حين نادرا ما يتم التحقيق في دور السيولة في استيعاب المستضد18,19. في الواقع ، أثناء الالتصاق ، أظهرت الجسيمات اللينة تغيرات انحناء ديناميكية وانتشارا جانبيا لزيادة مساحة التلامس للتفاعلات متعددة التكافؤ ، والتي بالكاد يمكن تكرارها بواسطة الجسيمات الصلبة20,21. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أغشية الخلايا عبارة عن طبقات ثنائية من الدهون الفوسفاتية (sphingolipids أو الكوليسترول) في موقع الامتصاص ، ويمكن للمواد الكارهة للماء أن تغير الإنتروبيا التوافقية للدهون ، مما يقلل من كمية الطاقة اللازمة لامتصاص الخلايا22,23. وبالتالي ، قد يكون تضخيم الحركة وتعزيز الكارهة للماء لنظام التوصيل استراتيجية فعالة لتعزيز استيعاب المستضد لتعزيز الاستجابة المناعية.

تم استخدام مستحلب Pickering ، الذي استقرت بواسطة جزيئات صلبة مجمعة عند الواجهة بين سائلين غير قابلين للامتزاج ، على نطاق واسع في المجال البيولوجي24,25. في الواقع ، تحدد الجسيمات المجمعة على السطح البيني للنفط / الماء صياغة هياكل متعددة المستويات ، والتي تعزز التفاعلات الخلوية لنظام التوصيل متعدد المستويات ، وتحفز بشكل أكبر الخصائص الفيزيائية الكيميائية متعددة الوظائف في توصيل الدواء. بسبب قابليتها للتشوه وحركتها الجانبية ، كان من المتوقع أن تدخل مستحلبات بيكرينغ في تفاعل خلوي متعدد التكافؤ مع الخلايا المناعية ويتم التعرف عليها بواسطة بروتينات الغشاء26. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن نوى المذيلة الزيتية في مستحلبات بيكرينغ غير مغطاة بالكامل بجزيئات صلبة ، فإن مستحلبات بيكرينغ لها فجوات بأحجام مختلفة بين الجسيمات الموجودة على واجهة الزيت / الماء ، مما يسبب مقاومة أعلى للماء. وبالتالي ، من الأهمية بمكان استكشاف تقارب مستحلبات بيكرينغ مع APCs وتوضيح الاستيعاب اللاحق لتطوير مواد مساعدة فعالة.

بناء على هذه الاعتبارات ، قمنا بتصميم مستحلب بيكرينغ المستقر للجسيمات النانوية PLGA (PNPE) كنظام توصيل لقاح سيولة ساعد أيضا في اكتساب رؤى قيمة في تقارب PNPE مع BMDCs والاستيعاب الخلوي. تمت مراقبة الالتصاق في الوقت الفعلي للحويصلات خارج الخلية المحاكية الحيوية (bEVs ؛ استبدال BMDCs) إلى PNPE عبر طريقة خالية من الملصقات باستخدام توازن دقيق من بلورات الكوارتز مع مراقبة التبديد (QCM-D). بعد توصيف تقارب PNPE إلى BMDCs ، تم استخدام الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (CLSM) لتحديد امتصاص المستضد. أشارت النتيجة إلى تقارب أعلى من PNPE إلى BMDCs ، والاستيعاب الفعال للمستضد. توقعنا أن يظهر PNPE تقاربا أعلى مع APCs ، مما قد يحفز بشكل أفضل استيعاب المستضدات لتعزيز الاستجابات المناعية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة في هذا البروتوكول من قبل معهد هندسة العمليات ، الأكاديمية الصينية للعلوم. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بما يتفق بدقة مع لوائح رعاية واستخدام المختبر والمبادئ التوجيهية للمراجعة الأخلاقية للحيوان (الصين ، GB / T35892-2018).

1. تحضير وتوصيف جسيمات PLGA النانوية

  1. تحضير جسيمات PLGA النانوية (PNPs)
    1. أضف 0.5 جم من كحول البولي فينيل (PVA) إلى 120 مل من الماء منزوع الأيونات عند 90 درجة مئوية وحركه حتى يذوب تماما لتحضير محلول PVA. قم بتخزين المحلول في الثلاجة (4 درجات مئوية) بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. أضف 100 مجم من PLGA إلى 10 مل من خليط الأسيتون والإيثانول (نسبة 4: 1) لتكون بمثابة مرحلة الزيت.
    3. ضع 20 مل من محلول PVA المائي تحت غطاء الدخان وحركه مغناطيسيا عند 400 دورة في الدقيقة / دقيقة. أضف 5 مل من مرحلة الزيت إلى محلول PVA قطرة قطرة باستخدام مضخة حقنة. ثم حرك الخليط في غطاء الدخان حتى تتبخر المذيبات العضوية تماما.
      ملاحظة: مع زيادة تركيز الجسيمات في مرحلة الزيت ، يتحول محلول طور الماء تدريجيا إلى أبيض مزرق فاتح واضح وشفاف أو أبيض حليبي.
    4. بعد تطاير المذيبات العضوية (2-3 ساعات) ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 15000 × جم. اغسل ثلاث مرات أو أكثر حتى يصبح ماء الغسيل النهائي صافيا وشفافا.
      ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة هو بشكل أساسي غسل PVA المتبقي على سطح الجسيمات لمنعه من التأثير على إعداد مستحلب بيكرينغ.
    5. أعد تعليق PNPs المغسولة في 2 مل من الماء منزوع الأيونات وقم بتجميد الخليط عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. قم بعد ذلك بتجميد الجسيمات في مجفف بالتجميد لمدة 48-72 ساعة. PNPs المعدة هي قطيع أبيض.
  2. توصيف PNPs
    1. لتوصيف حجم وإمكانات زيتا ل PNPs ، أضف 10 ميكرولتر من PNPs إلى 1 مل من الماء منزوع الأيونات للحصول على محلول مخفف ونقل المحلول المخفف إلى خلية DTS1070. قم بتشغيل الكمبيوتر ومحلل تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، ثم ضع خلية DTS1070 في نظام DLS.
    2. انقر فوق برنامج Zeta Size وقم بإنشاء ملف قياس جديد لإعداد إجراء التحديد. بعد ذلك ، ابدأ إجراء التحديد للحصول على حجم الجسيمات وتوزيع زيتا المحتمل.
    3. لمراقبة مورفولوجيا PNPs ، انشر محلول PNPs سعة 0.1 مل بالتساوي (مخفف 40 مرة) على لوح رقائق القصدير مقاس 5 سم × 5 سم واترك الماء يتبخر بشكل طبيعي في غطاء دخان جيد التهوية طوال الليل.
    4. قطع جزء صغير من رقائق القصدير وتثبيته على طاولة العينة بشريط موصل. رشها بالذهب بتيار 10 مللي أمبير لمدة 120 ثانية. لاحظ لاحقا التشكل السطحي للعينة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM).

2. إعداد وتوصيف PNPE

  1. لتحضير PNPE ، أضف PNPs المجففة بالتجميد إلى الماء منزوع الأيونات بتركيز 4 مجم / مل (المرحلة المائية) ثم أضف السكوالين كمرحلة زيت. تحضير PNPE عن طريق صوتنة خطوة واحدة لمدة 5 دقائق عند 100 واط في سونيكاتور حمام مائي. نسبة طور الزيت إلى الماء هي 1: 9.
  2. توصيف PNPE المعدة
    1. افتح برنامج Mastersizer 2000 والليزر بالتسلسل. انقر فوق قياس لفتح البرنامج المحدد مسبقا وتعيين اسم العينة. انقر فوق ابدأ لبدء قياس خلفية العينة ، ثم ، باستخدام قطارة ، أضف 1 مل من PNPE إلى خزان العينة لمحلل حجم جزيئات الليزر لقياس حجم جسيمات المستحلب ثلاث مرات بالتوازي.
    2. تمييع 20 ميكرولتر من PNPE في 1 مل من الماء منزوع الأيونات. إسقاط 20 ميكرولتر من المستحلب على الشريحة. مراقبة مورفولوجيا وتجانس المستحلب باستخدام المجهر الضوئي عند تكبير 40x والحصول على صور فوتوغرافية.
  3. كفاءة تحميل المستضد
    1. قم بإذابة 200 ميكروغرام من البومين البيضاوي (OVA) في 500 مل من الماء منزوع الأيونات. ثم امزجه مع 500 مل من PNPE المحضر ويهز لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المستضد السائل عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 20 دقيقة.
    2. تحديد تركيزات مستضد السوائل باستخدام مقايسات حمض البيسينتشونينيك (BCA)27. صيغة حساب كفاءة تحميل المستضد هي كما يلي:
      كفاءة تحميل المستضد = figure-protocol-3848
      استخدم نفس الطريقة لتحديد كفاءة تحميل المستضد ل SSE المستخدمة كمجموعة تحكم.
  4. استقرار PNPE
    1. قسم 6 مل من PNPE المحضر إلى ستة أجزاء متساوية ، وقم بتخزين ثلاثة أجزاء في كل منها عند 4 درجات مئوية و 25 درجة مئوية على التوالي. قم بتخفيف 20 ميكرولتر من PNPE المخزن في 1 مل من الماء منزوع الأيونات (1:50) في اليوم 0 و 3 و 6. بعد ذلك ، قم بقياس حجم وإمكانات زيتا لحلول مخزون PNPE المحفوظة في درجات حرارة مختلفة.
      ملاحظة: يتم ضبط درجات حرارة التخزين المختلفة لمقارنة تأثير درجات الحرارة المختلفة على استقرار PNPE ، والتي يمكنها تحسين حالة التخزين لتحقيق ثبات عال وعمر افتراضي طويل.
  5. تحضير الجسيمات الدقيقة PLGA (PMPs)
    1. قم بإذابة 500 مجم من PLGA في 5 مل من ثنائي كلورو الميثان كمرحلة زيت ، ثم صب 50 مل من الطور المائي الخارجي الذي يحتوي على 1.5٪ PVA للحصول على خليط الزيت / الماء. تجانس الخليط عند 3000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة باستخدام الخالط للحصول على مستحلبات خشنة.
    2. الحفاظ على توحيد حجم جسيمات PLGA للكرات المجهرية (التي تحددها المستحلبات الخشنة) عن طريق استحلاب الغشاء. قم بتركيب غشاء 5.2 ميكرومتر في أنبوب الغشاء. اضبط الضغط على 800 كيلو باسكال وحافظ على ثباته.
    3. افتح صمام العادم وصمام التغذية ، وبعد إضافة المستحلبات الخشنة إلى خزان العينة ، أغلق صمام العادم وصمام التغذية ، وافتح صمام التفريغ وصمام المدخل ، وخذ مستحلب ما بعد الفيلم في دورق سعة 200 مل. كرر العملية ثلاث مرات للحصول على مستحلبات ما قبل المزدوجة.
    4. حرك المستحلبات قبل المزدوجة لتبخير ثنائي كلورو الميثان في درجة حرارة الغرفة لعلاج الكرات المجهرية. اغسل الكريات المجهرية باستخدام الماء منزوع الأيونات على 7741 × جم لمدة 3 دقائق خمس مرات. قم بالتجميد المسبق في الفريزر عند -80 درجة مئوية وأخيرا قم بتجميده للحصول على كريات مجهرية جافة.
  6. توصيف PMPs
    1. افتح برنامج Mastersizer 2000 والليزر بالتسلسل. انقر فوق قياس لفتح البرنامج المحدد مسبقا وتعيين اسم العينة. انقر فوق ابدأ لبدء قياس خلفية العينة. بعد ذلك ، أضف 1 مل من PMPs إلى خزان إضافة العينة لمحلل حجم جزيئات الليزر باستخدام قطارة وقم بقياس حجم الجسيمات للجسيمات الدقيقة ثلاث مرات بالتوازي.
  7. تحليل النعومة
    ملاحظة: تم طلاء PNPE على مستشعر SiO2 لقياس النعومة.
    1. نظف شريحة مستشعر الكوارتز SiO 2 عن طريق المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية بالأوزون لمدة 10 دقائق ، واشطفها مرتين ب 5 مل من الإيثانول (75٪ v / v) ، وجففها باستخدام N2. قم بتثبيت شريحة مستشعر الكوارتز SiO2 الفارغة في خلية التدفق.
    2. قم بتشغيل الكمبيوتر وتنشيط التحكم في درجة الحرارة في أسفل يمين البرنامج للتأكد من أن درجة الحرارة المحددة تقل بمقدار 1 درجة مئوية تقريبا عن درجة حرارة الغرفة.
    3. انقر فوق الزر " اكتساب " في شريط الأدوات وحدد "إعداد القياس " للبحث عن الأوكتافات 1 و 3 و 5 و 7 و 9 و 11 من الشريحة في القناة المستخدمة. انقر فوق الزر " اكتساب" في شريط الأدوات وحدد بدء القياس.
    4. قم بتصحيح الخط الأساسي بالهواء، وعندما يكون الخط الأساسي متوازنا، حدد إيقاف واحفظ الملف كفراغ.
    5. نظف الرقاقة وقم بتدوير طبقة 10 ميكروغرام / مل من PNPE على الشريحة. لفترة وجيزة ، قم بتشغيل طلاء الدوران واضبط معلمة التشغيل. قم بتوصيل الأنبوب N2 بطبقة الدوران ، واضبط تجزئة أسطوانة الغاز على 0.4 كيلو باسكال ، وضع الشريحة النظيفة على كوب الشفط الخاص بمغطي الدوران. أضف 100 ميكرولتر من PNPE قطرة إلى مركز مستشعر SiO2 وأغلق الغطاء العلوي لطلاء الدوران لإكمال الطلاء.
    6. قم بتثبيت الشريحة المطلية ب PNPE في خلية التدفق. كرر الخطوات 2.7.3-2.7.4 واحفظ الملف بتنسيق PNPE. افتح كلا من الملفات الفارغة وملفات PNPE وانقر على زر Stitch للحصول على بيانات التبديد ذات الصلة (ΔD).

3. عزل وثقافة BMDCs 28

ملاحظة: تأكد من وضع جميع الكواشف والعينات على الجليد ، لأن هذا له تأثير إيجابي على نشاط الخلية. للحفاظ على العقم ، قم بتنفيذ جميع الخطوات على مقعد نظيف للغاية باستخدام أدوات معقمة.

  1. القتل الرحيم للفئران C57BL / 6 (أنثى ، عمرها 6-8 أسابيع) عن طريق استنشاق CO2 ونقعها في الإيثانول 70٪ (v / v) لتعقيم قصير.
  2. بعد النقع لمدة 3-5 دقائق ، انقل الفئران إلى مقعد نظيف للغاية. قم بإزالة عضلات الساق باستخدام مقص من الفولاذ المقاوم للصدأ لكشف عظم الفخذ والساق ، ثم افصل عظم الفخذ والساق.
  3. املأ طبق بتري بنسبة 70٪ (v / v) من الإيثانول وانقع العظام النظيفة فيه لمدة 5-10 ثوان لإكمال التعقيم الخارجي. نظف جميع العظام وضعها في أنبوب معقم مع الثلج حولها.
  4. تقليم عظم الفخذ والساق بالقرب من المفصل باستخدام مقص. أدخل إبرة المحقنة في العظم لطرد نخاع العظم في أنبوب طرد مركزي باستخدام وسيط RPMI المبرد مسبقا (1640).
  5. شطف مرتين أو ثلاث مرات حتى يصبح العظم أبيض تماما. ماصة نخاع العظم عدة مرات لفصل جميع الكتل. قم بتصفية الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل باستخدام غربال قطره 40 ميكرومتر.
  6. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية و 500 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأضف 2 مل من محللة كرات الدم الحمراء إلى الرواسب لمدة 4 دقائق.
  7. بعد الغسيل مرتين أو ثلاث مرات، أعد تعليق الخلايا في 2 مل من الوسط الكامل (1٪ بنسلين-ستربتومايسين، 10٪ مصل بقري جنيني، 20 نانوغرام/مل من IL-4، و10 نانوغرام/مل من GM-CSF). بعد ذلك ، قم بتخفيف 10 ميكرولتر من الخلايا إلى 1 مل من PBS وأدخل شريحة عداد الخلايا الآلي المحمول باليد في تخفيف الخلية لعد الخلايا. أخيرا ، خلايا البذور بكثافة 1 × 106 خلايا / مل في طبق استزراع 10 مم مع وسط كامل.
  8. زراعة الخلايا في حاضنة الخلايا مع 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية. تغيير الوسيط كل 2 أيام. في اليوم السابع ، انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 450 × جم لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا.

4. تحضير الحويصلات خارج الخلية المحاكية الحيوية (bEVs)

  1. قم بتجميع الطارد الصغير بالتسلسل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تأكد من عدم تصدع غلاف المحقنة قبل استخدامه. تأكد من أن جميع الحلقات O في حالة جيدة قبل كل تجربة واستبدل الحلقات البالية أو التالفة على الفور. يمكن أن تتسبب الحلقات O البالية أو التالفة في تحرير الضغط المفاجئ عند تشغيل الطارد.
  2. استنشاق BMDCs بشكل متكرر ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 450 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. ضغط على معلقات الخلية من خلال أغشية البولي كربونات 10 ميكرومتر و 5 ميكرومتر و 1 ميكرومتر لمدة 30 تمريرة باستخدام الطارد الصغير29.
    ملاحظة: لتمكين توحيد حجم bEV ، تم دفع أنظمة تعليق BMDC من خلال أغشية البولي كربونات 10 ميكرومتر و 5 ميكرومتر و 1 ميكرومتر لمدة 30 تمريرة. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء التشغيل ، تأكد من تطبيق القوة بالتساوي والحفاظ على اتجاه القوة على طول محور المحقنة.
  3. قم بالطرد المركزي للطاف المجمعة لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم و 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا. اجمع المادة الطافية وجهاز الطرد المركزي عليها عند 3000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا المتبقية وحطام الخلية.
  4. اجمع المادة الطافية وجهاز الطرد المركزي عليها عند 100000 × جم لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق المركبات الكهربائية المشبعة بالحيوية في 2 مل من محلول ملحي مخزن HEPES (HBS). تنقية bEVs عن طريق الترشيح من خلال غشاء 0.45 ميكرومتر وتخزين bEVs المنقى في -80 °C.

5. تلتزم bEVs ب PNPE

ملاحظة: تم تعديل مستشعر SiO2 عبر طريقة طلاء الدوران.

  1. مستشعر SiO2 المعدل باستخدام بولي إل ليسين (PLL).
    1. نظف شريحة مستشعر الكوارتز SiO 2 باستخدام معالجة الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق ، واشطفها مرتين بالإيثانول ، وجففها باستخدام N2.
    2. قم بتشغيل طلاء الدوران بالضغط على زر الطاقة ، واضغط على زر التحكم ، واضبط وقت الطلاء وسرعته. سرعة الدوران الأولية هي 400 دورة في الدقيقة ، والتي تزداد باطراد إلى 5000 دورة في الدقيقة.
    3. قم بتوصيل الأنبوب N2 بطبقة الدوران واضبط تجزئة أسطوانة الغاز على 0.4 كيلو باسكال. ضع الرقاقة النظيفة على كوب الشفط الخاص بطبقة الدوران. أضف 100 ميكرولتر من PLL قطرة إلى مركز مستشعر SiO2 وأغلق الغطاء العلوي لمغطي الدوران.
    4. اضغط على الزر بدء ( Start) لبدء طلاء العينة وإيقاف الجهاز عند الانتهاء. قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ ، وقم بإيقاف تشغيل زري الطاقة والتحكم ، وقم بإزالة مستشعر SiO2 المعدل PLL.
      ملاحظة: قبل الضغط على Start (ابدأ)، تأكد من ضبط وقت الطلاء وسرعته. بالإضافة إلى ذلك ، تأكد من وضع مستشعر SiO2 في وسط كوب الشفط. تأكد من إغلاق الغطاء قبل تشغيل العملية لمنع الحوادث.
  2. تحديد التصاق bEVs ب PNPE
    1. قم بتشغيل الكمبيوتر والوحدة الإلكترونية والمضخة التمعجية وتنشيط التحكم في درجة الحرارة في أسفل اليمين في البرنامج للتأكد من أن درجة الحرارة المحددة تقل بمقدار 1 درجة مئوية تقريبا عن درجة حرارة الغرفة.
    2. ضع مستشعرات SiO2 المعدلة PLL في خلية التدفق وفقا لتعليمات التشغيل وقم بتوصيل خط القياس بين خلية التدفق ومضخة التدفق. ضع خلية التدفق داخل نظام وحدة التدفق واشطفها بماء عالي النقاء قبل بدء التجارب.
    3. انقر فوق شريط أدوات الاستحواذ وحدد إعداد القياس للبحث عن 1 و 3 و 5 و 7 و 9 و 11 أوكتاف من الشريحة في القناة المستخدمة. لتصحيح خط الأساس ، انقر فوق بدء القياس للسماح للهواء بالدخول إلى وحدة التدفق حتى يصبح خط الأساس للهواء سلسا. بعد ذلك ، تدفق الماء منزوع الأيونات لمدة 10-15 دقيقة لتمكين توازن خط الأساس للمحلول مرة أخرى.
    4. قم بضخ محلول PNPE المحضر في وحدة التدفق بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لتحقيق امتصاص التوازن على مستشعر SiO2 .
      ملاحظة: لم يعد ΔF يتغير عند ضخ PNPE في وحدة التدفق مرة أخرى ، مما يشير إلى أن سطح مستشعرات SiO2 قد تم تغطيته بالكامل ب PNPE.
    5. قم بضخ محلول bEVs المحضر في وحدة التدفق بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لتتبع عملية التصاق bEV بسطح PNPE.

6. تحليل CLSM لامتصاص المستضد

  1. الثقافة المشتركة PNPE-OVA مع BMDCs
    1. احتضان BMDCs ب 1640 وسائط كاملة (1٪ بنسلين-ستربتومايسين، 10٪ مصل بقري جنيني، 20 نانوغرام/مل من IL-4، و 10 نانوغرام/مل من GM-CSF) لمدة 7 أيام، ثم بذرها في أطباق ليزر صغيرة متحدة البؤر بمعدل 1 × 106 لكل بئر طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
    2. امزج 0.5 مل من OVA المسمى Cy5 (400 ميكروغرام / مل) مع 0.5 مل من PNPE لمدة 1 ساعة وقم بإزالة المستضد السائل عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 20 دقيقة لتطوير تركيبة اللقاح. بعد إعادة التعليق ب 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ، أضف 10 ميكرولتر من التركيبة (10 ميكروغرام / مل OVA) إلى أطباق الليزر الصغيرة متحدة البؤر تحت مقعد فائق النظافة وشارك في الاستزراع مع BMDCs لمدة 6 ساعات.
  2. وصمة عار الهيكل الخلوي الأكتين
    1. قم بإزالة سائل الاستزراع من الخلايا واغسلها مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات قبل التسخين (PBS ؛ درجة الحموضة 7.4).
    2. إصلاح الخلايا مع محلول الفورمالديهايد 4 ٪ في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أثناء التثبيت ، تجنب المثبتات التي تحتوي على الميثانول ، والتي قد تدمر الأكتين.
    3. اغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين أو ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لكل منهما. تغلغل الخلايا مع 100 ميكرولتر من محلول Triton X-100 0.5٪ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين أو ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لكل منها مرة أخرى.
    4. قم بتغطية الخلايا الموجودة على الطبق ذو القاع الزجاجي لأطباق الليزر الصغيرة متحدة البؤر ب 200 ميكرولتر من محلول عمل القضيب المترافق بالفلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. لتقليل إشارة الخلفية ، أضف 1٪ ألبومين مصل بقري إلى حل عمل القضيب المترافق FITC. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتغطية غطاء أطباق الليزر الصغيرة متحدة البؤر أثناء الحضانة لمنع تبخر المحلول.
    5. اغسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها. أعد تلطيخ النوى ب 200 ميكرولتر من محلول DAPI (التركيز: 100 نانومتر) لمدة 30 ثانية تقريبا.
  3. تحليل الصور
    1. قم بتشغيل أجهزة المجهر متحد البؤر بالتسلسل ، بما في ذلك الليزر والبؤرة والمجهر والكمبيوتر. انقر فوق برنامج NIS-Elements AR 5.20.00 وحدد نيكون متحد التنسيق للدخول إلى نظام الاختبار.
    2. في نظام المجهر متحد البؤر ، قم بتشغيل الوحدات المختلفة بالترتيب المشار إليه. أولا ، قم بإعداد قنوات FITC و DAPI و Cy5 واضبط HV والإزاحة المقابلة. ثم حدد عدسة الزيت 100x وضع قطرة من زيت الأرز في الأعلى. ضع أطباق الليزر الصغيرة متحدة البؤر التي تحتوي على BMDCs ملطخة على مرحلة المجهر.
    3. انقر فوق الزر مسح ضوئي . تحت المجهر الفلوري ، حدد موقع الخلايا ذات الأهمية عن طريق تحريك المحور X والمحور Y والمحور Z. اضبط شدة الليزر وحجم الصورة والمعلمات الأخرى لتمكين مسح الصور متحدة البؤر عالية الجودة. أخيرا ، انقر فوق الزر "التقاط " واحفظ الصور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم استخدام صوتنة بسيطة من خطوة واحدة للحصول على PNPE. أولا ، قمنا بإعداد PNPs موحدة لاستخدامها كمثبت صلب (الشكل 1 أ). لوحظت مورفولوجيا PNPs من خلال SEM ، مما يدل على أنها في الغالب موحدة وكروية (الشكل 1 ب). تم الكشف عن الحجم الهيدروديناميكي وإمكانات زيتا للتركيبات عب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

قمنا بتطوير مستحلب الزيت / الماء المستقر بالجسيمات النانوية PLGA كنظام توصيل لتعزيز استيعاب المستضد. يمتلك PNPE المحضر سطحا معبأ بكثافة لدعم نقطة الهبوط ونعومة وسيولة فريدة من نوعها للاتصال الخلوي القوي بغشاء الخلية المناعية. علاوة على ذلك ، قدمت واجهة الزيت / الماء تحميلا عالي المحتوى للمست?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع مدعوم من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFE020527 ، 2021YFC2302605 ، 2021YFC2300142) ، من 0 إلى 1 مشروع الابتكار الأصلي لبرنامج البحث العلمي الحدودي الأساسي للأكاديمية الصينية للعلوم (ZDBS-LY-SLH040) ، مؤسسة مجموعات البحث المبتكرة التابعة للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 21821005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AddVaxInvivoGenVac-adx-10
Cell StrainerBiosharpBS-70-CS70 μm
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)NikonA1
Cy3 NHS EsterYEASEN40777ES03
DAPI Staining SolutionBeyotimeC1005
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000-044
FITC PhalloidinSolarbioCA1620
Mastersizer 2000 Particle Size AnalyzerMalvern
Micro BCA protein Assay KitThermo Science23235
Membrane emulsification equipmentZhongke Senhui Microsphere TechnologyFM0201/500M
Mini-ExtruderAvanti Polar Lipids, Inc
NANO ZSMalvernJSM-6700F
Polycarbonate membranesAvanti Polar Lipids, Inc
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)Sigma-Aldrich26780-50-7Mw 7,000-17,000
Poly-L-lysine SolutionSolarbioP2100
Poly (vinyl alcohol) (PVA)Sigma-Aldrich9002-89-5
QSense Silicon dioxide sensorBiolin ScientificQSX 303Surface roughness < 1 nm RMS
Quartz Crystal MicrobalanceBiosharpQ-SENSE E4
RPMI Medium 1640 basicGibcoC22400500BTL-Glutamine, 25 mM HEPES
Scanning Electron Microscopy (SEM)JEOLJSM-6700F
SqualeneSigma-Aldrich111-02-4

References

  1. Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170(2022).
  2. Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
  3. Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474(2022).
  4. Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
  5. Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
  6. Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
  7. Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
  8. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  9. Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
  10. Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
  11. Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
  12. Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
  13. Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
  14. Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
  15. Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129(2021).
  16. Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
  17. Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
  18. Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880(2020).
  19. Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610(2022).
  20. Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
  21. Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
  22. De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995(2022).
  23. Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781(2019).
  24. Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768(2022).
  25. Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897(2022).
  26. Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534(2014).
  27. Chen, l, et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
  28. Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
  29. Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007(2020).
  30. Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606(2021).
  31. McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039(2021).
  32. Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
  33. D'Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360(2021).
  34. Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242(2021).
  35. Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved