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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Um effiziente Adjuvantien rational zu gestalten, haben wir die Poly-Milchsäure-Co-Glykolsäure-Nanopartikel-stabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE) entwickelt. Das PNPE besaß eine einzigartige Weichheit und eine hydrophobe Schnittstelle für einen potenten zellulären Kontakt und bot eine Antigenladung mit hohem Gehalt, was die zelluläre Affinität des Abgabesystems zu Antigen-präsentierenden Zellen verbesserte und eine effiziente Internalisierung von Antigenen induzierte.

Zusammenfassung

Die zelluläre Affinität von Mikro-/Nanopartikeln ist die Voraussetzung für zelluläre Erkennung, zelluläre Aufnahme und Aktivierung, die für die Wirkstoffabgabe und Immunantwort unerlässlich sind. Die vorliegende Studie entstand aus der Beobachtung, dass die Auswirkungen von Ladung, Größe und Form fester Partikel auf die Zellaffinität normalerweise berücksichtigt werden, aber wir erkennen selten die wesentliche Rolle von Weichheit, dynamischem Umstrukturierungsphänomen und komplexer Grenzflächeninteraktion in der Zellaffinität. Hier entwickelten wir die Polymilch-Co-Glykolsäure (PLGA) nanopartikelstabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE), die die Mängel starrer Formen überwand und die Flexibilität und Fließfähigkeit von Krankheitserregern simulierte. Es wurde eine Methode entwickelt, um die Affinität von PNPE zu Zelloberflächen zu testen und die anschließende Internalisierung durch Immunzellen zu erarbeiten. Die Affinität von PNPE zu biomimetischen extrazellulären Vesikeln (bEVs) - dem Ersatz für dendritische Knochenmarkzellen (BMDCs) - wurde unter Verwendung einer Quarzkristallmikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) bestimmt, die eine Echtzeitüberwachung der Zellemulsionsadhäsion ermöglichte. Anschließend wurde das PNPE verwendet, um das Antigen (Ovalbumin, OVA) zu verabreichen, und die Aufnahme der Antigene durch BMDCs wurde mit konfokalem Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) beobachtet. Repräsentative Ergebnisse zeigten, dass die PNPE sofort die Frequenz (ΔF) verringerte, wenn sie auf die bEVs traf, was auf eine schnelle Adhäsion und eine hohe Affinität der PNPE zu den BMDCs hindeutet. PNPE zeigte eine signifikant stärkere Bindung an die Zellmembran als PLGA-Mikropartikel (PMPs) und AddaVax-Adjuvans (bezeichnet als tensidstabilisierte Nanoemulsion [SSE]). Darüber hinaus wurde aufgrund der erhöhten zellulären Affinität zu den Immunzyten durch dynamische Krümmungsänderungen und laterale Diffusionen die Antigenaufnahme im Vergleich zu PMPs und SSE gesteigert. Dieses Protokoll liefert Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger Formulierungen mit hoher Zellaffinität und effizienter Antigeninternalisierung und bietet eine Plattform für die Entwicklung effizienter Impfstoffe.

Einleitung

Zur Bekämpfung epidemischer, chronischer und infektiöser Krankheiten ist es unerlässlich, wirksame Adjuvantien für prophylaktische und therapeutische Impfungen zu entwickeln 1,2. Idealerweise sollten die Adjuvantien eine ausgezeichnete Sicherheit und Immunaktivierungbesitzen 3,4,5. Es wird angenommen, dass die effektive Aufnahme und Verarbeitung von Antigenen durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) ein wesentliches Stadium in den nachgeschalteten Signalkaskaden und der Initiierung der Immunantwortist 6,7,8. Daher sind ein klares Verständnis des Mechanismus der Interaktion von Immunzellen mit Antigenen und die Entwicklung von Adjuvantien zur Verbesserung der Internalisierung effiziente Strategien, um die Effizienz von Impfstoffen zu verbessern.

Mikro-/Nanopartikel mit einzigartigen Eigenschaften wurden zuvor als Antigenabgabesysteme untersucht, um die zelluläre Aufnahme von Antigenen und die zelluläre Interaktion mit pathogenassoziierten molekularen Mustern zu vermitteln 9,10. Bei Kontakt mit Zellen beginnen Abgabesysteme mit der extrazellulären Matrix und Zellmembran zu interagieren, was zur Internalisierung und nachfolgenden zellulären Reaktionen führte11,12. Frühere Studien haben ans Licht gebracht, dass die Internalisierung von Partikeln durch Zellmembran-Partikel-Adhäsion13 erfolgt, gefolgt von flexibler Verformung der Zellmembran und Diffusion des Rezeptors zur Oberflächenmembran14,15. Unter diesen Umständen hängen die Eigenschaften des Verabreichungssystems von der Affinität zu APCs ab, die sich anschließend auf die Aufnahmemenge16,17 auswirken.

Um Erkenntnisse über das Design des Abgabesystems für eine verbesserte Immunantwort zu gewinnen, wurden umfangreiche Anstrengungen unternommen, um den Zusammenhang zwischen den Eigenschaften von Partikeln und der zellulären Aufnahme zu untersuchen. Die vorliegende Studie entstand aus der Beobachtung, dass feste Mikro-/Nanopartikel mit unterschiedlichen Ladungen, Größen und Formen oft in diesem Licht untersucht werden, während die Rolle der Fluidität bei der Antigeninternalisierung selten untersucht wird18,19. Tatsächlich zeigten die weichen Partikel während der Adhäsion dynamische Krümmungsänderungen und laterale Diffusionen, um die Kontaktfläche für multivalente Wechselwirkungen zu vergrößern, die von den festen Partikeln kaum repliziert werden können20,21. Darüber hinaus sind Zellmembranen Phospholipiddoppelschichten (Sphingolipide oder Cholesterin) an der Aufnahmestelle, und hydrophobe Substanzen können die Konformationsentropie von Lipiden verändern und die für die zelluläre Aufnahme erforderliche Energiemenge verringern22,23. Daher kann die Verstärkung der Mobilität und die Förderung der Hydrophobie des Abgabesystems eine wirksame Strategie zur Stärkung der Antigeninternalisierung sein, um die Immunantwort zu verbessern.

Pickering-Emulsion, stabilisiert durch feste Partikel, die an der Grenzfläche zwischen zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten angeordnet sind, sind im biologischen Bereich weit verbreitet24,25. Tatsächlich bestimmen die aggregierenden Partikel an der Öl-Wasser-Grenzfläche die Formulierung von mehrstufigen Strukturen, die mehrstufige Verabreichungssystem-zelluläre Interaktionen fördern und weitere multifunktionale physikalisch-chemische Eigenschaften bei der Wirkstoffabgabe induzieren. Aufgrund ihrer Verformbarkeit und lateralen Beweglichkeit wurde erwartet, dass Pickering-Emulsionen in multivalente zelluläre Interaktion mit den Immunzyten eintreten und von den Membranproteinen26 erkannt werden. Da ölige Mizellenkerne in Pickering-Emulsionen nicht vollständig mit festen Partikeln bedeckt sind, besitzen Pickering-Emulsionen unterschiedlich große Lücken zwischen Partikeln an der Öl-Wasser-Grenzfläche, die eine höhere Hydrophobie verursachen. Daher ist es entscheidend, die Affinität von Pickering-Emulsionen zu APCs zu untersuchen und die anschließende Internalisierung zu erarbeiten, um effiziente Adjuvantien zu entwickeln.

Basierend auf diesen Überlegungen entwickelten wir eine PLGA-nanopartikelstabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE) als Fluiditäts-Impfstoffverabreichungssystem, das auch dazu beitrug, wertvolle Erkenntnisse über die Affinität des PNPE zu BMDCs und die zelluläre Internalisierung zu gewinnen. Die Echtzeit-Adhäsion von biomimetischen extrazellulären Vesikeln (bEVs; ein Ersatz von BMDCs) an PNPE wurde über eine markierungsfreie Methode unter Verwendung einer Quarzkristallmikrowaage mit Dissipationsüberwachung (QCM-D) überwacht. Nach der Charakterisierung der Affinität von PNPE zu BMDCs wurde die konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) verwendet, um die Antigenaufnahme zu bestimmen. Das Ergebnis zeigte die höhere Affinität von PNPE zu BMDCs und die effiziente Internalisierung des Antigens. Wir erwarteten, dass die PNPE eine höhere Affinität zu APCs aufweisen würde, was die Internalisierung von Antigenen besser stimulieren könnte, um die Immunantwort zu verstärken.

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Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom Institut für Verfahrenstechnik der Chinesischen Akademie der Wissenschaften genehmigt. Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren und der Richtlinie für die ethische Überprüfung von Tieren (China, GB/T35892-2018) durchgeführt.

1. Herstellung und Charakterisierung von PLGA-Nanopartikeln

  1. Herstellung von PLGA-Nanopartikeln (PNPs)
    1. 0,5 g Polyvinylalkohol (PVA) werden zu 120 ml entionisiertem Wasser bei 90 °C gegeben und gerührt, bis sie vollständig aufgelöst sind, um die PVA-Lösung herzustellen. Lagern Sie die Lösung nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur im Kühlschrank (4 °C).
    2. Fügen Sie 100 mg PLGA zu 10 ml Aceton und Ethanolgemisch (Verhältnis 4: 1) hinzu, um als Ölphase zu dienen.
    3. 20 ml PVA-wässrige Lösung unter den Abzug geben und bei 400 U/min magnetisch rühren. Geben Sie 5 mL der Ölphase Tropfen für Tropfen mit einer Spritzenpumpe in die PVA-Lösung. Dann rühren Sie die Mischung in den Abzug, bis die organischen Lösungsmittel vollständig verdampft sind.
      HINWEIS: Mit der Erhöhung der Konzentration der Partikel in der Ölphase verwandelt sich die Wasserphasenlösung allmählich in ein klares und transparentes hellbläulich-weißes oder milchiges Weiß.
    4. Nach der Verflüchtigung organischer Lösungsmittel (2-3 h) zentrifugieren Sie die Mischung bei 15.000 x g. Waschen Sie drei oder mehrmals, bis das endgültige Waschwasser klar und transparent ist.
      HINWEIS: Der Zweck dieses Schritts besteht hauptsächlich darin, das restliche PVA auf der Partikeloberfläche abzuwaschen, um zu verhindern, dass es die Pickering-Emulsionszubereitung beeinträchtigt.
    5. Die gewaschenen PNPs werden in 2 mL entionisiertem Wasser erneut suspendiert und das Gemisch bei -80 °C für 24 h eingefroren. Anschließend gefriertrocknen Sie die Partikel in einem Gefriertrockner für 48-72 h. Die vorbereiteten PNPs sind weiß flockig.
  2. Charakterisierung von PNPs
    1. Um die Größe und das Zetapotential von PNPs zu charakterisieren, fügen Sie 10 μL PNPs in 1 ml entionisiertes Wasser hinzu, um Verdünnungslösung zu erhalten, und überführen Sie die Verdünnungslösung in eine DTS1070-Zelle. Schalten Sie den Computer und den dynamischen Lichtstreuanalysator (DLS) ein, und setzen Sie die DTS1070-Zelle in das DLS-System ein.
    2. Klicken Sie auf die Zeta Size Software und erstellen Sie eine neue Messdatei, um das Bestimmungsverfahren einzurichten. Starten Sie dann das Bestimmungsverfahren, um die Partikelgröße und Zetapotentialverteilung zu erhalten.
    3. Um die Morphologie der PNPs zu beobachten, verteilen Sie die 0,1 ml PNPs-Lösung (40-fach verdünnt) gleichmäßig auf einer 5 cm x 5 cm großen Zinnfolienfolie und lassen Sie das Wasser über Nacht in einem gut belüfteten Abzug auf natürliche Weise verdunsten.
    4. Schneiden Sie einen kleinen Teil der Zinnfolie aus und sichern Sie sie mit leitfähigem Klebeband auf dem Probentisch. Besprühen Sie es mit Gold bei einem Strom von 10 mA für 120 s. Anschließend wird die Oberflächenmorphologie der Probe mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) beobachtet.

2. Herstellung und Charakterisierung von PNPE

  1. Um PNPE herzustellen, fügen Sie gefriergetrocknete PNPs zu entionisiertem Wasser in einer Konzentration von 4 mg / ml (der wässrigen Phase) hinzu und fügen Sie dann Squalen als Ölphase hinzu. Bereiten Sie PNPE über eine einstufige Beschallung für 5 min bei 100 W in einem Wasserbadsonikator vor. Das Öl-Wasser-Phasenverhältnis beträgt 1:9.
  2. Charakterisierung der hergestellten PNPE
    1. Öffnen Sie die Mastersizer 2000-Software und den Laser nacheinander. Klicken Sie auf Messen , um das voreingestellte Programm zu öffnen und den Beispielnamen festzulegen. Klicken Sie auf Start , um mit der Messung des Hintergrunds der Probe zu beginnen, und geben Sie dann mit einem Tropfer 1 ml PNPE in den Probentank des Laser-Partikelgrößenanalysators, um die Partikelgröße der Emulsion dreimal parallel zu messen.
    2. Verdünnen Sie 20 μL PNPE in 1 ml entionisiertem Wasser. Geben Sie 20 μL der Emulsion auf den Objektträger. Beobachten Sie die Morphologie und Homogenität der Emulsion mit optischer Mikroskopie bei 40-facher Vergrößerung und erhalten Sie Fotos.
  3. Antigen-Ladeeffizienz
    1. 200 μg Ovalbumin (OVA) werden in 500 ml entionisiertem Wasser gelöst. Dann mischen Sie es mit 500 mL vorbereitetem PNPE und schütteln Sie es für 1 h bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das fluidische Antigen durch Zentrifugation bei 5000 x g für 20 min.
    2. Bestimmung der fluidischen Antigenkonzentrationen mit Hilfe von Bicinchoninsäure (BCA)-Assays27. Die Formel zur Berechnung der Antigenbelastungseffizienz lautet wie folgt:
      Antigen-Ladeeffizienz = figure-protocol-5137
      Verwenden Sie dieselbe Methode, um die Antigenladeeffizienz der SSE zu bestimmen, die als Kontrollgruppe verwendet wird.
  4. Stabilität von PNPE
    1. 6 ml des vorbereiteten PNPE werden in sechs gleiche Portionen aufgeteilt und jeweils drei Teile bei 4 °C bzw. 25 °C gelagert. Verdünnen Sie 20 μL gespeichertes PNPE in 1 ml entionisiertes Wasser (1:50) an Tag 0, 3 und 6. Messen Sie dann die Größe und das Zetapotenzial der PNPE-Stammlösungen, die bei verschiedenen Temperaturen gehalten werden.
      HINWEIS: Die unterschiedlichen Lagertemperaturen sind so eingestellt, dass die Auswirkungen unterschiedlicher Temperaturen auf die Stabilität von PNPE verglichen werden, wodurch die Lagerbedingungen für hohe Stabilität und lange Haltbarkeit optimiert werden können.
  5. Herstellung von PLGA-Mikropartikeln (PMPs)
    1. 500 mg PLGA werden in 5 ml Dichlormethan als Ölphase gelöst und dann in 50 ml externe wässrige Phase mit 1,5% PVA gegossen, um das Öl-Wasser-Gemisch zu erhalten. Homogenisieren Sie die Mischung bei 3000 U/min für 1 min mit einem Homogenisator, um grobe Emulsionen zu erhalten.
    2. Aufrechterhaltung der Gleichmäßigkeit der PLGA-Partikelgröße von Mikrokugeln (bestimmt durch Grobemulsionen) durch Membranemulgierung. Installieren Sie eine 5,2 μm Membran im Membranrohr. Stellen Sie den Druck auf 800 kPa ein und halten Sie ihn ruhig.
    3. Öffnen Sie das Auslassventil und das Zuführventil, und nachdem Sie die groben Emulsionen in den Probenbehälter gegeben haben, schließen Sie das Auslassventil und das Zuführventil, öffnen Sie das Auslassventil und das Einlassventil und nehmen Sie die Nachfilmemulsion in ein 200-ml-Becherglas. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal, um Pre-Double-Emulsionen zu erhalten.
    4. Rühren Sie die Pre-Double-Emulsionen um, um das Dichlormethan bei Raumtemperatur zu verdampfen, um die Mikrokugeln auszuhärten. Waschen Sie die Mikrokugeln mit entionisiertem Wasser bei 7741 x g für 3 min fünfmal. Im Gefrierschrank bei -80 °C vorgefrieren und schließlich gefriertrocknen, um getrocknete Mikrosphären zu erhalten.
  6. Charakterisierung von PMPs
    1. Öffnen Sie die Mastersizer 2000-Software und den Laser nacheinander. Klicken Sie auf Messen , um das voreingestellte Programm zu öffnen und den Beispielnamen festzulegen. Klicken Sie auf Start , um mit der Messung des Hintergrunds der Probe zu beginnen. Geben Sie dann 1 ml PMPs in den Probenbehälter des Laser-Partikelgrößenanalysators mit einem Tropfer und messen Sie die Partikelgröße der Mikropartikel dreimal parallel.
  7. Weichheitsanalyse
    HINWEIS: PNPE wurde auf denSiO2-Sensor aufgebracht, um die Weichheit zu messen.
    1. Reinigen Sie den SiO-2-Quarzsensorchip durch UV-Ozon-Behandlung für 10 min, spülen Sie ihn zweimal mit 5 mL Ethanol (75% v / v) ab und trocknen Sie ihn mit N2. Einbau des leeren SiO2-Quarzsensorchips in die Durchflusszelle.
    2. Schalten Sie den Computer ein und aktivieren Sie die Temperaturregelung unten rechts in der Software, um sicherzustellen, dass die eingestellte Temperatur etwa 1 °C unter der Raumtemperatur liegt.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassung in der Symbolleiste und wählen Sie Messung einrichten , um nach den 1, 3, 5, 7, 9 und 11 Oktaven des Chips im verwendeten Kanal zu suchen. Klicken Sie in der Symbolleiste auf die Schaltfläche Erfassung und wählen Sie Messung starten.
    4. Korrigieren Sie den Basisplan mit Luft, und wenn der Basisplan ausgeglichen ist, wählen Sie Beenden aus, und speichern Sie die Datei als leer.
    5. Reinigen Sie den Chip und beschichten Sie 10 μg/ml PNPE auf dem Chip. Schalten Sie kurz den Spin Coater ein und stellen Sie den Betriebsparameter ein. Verbinden Sie dasN2-Rohr mit dem Schleuderbeschichter, stellen Sie die Fraktionierung der Gasflasche auf 0,4 kPa ein und legen Sie den sauberen Chip auf den Saugnapf des Schleuderbeschichters. Geben Sie 100 μL PNPE tropfenweise in die Mitte desSiO2-Sensors und schließen Sie die obere Abdeckung des Schleuderbeschichters, um die Beschichtung abzuschließen.
    6. Setzen Sie den PNPE-beschichteten Chip in die Durchflusszelle ein. Wiederholen Sie die Schritte 2.7.3-2.7.4 und speichern Sie die Datei als PNPE. Öffnen Sie sowohl die leere als auch die PNPE-Datei und klicken Sie auf die Schaltfläche Stitch, um die zugehörigen Daten der Dissipation (ΔD) zu erhalten.

3. Isolierung und Kultur BMDCs 28

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien und Proben auf Eis gelegt werden, da sich dies positiv auf die Zellaktivität auswirkt. Um die Sterilität zu erhalten, führen Sie alle Schritte auf einer ultrasauberen Bank mit sterilen Utensilien durch.

  1. Euthanasieren Sie die C57BL / 6 (weiblich, 6-8 Wochen alt) Mäuse durch CO2 -Inhalation und tränken Sie sie in Ethanol 70% (v / v) für eine kurze Sterilisation.
  2. Nach dem Einweichen für 3-5 min die Mäuse auf eine super saubere Bank geben. Entfernen Sie die Beinmuskulatur mit einer Edelstahlschere, um Femur und Tibia freizulegen, und trennen Sie dann Femur und Tibia.
  3. Füllen Sie eine Petrischale mit 70% (v / v) Ethanol und weichen Sie die sauberen Knochen für 5-10 s darin ein, um die externe Sterilisation abzuschließen. Reinigen Sie alle Knochen und legen Sie sie in eine sterile Röhre mit Eis um sie herum.
  4. Schneiden Sie den Femur und die Tibia in der Nähe des Gelenks mit einer Schere. Führen Sie die Spritzennadel in den Knochen ein, um das Knochenmark mit vorgekühltem RPMI-Medium (1640) in ein Zentrifugenröhrchen auszuspülen.
  5. Spülen Sie zwei- oder dreimal aus, bis der Knochen vollständig weiß ist. Pipettieren Sie das Knochenmark mehrmals, um alle Klumpen zu trennen. Filtern Sie die Zellen mit einem Sieb mit einem Durchmesser von 40 μm in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
  6. Zentrifugieren bei 4 °C und 500 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 2 ml Erythrozytenlysat für 4 min in das Sediment.
  7. Nach zwei- oder dreimaligem Waschen werden die Zellen in 2 ml vollständigem Medium (1 % Penicillin-Streptomycin, 10 % fötales Rinderserum, 20 ng/ml IL-4 und 10 ng/ml GM-CSF) resuspendiert. Dann verdünnen Sie 10 μL Zellen in 1 ml PBS und führen Sie den Chip des tragbaren automatisierten Zellzählers zur Zellzählung in die Zellverdünnung ein. Schließlich werden Keimzellen mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml in eine 10 mm Kulturschale mit einem vollständigen Medium gepflanzt.
  8. Kultur der Zellen in einem Zellinkubator mit 5%CO2 bei 37 °C. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage. Am Tag 7 die Zellen in ein 50-ml-Röhrchen überführen und bei 450 x g für 5 Minuten zentrifugieren, um die Zellen zu sammeln.

4. Herstellung biomimetischer extrazellulärer Vesikel (bEV)

  1. Montieren Sie den Mini-Extruder nacheinander gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie sicher, dass das Spritzengehäuse nicht rissig ist, bevor Sie es verwenden. Stellen Sie vor jedem Versuch sicher, dass alle O-Ringe in gutem Zustand sind, und ersetzen Sie abgenutzte oder beschädigte umgehend. Verschlissene oder beschädigte O-Ringe können beim Betrieb des Extruders zu einer plötzlichen Druckentlastung führen.
  2. Die BMDCs wiederholt absaugen und in ein Zentrifugenröhrchen überführen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Druckbeaufschlagung der Zellsuspensionen durch 10 μm, 5 μm und 1 μm Polycarbonatmembranen für 30 Durchgänge mit dem Mini-Extruder29.
    HINWEIS: Um die Gleichmäßigkeit der bEV-Größe zu ermöglichen, wurden die BMDC-Suspensionen für 30 Durchgänge durch 10 μm, 5 μm und 1 μm Polycarbonatmembranen geschoben. Achten Sie außerdem während des Betriebs darauf, die Kraft gleichmäßig aufzubringen und die Kraftrichtung entlang der Achse der Spritze beizubehalten.
  3. Zentrifugieren Sie die gepoolten Überstände für 5 min bei 1000 x g und 4 °C, um die Zellen zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn bei 3000 x g für 5 min bei 4 °C, um die verbleibenden Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.
  4. Sammeln Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn bei 100.000 x g für 90 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die bEVs in 2 ml HEPES-gepufferter Kochsalzlösung (HBS). Reinigen Sie die bEVs durch Filtration durch eine 0,45 μm Membran und lagern Sie die gereinigten bEVs bei −80 °C.

5. bEVs halten sich an die PNPE

HINWEIS: Der SiO2-Sensor wurde durch Spin-Coating-Verfahren modifiziert.

  1. SiO-2-Sensor modifiziert mit Poly-L-Lysin (PLL).
    1. Reinigen Sie den SiO2-Quarzsensorchip mit UV-Ozon-Behandlung für 10 min, spülen Sie ihn zweimal mit Ethanol ab und trocknen Sie ihn mit N2.
    2. Schalten Sie den Spin Coater ein, indem Sie die Ein / Aus-Taste drücken, die Steuerungstaste drücken und die Beschichtungszeit und -geschwindigkeit einstellen. Die anfängliche Drehzahl beträgt 400 U/min, die stetig auf 5000 U/min erhöht wird.
    3. Verbinden Sie dasN2-Rohr mit dem Schleuderbeschichter und stellen Sie die Fraktionierung der Gasflasche auf 0,4 kPa ein. Legen Sie den sauberen Chip auf den Saugnapf des Schleuderbeschichters. Geben Sie 100 μL PLL tropfenweise in die Mitte desSiO2-Sensors und schließen Sie die obere Abdeckung des Spin-Coaters.
    4. Drücken Sie die Taste Start, um die Beschichtung der Probe zu starten und die Maschine zu stoppen, wenn sie fertig ist. Schalten Sie die Vakuumpumpe aus, schalten Sie die Power- und Control-Tasten aus und entfernen Sie den PLL-modifizierten SiO2-Sensor.
      HINWEIS: Bevor Sie auf Start drücken, stellen Sie sicher, dass die Beschichtungszeit und -geschwindigkeit eingestellt wurden. Stellen Sie außerdem sicher, dass sich derSiO2-Sensor in der Mitte des Saugnapfes befindet. Stellen Sie sicher, dass der Deckel geschlossen ist, bevor Sie den Prozess ausführen, um Unfälle zu vermeiden.
  2. Bestimmung der Adhäsion von bEVs an PNPE
    1. Schalten Sie den Computer, die Elektronik, die Schlauchpumpe ein und aktivieren Sie die Temperaturregelung unten rechts in der Software, um sicherzustellen, dass die eingestellte Temperatur ca. 1 °C unter Raumtemperatur liegt.
    2. Setzen Sie die PLL-modifizierten SiO2-Sensoren gemäß der Bedienungsanleitung in die Durchflusszelle ein und verbinden Sie die Messleitung zwischen Durchflusszelle und Durchflusspumpe. Platzieren Sie die Durchflusszelle im Durchflussmodulsystem und spülen Sie sie vor Beginn der Experimente mit Reinstwasser ab.
    3. Klicken Sie auf die Erfassungssymbolleiste und wählen Sie Messung einrichten , um nach 1, 3, 5, 7, 9 und 11 Oktaven des Chips im verwendeten Kanal zu suchen. Um die Basislinie zu korrigieren, klicken Sie auf Messung starten , damit Luft in das Strömungsmodul eindringen kann, bis die Luftbasislinie glatt ist. Anschließend ententionisiertes Wasser für 10-15 min fließen, um das Gleichgewicht der Lösung wieder zu ermöglichen.
    4. Die vorbereitete PNPE-Lösung wird mit einer Durchflussrate von 50 μL/min in das Durchflussmodul gepumpt, um eine Gleichgewichtsasorption amSiO2-Sensor zu erreichen.
      HINWEIS: Der ΔF ändert sich nicht mehr, wenn das PNPE wieder in das Durchflussmodul gepumpt wird, was darauf hinweist, dass die Oberfläche derSiO2-Sensoren vollständig mit PNPE bedeckt wurde.
    5. Pumpen Sie die vorbereitete bEVs-Lösung mit einer Durchflussrate von 50 μL/min in das Durchflussmodul, um den Prozess der bEV-Adhäsion an der PNPE-Oberfläche zu verfolgen.

6. CLSM-Analyse der Antigenaufnahme

  1. Co-Kultur PNPE-OVA mit BMDCs
    1. Inkubieren Sie die BMDCs mit 1640 vollständigen Medien (1% Penicillin-Streptomycin, 10% fetales Rinderserum, 20 ng/ml IL-4 und 10 ng/ml GM-CSF) für 7 Tage und säen Sie sie dann in kleine konfokale Laserschalen bei 1 x 106 pro Vertiefung über Nacht bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator .
    2. Mischen Sie 0,5 ml Cy5-markierte OVA (400 μg/ml) mit 0,5 ml PNPE für 1 h und entfernen Sie das fluidische Antigen durch Zentrifugation bei 5000 x g für 20 min, um eine Impfstoffformulierung zu entwickeln. Nach der Resuspension mit 200 μL entionisiertem Wasser 10 μL der Formulierung (10 μg/ml OVA) in die kleinen konfokalen Laserschalen unter einer supersauberen Bank geben und 6 h lang mit BMDCs kokulturieren.
  2. Aktin-Zytoskelett-Färbung
    1. Entfernen Sie die Kulturflüssigkeit aus den Zellen und waschen Sie sie zweimal mit vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4).
    2. Fixieren Sie die Zellen mit 4% iger Formaldehydlösung in PBS für 10 min bei Raumtemperatur. Vermeiden Sie während der Fixierung Methanol-haltige Fixiermittel, die Aktin zerstören können.
    3. Waschen Sie die Zellen zwei- bis dreimal bei Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten mit PBS. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 100 μL 0,5% Triton X-100 Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit PBS zwei- bis dreimal bei Raumtemperatur für jeweils 10 Minuten.
    4. Die Zellen auf der Glasbodenschale der kleinen konfokalen Laserschalen mit 200 μL fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugierter Phalloidin-Arbeitslösung abdecken und 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Um das Hintergrundsignal zu reduzieren, fügen Sie der FITC-konjugierten Phalloidin-Arbeitslösung 1% Rinderserumalbumin hinzu. Decken Sie außerdem den Deckel der kleinen konfokalen Laserschalen während der Inkubation ab, um ein Verdampfen der Lösung zu verhindern.
    5. Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 Minuten mit PBS. Färben Sie die Kerne mit 200 μL DAPI-Lösung (Konzentration: 100 nM) für ca. 30 s.
  3. Bildanalyse
    1. Schalten Sie die konfokale Mikroskophardware nacheinander ein, einschließlich Laser, Konfokal, Mikroskop und Computer. Klicken Sie auf die Software NIS-Elements AR 5.20.00 und wählen Sie Nikon Confocal aus, um das Prüfsystem aufzurufen.
    2. Schalten Sie im konfokalen Mikroskopsystem die verschiedenen Einheiten in der angegebenen Reihenfolge ein. Richten Sie zunächst die FITC-, DAPI- und Cy5-Kanäle ein und passen Sie die entsprechenden HV- und Offset-Kanäle an. Wählen Sie dann die 100-fache Öllinse und legen Sie einen Tropfen Zedernöl auf die Oberseite. Legen Sie die kleinen konfokalen Laserschalen mit gefärbten BMDCs auf den Mikroskoptisch.
    3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Scannen . Lokalisieren Sie unter einem Fluoreszenzmikroskop interessante Zellen, indem Sie die X-Achse, Y-Achse und Z-Achse bewegen. Passen Sie die Laserintensität, die Bildgröße und andere Parameter an, um das Scannen hochwertiger konfokaler Bilder zu ermöglichen. Klicken Sie abschließend auf die Schaltfläche Aufnehmen und speichern Sie die Bilder.

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Ergebnisse

Eine einfache einstufige Sonifikation wurde verwendet, um PNPE zu erhalten. Zunächst bereiteten wir einheitliche PNPs für den Einsatz als Festkörperstabilisator vor (Abbildung 1A). Die Morphologie der PNPs wurde durch REM beobachtet, was zeigt, dass sie meist einheitlich und kugelförmig sind (Abbildung 1B). Die hydrodynamische Größe und das Zetapotenzial der Formulierungen wurden mittels DLS detektiert. Der Durchmesser der PNPs betrug 187,7 ± 3,5...

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Diskussion

Wir haben die PLGA-Nanopartikel-stabilisierte Öl/Wasser-Emulsion als Abgabesystem für eine verbesserte Antigeninternalisierung entwickelt. Das präparierte PNPE besaß eine dicht gepackte Oberfläche, um den Landeplatz zu unterstützen, und eine einzigartige Weichheit und Fließfähigkeit für einen starken zellulären Kontakt mit der Immunzellmembran. Darüber hinaus bot die Öl/Wasser-Schnittstelle eine hochgradige Antigenbeladung, und amphiphiles PLGA verlieh PNPE eine hohe Stabilität für den Transport von Antigen...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Projekt, das vom National Key Research and Development Program of China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), From 0 to 1 Original Innovation Project of Basic Frontier Scientific Research Program of Chinese Academy of Sciences (ZDBS-LY-SLH040), der Foundation for Innovative Research Groups der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21821005), unterstützt wurde.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AddVaxInvivoGenVac-adx-10
Cell StrainerBiosharpBS-70-CS70 μm
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)NikonA1
Cy3 NHS EsterYEASEN40777ES03
DAPI Staining SolutionBeyotimeC1005
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000-044
FITC PhalloidinSolarbioCA1620
Mastersizer 2000 Particle Size AnalyzerMalvern
Micro BCA protein Assay KitThermo Science23235
Membrane emulsification equipmentZhongke Senhui Microsphere TechnologyFM0201/500M
Mini-ExtruderAvanti Polar Lipids, Inc
NANO ZSMalvernJSM-6700F
Polycarbonate membranesAvanti Polar Lipids, Inc
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)Sigma-Aldrich26780-50-7Mw 7,000-17,000
Poly-L-lysine SolutionSolarbioP2100
Poly (vinyl alcohol) (PVA)Sigma-Aldrich9002-89-5
QSense Silicon dioxide sensorBiolin ScientificQSX 303Surface roughness < 1 nm RMS
Quartz Crystal MicrobalanceBiosharpQ-SENSE E4
RPMI Medium 1640 basicGibcoC22400500BTL-Glutamine, 25 mM HEPES
Scanning Electron Microscopy (SEM)JEOLJSM-6700F
SqualeneSigma-Aldrich111-02-4

Referenzen

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