JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Для рационального проектирования эффективных адъювантов мы разработали полимолочно-когликолевую кислоту, стабилизированную наночастицами эмульсию Пикеринга (PNPE). PNPE обладал уникальной мягкостью и гидрофобным интерфейсом для мощного клеточного контакта и предлагал высокую нагрузку антигена, улучшая клеточное сродство системы доставки к антигенпрезентирующим клеткам и вызывая эффективную интернализацию антигенов.

Аннотация

Клеточное сродство микро-/наночастиц является предпосылкой для клеточного распознавания, клеточного поглощения и активации, которые необходимы для доставки лекарств и иммунного ответа. Настоящее исследование вытекает из наблюдения, что влияние заряда, размера и формы твердых частиц на сродство клеток обычно рассматривается, но мы редко осознаем существенную роль мягкости, динамического явления реструктуризации и сложного интерфейсного взаимодействия в клеточном сродстве. Здесь мы разработали полимолочно-когликолевую кислоту (PLGA) наночастиц-стабилизированную эмульсию Пикеринга (PNPE), которая преодолела недостатки жестких форм и имитировала гибкость и текучесть патогенов. Был разработан метод для проверки сродства PNPE к клеточным поверхностям и разработки последующей интернализации иммунными клетками. Сродство PNPE к биомиметическим внеклеточным везикулам (bEV) - замене дендритных клеток костного мозга (BMDC) - определяли с помощью микровеса кристаллов кварца с мониторингом диссипации (QCM-D), что позволило в режиме реального времени контролировать адгезию клеточной эмульсии. Впоследствии PNPE использовался для доставки антигена (ovalbumin, OVA), а поглощение антигенов BMDC наблюдалось с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM). Репрезентативные результаты показали, что PNPE немедленно снижал частоту (ΔF), когда он сталкивался с bEV, что указывает на быструю адгезию и высокое сродство PNPE к BMDC. PNPE показал значительно более сильное связывание с клеточной мембраной, чем микрочастицы PLGA (PMP) и адъювант AddaVax (обозначаемый как сурфактант-стабилизированная наноэмульсия [SSE]). Кроме того, благодаря усиленному клеточному сродству к иммуноцитам за счет динамических изменений кривизны и боковых диффузий поглощение антигена впоследствии было увеличено по сравнению с PMP и SSE. Этот протокол дает представление о разработке новых составов с высоким сродством клеток и эффективной интернализацией антигена, обеспечивая платформу для разработки эффективных вакцин.

Введение

Для борьбы с эпидемическими, хроническими и инфекционными заболеваниями необходимо разработать эффективные адъюванты для профилактических и лечебных прививок 1,2. В идеале адъюванты должны обладать отличной безопасностью и иммунной активацией 3,4,5. Эффективное поглощение и процесс антигенов антигенпрезентирующими клетками (АПК) считаются важным этапом в нисходящих сигнальных каскадах и инициировании иммунного ответа 6,7,8. Следовательно, получение четкого понимания механизма взаимодействия иммунных клеток с антигенами и разработка адъювантов для усиления интернализации являются эффективными стратегиями повышения эффективности вакцин.

Микро-/наночастицы с уникальными свойствами были ранее исследованы как системы доставки антигенов для опосредования клеточного поглощения антигенов и клеточного взаимодействия с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами 9,10. При контакте с клетками системы доставки начинают взаимодействовать с внеклеточным матриксом и клеточной мембраной, что приводит к интернализации и последующим клеточным ответам11,12. Предыдущие исследования показали, что интернализация частиц происходит через адгезиюклеточной мембраны-частицы 13 с последующей гибкой деформацией клеточной мембраны и диффузией рецептора к поверхностной мембране14,15. В этих условиях свойства системы доставки зависят от сродства к БТР, что впоследствии влияет на количество поглощения16,17.

Чтобы получить представление о конструкции системы доставки для улучшения иммунного ответа, обширные усилия были сосредоточены на исследовании взаимосвязи между свойствами частиц и клеточным поглощением. Настоящее исследование вытекает из наблюдения, что твердые микро-/наночастицы с различными зарядами, размерами и формами часто изучаются в этом свете, в то время как роль текучести в интернализации антигена редко исследуется18,19. Фактически, во время адгезии мягкие частицы продемонстрировали динамические изменения кривизны и боковые диффузии для увеличения площади контакта для поливалентных взаимодействий, которые вряд ли могут быть воспроизведены твердыми частицами20,21. Кроме того, клеточные мембраны представляют собой фосфолипидные бислои (сфинголипиды или холестерин) в месте поглощения, а гидрофобные вещества могут изменять конформационную энтропию липидов, уменьшая количество энергии, необходимой дляклеточного поглощения 22,23. Таким образом, усиление подвижности и содействие гидрофобности системы доставки может быть эффективной стратегией усиления интернализации антигена для усиления иммунного ответа.

Пикерирующие эмульсии, стабилизированные твердыми частицами, собранными на границе раздела между двумя несмешивающимися жидкостями, широко используются в биологической области24,25. Фактически, агрегирующие частицы на границе раздела нефть/вода определяют формирование многоуровневых структур, которые способствуют многоуровневым системам доставки и клеточным взаимодействиям и в дальнейшем индуцируют многофункциональные физико-химические свойства при доставке лекарств. Из-за их деформируемости и боковой подвижности эмульсии Пикеринга, как ожидалось, войдут в мультивалентное клеточное взаимодействие с иммуноцитами и будут распознаны мембранными белками26. Кроме того, поскольку маслянистые мицелловые ядра в эмульсиях Пикеринга не полностью покрыты твердыми частицами, эмульсии Пикеринга обладают промежутками разных размеров между частицами на границе раздела масло/вода, что вызывает более высокую гидрофобность. Таким образом, крайне важно исследовать сродство эмульсий Пикеринга к БТР и подробно остановиться на последующей интернализации для разработки эффективных адъювантов.

Основываясь на этих соображениях, мы разработали стабилизированную наночастицами эмульсию Пикеринга PLGA (PNPE) в качестве системы доставки вакцины с текучестью, которая также помогла получить ценную информацию о сродстве PNPE к BMDC и клеточной интернализации. Адгезия биомиметических внеклеточных везикул (bEV; замена BMDC) к PNPE в режиме реального времени контролировалась методом без меток с использованием микровеса кристаллов кварца с мониторингом диссипации (QCM-D). После характеристики сродства PNPE к BMDC для определения поглощения антигена была использована конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM). Результат показал более высокое сродство PNPE к BMDC и эффективную интернализацию антигена. Мы ожидали, что PNPE будет демонстрировать более высокое сродство к APC, что может лучше стимулировать интернализацию антигенов для усиления иммунных реакций.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все методы, описанные в этом протоколе, были одобрены Институтом технологического проектирования Китайской академии наук. Все эксперименты на животных проводились в строгом соответствии с Правилами ухода за лабораторными животными и их использования и Руководством по этическому обзору животных (Китай, GB/T35892-2018).

1. Получение и характеристика наночастиц PLGA

  1. Получение наночастиц PLGA (PNP)
    1. Добавьте 0,5 г поливинилового спирта (ПВА) к 120 мл деионизированной воды при 90 °C и перемешайте до полного растворения для приготовления раствора ПВА. Хранить раствор в холодильнике (4 °C) после охлаждения до комнатной температуры.
    2. Добавьте 100 мг PLGA к 10 мл смеси ацетона и этанола (соотношение 4:1), чтобы служить масляной фазой.
    3. Поместите 20 мл водного раствора ПВА под вытяжной капюшон и магнитно перемешайте со скоростью 400 об/мин. Добавьте 5 мл масляной фазы в раствор ПВА капля за каплей с помощью шприцевого насоса. Затем перемешайте смесь в вытяжке до полного испарения органических растворителей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При повышении концентрации частиц в масляной фазе раствор водной фазы постепенно превращается в прозрачный и прозрачный светло-голубовато-белый или молочно-белый.
    4. После испарения органических растворителей (2-3 ч) центрифугируют смесь при 15 000 х г. Мойте три или более раз, пока окончательная промывочная вода не станет прозрачной и прозрачной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель данного этапа состоит главным образом в том, чтобы смыть остаточный ПВА на поверхности частиц, чтобы предотвратить его воздействие на препарат эмульсии Пикеринга.
    5. Повторно суспендируют промытые ПНП в 2 мл деионизированной воды и замораживают смесь при -80 °C в течение 24 ч. Впоследствии сублимируют частицы в лиофилизаторе в течение 48-72 ч. Подготовленные ПНП белые стайные.
  2. Характеристика PNP
    1. Чтобы охарактеризовать размер и дзета-потенциал PNP, добавьте 10 мкл PNP в 1 мл деионизированной воды для получения раствора разбавителя и переноса раствора разбавителя в ячейку DTS1070. Включите компьютер и динамический анализатор рассеяния света (DLS), затем поместите ячейку DTS1070 в систему DLS.
    2. Нажмите на программное обеспечение Zeta Size и создайте новый файл измерений, чтобы настроить процедуру определения. Затем запустите процедуру определения размера частиц и распределения дзета-потенциала.
    3. Чтобы наблюдать за морфологией PNP, равномерно распределите раствор PNP объемом 0,1 мл (разбавленный в 40 раз) на лист из оловянной фольги размером 5 см х 5 см и дайте воде испариться естественным образом в хорошо проветриваемом вытяжном шкафу на ночь.
    4. Вырежьте небольшую часть оловянной фольги и закрепите ее на столе образцов проводящей лентой. Опрыскивайте его золотом при токе 10 мА в течение 120 с. Впоследствии наблюдать морфологию поверхности образца с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).

2. Подготовка и характеристика ПНПЭ

  1. Для приготовления PNPE добавьте лиофилизированные PNP в деионизированную воду в концентрации 4 мг/мл (водная фаза), а затем добавьте сквален в качестве масляной фазы. Приготовьте PNPE с помощью одноступенчатой обработки ультразвуком в течение 5 мин при 100 Вт в ультразвуковом аппарате для водяной бани. Соотношение фаз масло-вода составляет 1:9.
  2. Характеристика подготовленного PNPE
    1. Откройте программное обеспечение Mastersizer 2000 и лазер последовательно. Нажмите кнопку Измерить , чтобы открыть предустановленную программу и задать имя образца. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать измерение фона образца, затем, используя капельницу, добавьте 1 мл PNPE в резервуар для образцов лазерного анализатора размера частиц для измерения размера частиц эмульсии три раза параллельно.
    2. Разбавить 20 мкл ПНПЭ в 1 мл деионизированной воды. Опустите 20 мкл эмульсии на предметное стекло. Наблюдать морфологию и однородность эмульсии с помощью оптической микроскопии при 40-кратном увеличении и получать фотографии.
  3. Эффективность загрузки антигена
    1. Растворите 200 мкг овальбумина (OVA) в 500 мл деионизированной воды. Затем смешайте с 500 мл приготовленного ПНПЭ и встряхните в течение 1 ч при комнатной температуре. Удаляют жидкий антиген центрифугированием при 5000 х г в течение 20 мин.
    2. Определение концентраций флюидного антигена с помощью анализов бицинхониновой кислоты (БЦА)27. Формула расчета эффективности загрузки антигена выглядит следующим образом:
      Эффективность загрузки антигена = figure-protocol-4794
      Используйте тот же метод для определения эффективности загрузки антигена SSE, который используется в качестве контрольной группы.
  4. Стабильность PNPE
    1. Разделите 6 мл приготовленного ПНПЭ на шесть равных частей и храните по три части при 4 °C и 25 °C соответственно. Разбавьте 20 мкл хранящегося PNPE в 1 мл деионизированной воды (1:50) на 0, 3 и 6 день. Затем измерьте размер и дзета-потенциал стоковых растворов PNPE, хранящихся при разных температурах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные температуры хранения настроены для сравнения влияния различных температур на стабильность PNPE, что может оптимизировать условия хранения для высокой стабильности и длительного срока хранения.
  5. Получение микрочастиц PLGA (PMP)
    1. Растворите 500 мг PLGA в 5 мл дихлорметана в качестве масляной фазы, а затем перелейте в 50 мл внешней водной фазы, содержащей 1,5% ПВА для получения смеси масло/вода. Гомогенизируют смесь при 3000 об/мин в течение 1 мин с помощью гомогенизатора для получения крупноэмульсий.
    2. Поддерживать однородность размеров частиц PLGA микросфер (определяемых грубыми эмульсиями) путем мембранной эмульгации. Установите мембрану 5,2 мкм в мембранную трубку. Отрегулируйте давление до 800 кПа и держите его стабильным.
    3. Откройте выпускной клапан и подающий клапан, а после добавления грубых эмульсий в резервуар для образцов закройте выпускной клапан и подающий клапан, откройте выпускной клапан и впускной клапан и возьмите послепленочную эмульсию в стакане объемом 200 мл. Повторите процесс три раза, чтобы получить предварительно двойные эмульсии.
    4. Перемешайте предварительно двойные эмульсии, чтобы испарить дихлорметан при комнатной температуре, чтобы вылечить микросферы. Промывайте микросферы деионизированной водой при 7741 х г в течение 3 мин пять раз. Предварительно заморозьте в морозильной камере при -80 °C и, наконец, высушите, чтобы получить высушенные микросферы.
  6. Характеристика PMP
    1. Откройте программное обеспечение Mastersizer 2000 и лазер последовательно. Нажмите кнопку Измерить , чтобы открыть предустановленную программу и задать имя образца. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать измерение фона образца. Затем добавляют 1 мл PMP в резервуар для добавления образца лазерного анализатора размера частиц с капельницей и измеряют размер частиц микрочастиц три раза параллельно.
  7. Анализ мягкости
    ПРИМЕЧАНИЕ: PNPE был нанесен на датчик SiO2 для измерения мягкости.
    1. Очистите кварцевый сенсорный чип SiO2 с помощью УФ-озоновой обработки в течение 10 мин, дважды промойте 5 мл этанола (75% v/v) и высушитеN2. Установите пустой кварцевый сенсорный чип SiO2 в проточную ячейку.
    2. Включите компьютер и активируйте контроль температуры в правом нижнем углу программного обеспечения, чтобы убедиться, что установленная температура примерно на 1 °C ниже комнатной температуры.
    3. Нажмите кнопку «Приобретение » на панели инструментов и выберите «Измерение настройки» для поиска 1, 3, 5, 7, 9 и 11 октав чипа в используемом канале. Нажмите кнопку «Получение » на панели инструментов и выберите «Начать измерение».
    4. Исправьте базовую линию с помощью air, а когда базовая линия будет сбалансирована, выберите Остановить и сохраните файл как пустой.
    5. Очистите чип и отложите 10 мкг/мл PNPE на чипе. Вкратце, включите спин-коатер и установите рабочий параметр. Подключите трубу N2 к отжимному коатеру, отрегулируйте фракционирование газового баллона до 0,4 кПа и поместите чистый чип на присоску отжимного коатера. Добавьте 100 мкл PNPE по каплям в центр датчика SiO2 и закройте верхнюю крышку спин-коатера, чтобы завершить покрытие.
    6. Установите чип с покрытием PNPE в проточную ячейку. Повторите шаги 2.7.3-2.7.4 и сохраните файл как PNPE. Откройте как пустой, так и PNPE-файлы и нажмите кнопку Stitch, чтобы получить соответствующие данные рассеивания (ΔD).

3. Изолировать и культивировать БМДК 28

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все реагенты и образцы помещены на лед, так как это положительно влияет на активность клеток. Для поддержания стерильности выполняйте все шаги на сверхчистой скамейке с использованием стерильной посуды.

  1. Усыпляют мышей C57BL/6 (самки, 6-8 недель) путем вдыханияCO2 и замачивают их в этаноле 70% (v/v) для кратковременной стерилизации.
  2. После замачивания на 3-5 мин переведите мышей на супер чистую скамейку. Удалите мышцы ног с помощью ножниц из нержавеющей стали, чтобы обнажить бедренную и большеберцовую кости, а затем отделите бедренную и большеберцовую кости.
  3. Наполните чашку Петри 70% (v/v) этанолом и замочите в ней чистые кости на 5-10 с для завершения внешней стерилизации. Очистите все кости и поместите их в стерильную трубку со льдом вокруг них.
  4. Обрежьте бедренную и большеберцовую кости близко к суставу ножницами. Вставьте иглу шприца в кость, чтобы промыть костный мозг в центрифужную трубку с использованием предварительно охлажденной среды RPMI (1640).
  5. Смойте два или три раза, пока кость не станет полностью белой. Пипеткой в костный мозг несколько раз отделить все комочки. Отфильтруйте ячейки в центрифужную трубку объемом 15 мл с помощью сита диаметром 40 мкм.
  6. Центрифуга при 4 °C и 500 х г в течение 5 мин. Откажитесь от надосадочного вещества и добавьте 2 мл лизата эритроцитов в осадок в течение 4 мин.
  7. После промывки два или три раза повторно суспендировать клетки в 2 мл полной среды (1 % пенициллин-стрептомицин, 10 % фетальная бычья сыворотка, 20 нг / мл IL-4 и 10 нг / мл GM-CSF). Затем разбавьте 10 мкл клеток в 1 мл PBS и вставьте чип портативного автоматизированного счетчика клеток в разбавление клеток для подсчета клеток. Наконец, семена клеток плотностью 1 х 106 клеток/мл в 10 мм культуральную чашку с полной средой.
  8. Культивируйте клетки в клеточном инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C. Меняйте среду каждые 2 дня. На 7 день переведите клетки в трубку 50 мл и центрифугу при 450 х г в течение 5 мин для сбора клеток.

4. Получение биомиметических внеклеточных везикул (bEV)

  1. Соберите мини-экструдер последовательно в соответствии с инструкциями производителя. Перед использованием убедитесь, что корпус шприца не треснул. Убедитесь, что все уплотнительные кольца находятся в хорошем состоянии перед каждым экспериментом и быстро заменяйте изношенные или поврежденные. Изношенные или поврежденные уплотнительные кольца могут привести к внезапному сбросу давления при работе экструдера.
  2. Многократно аспирируйте БМДК и переносите их в центрифужную трубку. Собирают клетки центрифугированием при 450 х г в течение 5 мин при 4 °C. Давление на клеточные суспензии через 10 мкм, 5 мкм и 1 мкм поликарбонатные мембраны в течение 30 проходов с помощью мини-экструдера29.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения однородности размера bEV суспензии BMDC проталкивались через 10 мкм, 5 мкм и 1 мкм поликарбонатные мембраны в течение 30 проходов. Кроме того, во время работы обязательно прикладывайте силу равномерно и поддерживайте направление силы вдоль оси шприца.
  3. Центрифугируйте объединенные супернатанты в течение 5 мин при 1000 х г и 4 °C для удаления ячеек. Соберите супернатант и центрифугируйте его при 3000 х г в течение 5 мин при 4 °C, чтобы удалить оставшиеся клетки и клеточный мусор.
  4. Соберите супернатант и центрифугируйте его при 100 000 х г в течение 90 мин при 4 °C. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановите bEV в 2 мл HEPES-буферного физиологического раствора (HBS). Очищают bEV путем фильтрации через мембрану 0,45 мкм и хранят очищенные bEV при −80 °C.

5. bEV придерживаются PNPE

ПРИМЕЧАНИЕ: Датчик SiO2 был модифицирован методом спин-покрытия.

  1. Датчик SiO2 модифицирован поли-L-лизином (ФАПЧ).
    1. Очистите кварцевый сенсорный чип SiO2 с помощью обработки УФ-озоном в течение 10 минут, дважды промойте этанолом и высушитеN2.
    2. Включите отжимной коатер, нажав кнопку питания , нажмите кнопку Control и установите время и скорость покрытия. Начальная скорость вращения составляет 400 об/мин, которая неуклонно увеличивается до 5000 об/мин.
    3. Подключите трубу N2 к отжимному коатеру и отрегулируйте фракционирование газового баллона до 0,4 кПа. Поместите чистый чип на присоску отжима. Добавьте 100 мкл ФАПЧ по каплям к центру датчика SiO2 и закройте верхнюю крышку спин-коатера.
    4. Нажмите кнопку Пуск , чтобы начать нанесение покрытия на образец и остановить машину после завершения. Выключите вакуумный насос, отключите кнопки питания и управления и извлеките модифицированный ФАПЧ датчик SiO2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед нажатием кнопки Пуск убедитесь, что установлены время и скорость нанесения покрытия. Кроме того, убедитесь, что датчик SiO2 расположен в центре присоски. Убедитесь, что крышка закрыта перед запуском процесса, чтобы предотвратить несчастные случаи.
  2. Определение адгезии bEV к PNPE
    1. Включите компьютер, электронный блок, перистальтический насос и активируйте контроль температуры в правом нижнем углу программного обеспечения, чтобы убедиться, что установленная температура примерно на 1 °C ниже комнатной температуры.
    2. Поместите модифицированные ФАПЧ датчики SiO2 в проточную ячейку в соответствии с инструкциями по эксплуатации и подключите измерительную линию между проточной ячейкой и проточным насосом. Поместите проточную ячейку внутрь системы проточного модуля и промойте их сверхчистой водой перед началом экспериментов.
    3. Нажмите на панель инструментов «Приобретение » и выберите «Измерение настройки» для поиска 1, 3, 5, 7, 9 и 11 октав чипа в используемом канале. Чтобы скорректировать базовую линию, нажмите «Начать измерение», чтобы позволить воздуху поступать в модуль потока до тех пор, пока воздушная базовая линия не станет гладкой. Впоследствии проточите деионизированную воду в течение 10-15 мин, чтобы восстановить исходное равновесие раствора.
    4. Перекачивайте приготовленный раствор PNPE в проточный модуль со скоростью потока 50 мкл/мин для достижения равновесной адсорбции на датчике SiO2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: ΔF больше не изменяется при повторной закачке PNPE в проточный модуль, что указывает на то, что поверхность датчиков SiO2 полностью покрыта PNPE.
    5. Перекачивайте приготовленный раствор bEV в проточный модуль со скоростью потока 50 мкл/мин для отслеживания процесса адгезии bEV к поверхности PNPE.

6. CLSM анализ поглощения антигена

  1. Кокультура PNPE-OVA с БМДК
    1. Инкубируйте БМДК с 1640 полными средами (1% пенициллин-стрептомицин, 10% фетальной бычьей сыворотки, 20 нг/мл IL-4 и 10 нг/мл GM-CSF) в течение 7 дней, а затем посеяли их в небольшие конфокальные лазерные чашки при 1 х 106 на лунку на ночь при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 .
    2. Смешайте 0,5 мл меченой Cy5 OVA (400 мкг/мл) с 0,5 мл PNPE в течение 1 ч и удалите жидкий антиген центрифугированием при 5000 х г в течение 20 мин для разработки рецептуры вакцины. После повторной суспензии с 200 мкл деионизированной воды добавляют 10 мкл состава (10 мкг/мл OVA) в небольшие конфокальные лазерные тарелки под суперчистым стендом и совместно культивируют с БМДК в течение 6 ч.
  2. Актиновое цитоскелетное пятно
    1. Удалите культуральную жидкость из клеток и дважды промыть их предварительно нагретым фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS; pH 7,4).
    2. Зафиксируйте клетки 4% раствором формальдегида в ПБС в течение 10 мин при комнатной температуре. Во время фиксации избегайте фиксаторов, содержащих метанол, которые могут разрушить актин.
    3. Промывайте ячейки PBS два или три раза при комнатной температуре в течение 10 мин каждая. Пермеабилизируют клетки 100 мкл 0,5% раствора Тритона Х-100 в течение 5 мин при комнатной температуре. Промыть ячейки с PBS два или три раза при комнатной температуре в течение 10 мин каждая еще раз.
    4. Накройте ячейки на стеклянной тарелке небольших конфокальных лазерных тарелок 200 мкл флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-конъюгированного рабочего раствора фаллоидина и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Чтобы уменьшить фоновый сигнал, добавляют 1% бычий сывороточный альбумин в FITC-конъюгированный рабочий раствор фаллоидина. Кроме того, накройте крышку небольших конфокальных лазерных тарелок во время инкубации, чтобы предотвратить испарение раствора.
    5. Промывайте ячейки PBS трижды в течение 5 минут каждая. Повторно окрашивайте ядра 200 мкл раствора DAPI (концентрация: 100 нМ) в течение примерно 30 с.
  3. Анализ изображений
    1. Включите аппаратное обеспечение конфокального микроскопа последовательно, включая лазер, конфокальный, микроскоп и компьютер. Щелкните программное обеспечение NIS-Elements AR 5.20.00 и выберите Nikon Confocal , чтобы войти в систему тестирования.
    2. В системе конфокального микроскопа включите различные блоки в указанном порядке. Сначала настройте каналы FITC, DAPI и Cy5 и настройте соответствующие HV и смещение. Затем выберите масляную линзу 100x и положите каплю кедрового масла сверху. Поместите небольшие конфокальные лазерные тарелки, содержащие окрашенные БМДК, на ступень микроскопа.
    3. Нажмите кнопку Сканировать . Под флуоресцентным микроскопом найдите интересующие клетки, перемещая ось X, ось Y и ось Z. Настройте интенсивность лазера, размер изображения и другие параметры, чтобы обеспечить сканирование высококачественных конфокальных изображений. Наконец, нажмите кнопку «Захват» и сохраните изображения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для получения PNPE использовалась простая одношаговая сонификация. Во-первых, мы подготовили однородные PNP для использования в качестве твердого стабилизатора (рисунок 1A). Морфология PNP наблюдалась через SEM, показывая, что они в основном однородны и сферические (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы разработали стабилизированную наночастицами эмульсию масла/воды PLGA в качестве системы доставки для усиленной интернализации антигена. Подготовленный PNPE обладал плотно упакованной поверхностью для поддержки места посадки и уникальной мягкостью и текучестью для мощного клеточног...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Проектом, поддержанным Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), От 0 до 1 Оригинальный инновационный проект Программы фундаментальных передовых научных исследований Китайской академии наук (ZDBS-LY-SLH040), Фондом инновационных исследовательских групп Национального фонда естественных наук Китая (грант No 21821005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AddVaxInvivoGenVac-adx-10
Cell StrainerBiosharpBS-70-CS70 μm
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)NikonA1
Cy3 NHS EsterYEASEN40777ES03
DAPI Staining SolutionBeyotimeC1005
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000-044
FITC PhalloidinSolarbioCA1620
Mastersizer 2000 Particle Size AnalyzerMalvern
Micro BCA protein Assay KitThermo Science23235
Membrane emulsification equipmentZhongke Senhui Microsphere TechnologyFM0201/500M
Mini-ExtruderAvanti Polar Lipids, Inc
NANO ZSMalvernJSM-6700F
Polycarbonate membranesAvanti Polar Lipids, Inc
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA)Sigma-Aldrich26780-50-7Mw 7,000-17,000
Poly-L-lysine SolutionSolarbioP2100
Poly (vinyl alcohol) (PVA)Sigma-Aldrich9002-89-5
QSense Silicon dioxide sensorBiolin ScientificQSX 303Surface roughness < 1 nm RMS
Quartz Crystal MicrobalanceBiosharpQ-SENSE E4
RPMI Medium 1640 basicGibcoC22400500BTL-Glutamine, 25 mM HEPES
Scanning Electron Microscopy (SEM)JEOLJSM-6700F
SqualeneSigma-Aldrich111-02-4

Ссылки

  1. Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170(2022).
  2. Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
  3. Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474(2022).
  4. Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
  5. Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
  6. Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
  7. Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
  8. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  9. Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
  10. Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
  11. Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
  12. Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
  13. Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
  14. Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
  15. Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129(2021).
  16. Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
  17. Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
  18. Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880(2020).
  19. Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610(2022).
  20. Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
  21. Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
  22. De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995(2022).
  23. Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781(2019).
  24. Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768(2022).
  25. Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897(2022).
  26. Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534(2014).
  27. Chen, l, et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
  28. Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
  29. Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007(2020).
  30. Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606(2021).
  31. McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039(2021).
  32. Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
  33. D'Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360(2021).
  34. Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242(2021).
  35. Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены