JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يشرح البروتوكول الحالي توليد طبقة أحادية 2D من الخلايا المخيخية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات للتحقيق في المراحل المبكرة من تطور المخيخ.

Abstract

يعد التطور الدقيق وفي الوقت المناسب للمخيخ أمرا بالغ الأهمية ليس فقط للتنسيق والتوازن الحركي الدقيق ولكن أيضا للإدراك. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاضطراب في نمو المخيخ متورط في العديد من اضطرابات النمو العصبي ، بما في ذلك التوحد واضطراب نقص الانتباه وفرط النشاط (ADHD) والفصام. لم تكن التحقيقات في تطور المخيخ لدى البشر ممكنة في السابق إلا من خلال دراسات ما بعد الوفاة أو التصوير العصبي ، ومع ذلك فإن هذه الطرق ليست كافية لفهم التغيرات الجزيئية والخلوية التي تحدث في الجسم الحي أثناء التطور المبكر ، وهو الوقت الذي تنشأ فيه العديد من اضطرابات النمو العصبي. إن ظهور تقنيات لتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) من الخلايا الجسدية والقدرة على إعادة تمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى خلايا عصبية قد مهدت الطريق للنمذجة في المختبر لنمو الدماغ المبكر. تقدم الدراسة الحالية خطوات مبسطة نحو توليد خلايا مخيخية للتطبيقات التي تتطلب بنية أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (2D). يتم اشتقاق الخلايا المخيخية التي تمثل مراحل النمو المبكرة من iPSCs البشرية من خلال الخطوات التالية: أولا ، تصنع الأجسام الجنينية في ثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) ، ثم يتم معالجتها باستخدام FGF2 والأنسولين لتعزيز مواصفات مصير المخيخ ، وأخيرا ، يتم تمييزها بشكل نهائي كطبقة أحادية على ركائز بولي إل أورنيثين (PLO) / لامينين المغلفة. في 35 يوما من التمايز ، تعبر مزارع الخلايا المخيخية المشتقة من iPSC عن علامات المخيخ بما في ذلك ATOH1 و PTF1α و PAX6 و KIRREL2 ، مما يشير إلى أن هذا البروتوكول يولد سلائف الخلايا العصبية المخيخية glutamatergic و GABAergic ، بالإضافة إلى أسلاف خلايا Purkinje. علاوة على ذلك ، تظهر الخلايا المتمايزة مورفولوجيا عصبية مميزة وهي إيجابية لعلامات التألق المناعي للهوية العصبية مثل TUBB3. تعبر هذه الخلايا عن جزيئات التوجيه المحوري ، بما في ذلك semaphorin-4C و plexin-B2 و neuropilin-1 ، ويمكن أن تكون بمثابة نموذج للتحقيق في الآليات الجزيئية لنمو الخلايا العصبية والاتصال المشبكي. تولد هذه الطريقة خلايا عصبية مخيخية بشرية مفيدة للتطبيقات النهائية ، بما في ذلك التعبير الجيني والدراسات الفسيولوجية والمورفولوجية التي تتطلب تنسيقات أحادية الطبقة 2D.

Introduction

إن فهم تطور المخيخ البشري والنوافذ الزمنية الحرجة لهذه العملية أمر مهم ليس فقط لفك تشفير الأسباب المحتملة لاضطرابات النمو العصبي ولكن أيضا لتحديد أهداف جديدة للتدخل العلاجي. كانت نمذجة تطور المخيخ البشري في المختبر صعبة ، ولكن بمرور الوقت ، ظهرت العديد من البروتوكولات التي تميز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) أو iPSCs مع مصائر النسب المخيخي1،2،3،4،5،6،7،8 . علاوة على ذلك ، من المهم تطوير بروتوكولات تولد نتائج قابلة للتكرار ، وبسيطة نسبيا (لتقليل الخطأ) ، وليست ثقيلة على التكاليف النقدية.

تم إنشاء البروتوكولات الأولى للتمايز المخيخي من ثقافات 2D من الأجسام الجنينية المطلية (EBs) ، مما أدى إلى مصير المخيخ مع عوامل نمو مختلفة مماثلة لتطور الجسم الحي ، بما في ذلك WNT و BMPs و FGFs 1,9. أحدث البروتوكولات المنشورة المستحثة التمايز في المقام الأول في ثقافة العضوية ثلاثية الأبعاد مع FGF2 والأنسولين ، تليها FGF19 و SDF1 للهياكل الشبيهة بالشفاهالمعينية 3،4 ، أو استخدمت مزيجا من FGF2 و FGF4 و FGF85. أدت كلتا طريقتي تحريض المخيخ العضوي إلى عضويات مخيخية 3D مماثلة حيث أبلغ كلا البروتوكولين عن تعبير علامة مخيخ مماثل في نقاط زمنية متطابقة. قام هولمز وهاين بتوسيع بروتوكول 3D5 الخاص بهما لإظهار أنه يمكن توليد خلايا المخيخ ثنائية الأبعاد من hESCs و iPSCs ، والتي تبدأ كمجاميع ثلاثية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر Silva et al.7 أن الخلايا التي تمثل الخلايا العصبية المخيخية الناضجة في 2D يمكن توليدها بنهج مشابه لهولمز وهاين ، باستخدام نقطة زمنية مختلفة للتبديل من 3D إلى 2D وتمديد وقت النمو والنضج.

يحث البروتوكول الحالي على مصير المخيخ في iPSCs الخالية من التغذية عن طريق توليد أجسام جنينية حرة عائمة (EBs) باستخدام الأنسولين و FGF2 ثم طلاء EBs على أطباق مغلفة ب PLO / laminin في اليوم 14 للنمو والتمايز ثنائي الأبعاد. بحلول اليوم 35 ، يتم الحصول على خلايا ذات هوية مخيخية. القدرة على تلخيص المراحل المبكرة من تطور المخيخ ، وخاصة في بيئة 2D ، تسمح للباحثين بالإجابة على أسئلة محددة تتطلب تجارب مع بنية أحادية الطبقة. هذا البروتوكول قابل أيضا لمزيد من التعديلات مثل الأسطح الدقيقة ، ومقايسات النمو المحوري ، وفرز الخلايا لإثراء مجموعات الخلايا المطلوبة.

Protocol

تمت الموافقة على أبحاث الموضوعات البشرية بموجب موافقة مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة أيوا رقم 201805995 ورقم موافقة لجنة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات بجامعة أيوا 2017-02. تم الحصول على خزعات الجلد من الأشخاص بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة. تمت زراعة الخلايا الليفية في DMEM مع 15٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ محلول أحماض أمينية غير أساسية MEM عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تمت إعادة برمجة الخلايا الليفية باستخدام مجموعة إعادة برمجة عرضية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد) باستخدام nucleofector للتثقيب الكهربائي. تم تنفيذ جميع الإجراءات في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية من النوع A2 ("غطاء المحرك" لفترة قصيرة). كانت جميع وسائط زراعة الخلايا خالية من المضادات الحيوية. لذلك ، تم تنظيف كل مكون دخل غطاء المحرك بنسبة 70٪ من الإيثانول. تم ترشيح جميع وسائط ومكونات زراعة الخلايا أو فتحها في الغطاء للحفاظ على عقمها.

1. التحضير التجريبي

  1. تحضير الألواح المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي (BMM).
    ملاحظة: يتجمد BMM بسرعة أكبر في درجات الحرارة الأكثر دفئا. يجب تحضير الألواح بسرعة ووضعها على الفور عند 4 درجات مئوية للتخزين.
    1. قم بإذابة BMM (انظر جدول المواد) على الجليد ، عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل ، أو طوال الليل.
    2. امزج DMEM / F12 و BMM بتركيز نهائي قدره 80 ميكروغرام / مل. قم بتوزيع محلول BMM في أطباق زراعة الأنسجة (1 مل ل 35 مم و 2 مل لأطباق 60 مم) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو طوال الليل قبل طلاء الخلايا.
      ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق غير المستخدمة في 4 °C لمدة 2 أسابيع.
  2. تحضير ألواح مطلية ببولي-L-أورنيثين / لامينين (PLO / laminin).
    1. قم بإعداد 20 ميكروغرام / مل PLO (انظر جدول المواد) في DPBS +/+ معقم وأضف 1 مل إلى كل بئر من لوحة 6 آبار. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
    2. في اليوم التالي ، قم بشفط PLO باستخدام شفاط فراغ واغسله مرتين باستخدام DPBS +/+. يجفف في الهواء في الغطاء.
      ملاحظة: يمكن تخزين الألواح المجففة بالهواء عند 4 °C لمدة تصل إلى 2 أسابيع ، ملفوفة بورق الألمنيوم ، للاستخدام في المستقبل.
    3. قم بإعداد 10 ميكروغرام / مل لامينين (انظر جدول المواد) في DPBS +/+ وأضف 1 مل إلى كل بئر من لوحة 6 آبار. احتضان لمدة 3 ساعات على الأقل أو طوال الليل عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
    4. قم بشفط الصفيحة باستخدام شفاط فراغ وأضف إما 1 مل من DPBS +/+ المتوسط أو المعقم.
      ملاحظة: يجب ألا يجف طلاء الصفيحة. يجب إضافة PBS أو وسيط ثقافي مناسب على الفور لمنع ذلك. يمكن تخزين الألواح المطلية في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  3. إعداد حل تمرير PSC.
    ملاحظة: يلزم وجود مقياس تناضح (انظر جدول المواد) لعمل حل تمرير PSC10.
    1. قم بإذابة 11.49 جم من كلوريد البوتاسيوم (KCl) و 0.147 جم من ثنائي هيدرات سترات الصوديوم (HOC (COONa) (CH 2 COONa) 2 * 2H2O) في 400 مل من الماء المعقم لزراعة الخلايا (انظر جدول المواد).
    2. قم بقياس حجم المحلول وتسجيله كوحدة التخزين الأولية (Vi).
    3. قم بقياس الأسمولية واضبطها على 570 mOsm عن طريق إضافة ماء معقم من درجة زراعة الخلايا باستخدام الصيغة Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
    4. قم بتصفية تعقيم المحلول بفلتر 0.20 ميكرومتر وقم بعمل 10 مل من القسمة العضلية. قم بتخزين القسمة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. تحضير وسط الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC).
    ملاحظة: يتم الاحتفاظ ب iPSCs في وسط يحتوي على FGF2 مستقر للحرارة (انظر جدول المواد) ، مما يوفر جدول تغذية خال من عطلة نهاية الأسبوع. لم تتم تجربة وسائط PSC الأخرى المتاحة تجاريا لهذا البروتوكول.
    1. قم بإذابة المكمل المتوسط PSC طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    2. أضف 10 مل من مكمل PSC المتوسط إلى 500 مل من وسط PSC القاعدي. اصنع 25 مل من القسمة وخزنها في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين القسمة المجمدة في -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر. يجب تخزين القسمة المذابة في 4 °C واستخدامها في غضون 2 أسابيع. يمكن تجميد الخلايا للتخزين طويل الأجل في وسط PSC مع 10٪ (v / v) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
  5. تحضير PSC ذوبان المتوسطة.
    1. ملحق PSC وسط مع 50 نانومتر كرومان ، 1.5 ميكرومتر إمريكاسان ، 1x مكمل بوليامين ، و 0.7 ميكرومتر عبر ISRIB (كوكتيل CEPT11) (انظر جدول المواد).
    2. قم بالتعقيم بالفلتر بفلتر 0.20 ميكرومتر واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
  6. تحضير ماصات الزجاج المسحوبة.
    1. اسحب ماصات باستور الزجاجية مقاس 22.9 سم (9 بوصات) إلى قطعتين فوق موقد بنسن ، ~ 2 سم أسفل الرقبة ، مما يؤدي إلى إنشاء ماصات ، بحيث يكون الجانب الأرق ~ 4 سم أقصر من الآخر.
    2. بمساعدة اللهب ، ثني أطراف الجانب المسحوب لإنشاء "r" سلس.
    3. ضع الماصات المسحوبة في أكمام الأوتوكلاف والأوتوكلاف للتعقيم.
  7. تحضير وسط تمايز المخيخ (CDM).
    1. امزج IMDM ومزيج المغذيات F12 من هام بنسبة 1: 1. استكمل المزيج ب 1x L-alanine-L-glutamine ، 1٪ (v / v) مركز دهون محدد كيميائيا ، 0.45 mM 1-thio-glycerol ، 15 μL / mL apo-transferrin ، 5 mg / mL ألبومين مصل البقر (BSA) ، و 7 ميكروغرام / مل من الأنسولين (انظر جدول المواد).
    2. قم بتعقيم المرشح باستخدام مرشح 0.20 ميكرومتر ، وقم بتخزينه في 4 درجات مئوية ، واستخدمه في غضون شهر واحد.
  8. تحضير وسط نضج المخيخ (CMM).
    1. تكملة الوسط العصبي القاعدي مع 1x L-ألانين-L-الجلوتامين الملحق و 1x N-2 الملحق (انظر جدول المواد).
    2. قم بتعقيم المرشح بفلتر 0.20 ميكرومتر ، وقم بتخزينه في 4 درجات مئوية ، واستخدمه في غضون أسبوعين.

2. ثقافة iPSC خالية من التغذية

  1. قم بإذابة الخلايا باتباع الخطوات أدناه.
    1. ضع لوحة BMM (الخطوة 1.1) في حاضنة 37 درجة مئوية للهلام لمدة ساعة واحدة على الأقل أو طوال الليل قبل إذابة الخلايا.
    2. قم بالتسخين المسبق ل 10 مل من وسط ذوبان PSC (الخطوة 1.5) عند 37 درجة مئوية.
    3. انقل الكريوفيال مع الخلايا من النيتروجين السائل إلى حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: لتجنب توليد مصدر للتلوث في مساحة زراعة الخلايا ، لا ينصح باستخدام حمام مائي قياسي. بدلا من ذلك ، يمكن تسخين المياه العذبة في دورق صغير إلى 37 درجة مئوية لتوليد حمام مائي يستخدم لمرة واحدة.
    4. عندما يكون هناك قطعة صغيرة من الثلج في الأنبوب ، أخرجها من الحمام المائي ، وجفف الأنبوب ، ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول. انقل الأنبوب إلى غطاء المحرك واستخدم ماصة مصلية سعة 2 مل أو 5 مل (انظر جدول المواد) لنقل الخلايا برفق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    5. أضف 8 مل من وسط إذابة PSC إلى الخلايا بالتنقيط أثناء تحريك الأنبوب المخروطي. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
    6. نضح بعناية الطاف مع شفاط فراغ دون إزعاج بيليه الخلية. أعد تعليق الخلايا في 2 مل من وسط ذوبان PSC.
    7. قم بشفط BMM من اللوحة وأضف الخلايا المعاد تعليقها بالتنقيط في جميع أنحاء اللوحة للتوزيع المتساوي.
    8. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. قم بتحديث الوسيط في اليوم التالي باستخدام وسيط PSC. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسيط يوميا.
  2. حافظ على الخلايا باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بتسخين الحجم الضروري من وسط PSC مسبقا عند 37 درجة مئوية (على سبيل المثال ، 1 مل من الوسط لكل لوحة 35 مم).
    2. تحقق من الألواح بحثا عن الخلايا أو المستعمرات المتمايزة وقم بإزالة الخلايا المتمايزة باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة (الخطوة 1.6).
      ملاحظة: مستعمرات iPSC لها حواف ناعمة مع خلايا متطابقة شكليا.
    3. قم بتغيير الوسيط المستهلك يوميا والمرور كل 3-4 أيام أو عند الوصول إلى التقاء 70٪.
  3. تمرير الخلايا.
    1. ضع الكمية اللازمة من لوحات BMM في الحاضنة لمدة 1 ساعة على الأقل أو طوال الليل قبل المرور. قم بتسخين الكمية اللازمة من وسط PSC مسبقا (الخطوة 1.3) عند 37 درجة مئوية.
    2. باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة ، قم بتنظيف أي خلايا أو مستعمرات متمايزة.
    3. نضح الوسط المستهلك باستخدام شفاط فراغ وأضف وسط تفكك PSC ، 1 مل لكل طبق 35 مم. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 دقائق.
      ملاحظة: إذا كانت المستعمرات تنطلق في محلول تمرير PSC قبل إضافة وسيط PSC ، فيمكن تقليل وقت الحضانة.
    4. استنشاق محلول تمرير PSC وإضافة وسيط PSC دافئ مسبقا.
    5. باستخدام طرف ماصة معقم سعة 200 ميكرولتر ، قم بخدش خطوط موازية لبعضها البعض في اتجاه واحد ، وقم بتدوير اللوحة 90 درجة ، وقم بعمل مجموعة ثانية من خطوط الخدش متعامدة مع الخطوط السابقة (مما يجعل نمطا متقاطعا عبر اللوحة).
    6. قم بشفط محلول BMM من الألواح المحددة. اجمع المستعمرات باستخدام ماصة مصلية ووزعها على لوحات BMM جديدة.
    7. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. تغيير الوسيط يوميا.
  4. تجميد الخلايا.
    1. قم بإعداد المبردات عن طريق تسمية المحتوى وتعقيمه تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) في الغطاء (انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة.
    2. قم بإعداد وسط تجميد PSC عن طريق استكمال وسيط PSC بنسبة 10٪ (v / v) DMSO. اتبع الخطوات 2.3.2-2.3.5.
    3. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع ماصة مصلية سعة 5 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 200 × جم لمدة 5 دقائق عند RT.
    4. استنشاق الوسط بعناية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط تجميد PSC.
    5. توزيع في cryovials. ضع القوارير في حاوية تجميد وضع الحاوية في فريزر -80 درجة مئوية.
    6. في اليوم التالي ، انقل المبردات إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.

3. تمايز المخيخ

ملاحظة: قبل البدء في التمايز ، يتم تمرير iPSCs إلى ستة أطباق 35 مم وتكون جاهزة للتمايز عندما تكون عند التقاء 70٪. سيتم نقل كل لوحة 35 مم إلى بئر واحد من لوحة 6 آبار.

  1. في اليوم 0 ، ارفع مستعمرات iPSC الصحية لتشكيل EB.
    1. أضف 1 مل من آلية التنمية النظيفة (الخطوة 1.7) مكملة ب 10 ميكرومتر Y-27632 و 10 ميكرومتر SB431542 (انظر جدول المواد) إلى كل بئر من لوحة ملحق منخفضة للغاية (ULA) ذات 6 آبار وضعها في الحاضنة حتى تصبح المستعمرات المرفوعة جاهزة للإضافة إلى الآبار.
    2. نظف الخلايا المتمايزة باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة. نضح الوسط وإضافة 1 مل من محلول تمرير PSC لكل طبق 35 مم. احتضن لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية ، ونضح ، وأضف 2 مل من CDM مكملا ب 10 ميكرومتر Y-27632 و 10 ميكرومتر SB431542.
      ملاحظة: إذا كانت المستعمرات تنطلق في محلول تمرير PSC قبل إضافة آلية التنمية النظيفة ، فيمكن تقليل وقت الحضانة.
    3. تحت المجهر المقلوب للضوء المرسل ، ارفع المستعمرات برفق باستخدام الحافة المنحنية للماصة الزجاجية المسحوبة باستخدام تكبير 4x. بمجرد رفع كل مستعمرة ، انقل الكل برفق إلى بئر واحد من لوحة ULA المكونة من 6 آبار باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. كرر هذه العملية لكل لوحة iPSC. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: إذا كانت المستعمرات كبيرة جدا أو تم دمجها ، فيمكن تقطيعها بطرف الماصة الزجاجية المسحوبة لإنشاء EBs أصغر.
  2. في اليوم الثاني ، أضف FGF2 إلى كل بئر إلى تركيز نهائي قدره 50 نانوغرام / مل.
    ملاحظة: FGF2 المستخدم في تمايز المخيخ غير مستقر للحرارة. لم يتم اختبار هذا البروتوكول باستخدام FGF2 المستقر للحرارة.
  3. في اليوم 7 ، قم بتغيير متوسط 1/3. للحصول على 3 مل من إجمالي الوسط في البئر ، مع ماصة 1000 ميكرولتر ، قم بشفط 1 مل من الوسط المستهلك برفق واستبدله ب 1 مل من آلية التنمية النظيفة الطازجة. احتضان EBs لمدة 7 أيام.
  4. في اليوم 14 ، قم بشفط كل الوسط المستهلك برفق باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. لضمان الحد الأدنى من الضرر الذي يلحق ب EBs ، قم بتدوير اللوحة لجمع كل EBs في وسط اللوحة ، ثم قم بإمالة اللوحة واستنشاقها ببطء من الحافة.
    1. مع انخفاض الكمية المتوسطة ، ضع اللوحة ببطء بشكل مسطح واستمر في النضح. اترك وسطا كافيا لتجنب تجفيف EBs. بعد ذلك ، أضف 3 مل من آلية التنمية النظيفة الطازجة المكملة ب 10 ميكرومتر Y-27632. انقل EBs باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل إلى طبق مطلي ب PLO / laminin (الخطوة 1.2).
      ملاحظة: اعتمادا على تطبيق المصب ، يمكن نقل EBs إلى لوحة PLO / laminin ذات 6 آبار أو يمكن نقل EBs الفردية إلى بئر واحد من لوحة أو غطاء 24 بئرا مطلية ب PLO / laminin.
  5. في اليوم 15 ، استنشاق الوسط واستبداله بآلية التنمية النظيفة الجديدة.
    ملاحظة: من المهم إضافة وسط كاف إلى الآبار لضمان وجود وسط كاف بين التغذية ، حيث سيكون هناك تبخر بمرور الوقت (على سبيل المثال ، بالنسبة للبئر في لوحة ذات 6 آبار ، أضف 3 مل من الوسط). إذا بدأ الوسيط في التحمض (يتحول إلى اللون الأصفر والأصفر) ، فقم بتحديث الوسيط حتى لو لم يكن مدرجا في جدول التغذية حتى نهاية البروتوكول.
  6. في اليوم 21 ، استنشاق الوسيط المستهلك واستبداله ب CMM. في اليوم 28 ، قم بتغيير الوسيط باستخدام CMM جديد. في اليوم 35 ، احصد الخلايا لمزيد من التطبيقات.

4. إعداد عينة لعزل الحمض النووي الريبي

  1. نضح الوسط وإضافة 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلية (انظر جدول المواد) إلى كل بئر من لوحة 6 آبار. اتركه لبضع ثوان واستنشقه.
  2. احتضان اللوحة ، مع الغطاء ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. اضغط على جوانب اللوحة لفصل الخلايا.
  3. أضف 1 مل من CMM (الخطوة 1.8) واجمع الخلايا في أنبوب سعة 1.5 مل.
  4. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة (انظر جدول المواد) لمدة 30 ثانية عند RT (السرعة القصوى 2000 × جم) ، وتجاهل الوسط ، وإضافة 1 مل من 1x PBS pH 7.4 لغسل حبيبات الخلية.
  5. قم بتكوير الخلايا مرة أخرى باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة لمدة 30 ثانية في RT واغسلها باستخدام PBS مرة أخرى.
  6. بيليه الخلايا وتجاهل برنامج تلفزيوني. تحليل الخلايا في الفينول وجوانيدين إيزوثيوسيانات التي تحتوي على كاشف (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا المحللة في الفينول وجوانيدين إيزوثيوسيانات المحتوية على كاشف في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة. يمكن تحلل الخلايا مباشرة في الطبق اعتمادا على طريقة عزل الحمض النووي الريبي والكواشف المستخدمة. نظرا لانخفاض عدد الخلايا في الطبق ، فإن عزل الحمض النووي الريبي باستخدام أعمدة دوران السيليكا (انظر جدول المواد) سيؤدي إلى زيادة إنتاجية الحمض النووي الريبي.

5. تحضير الخلايا لتلطيخ المناعي

ملاحظة: بالنسبة للوحة المكونة من 24 بئرا ، يكفي EB واحد لكل بئر.

  1. في اليوم 35 ، قم بنشاق الوسط المستهلك وغسل الخلايا بإضافة 1 مل من DPBS +/+ لكل بئر (لبئر واحد من لوحة 24 بئر).
  2. استنشاق DPBS +/+ وإضافة 500 ميكرولتر من بارافورمالدهيد البارد 4٪ (PFA ، انظر جدول المواد) المحضر في DPBS +/+ لكل بئر. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
  3. قم بإزالة 4٪ PFA واغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS +/+ ، كما في الخطوة 5.1. أضف 1 مل من DPBS +/+ وقم بتخزين الخلايا عند 4 درجات مئوية حتى يتم تلطيخها.
    ملاحظة: ينصح بعمل تلطيخ الفلورسنت المناعي في غضون 1 أسبوع بعد التثبيت لتجنب انفصال الخلايا وفقدان المستضدات. ومع ذلك ، اعتمادا على الجسم المضاد والموقع الخلوي للهدف ، يمكن إجراء التلوين في أوقات لاحقة تصل إلى 4 أسابيع بعد التثبيت.

النتائج

نظرة عامة على تمايز المخيخ 3D إلى 2D
يتم إنشاء الخلايا المخيخية بدءا من iPSCs. يوضح الشكل 1 أ سير العمل العام وإضافة المكونات الرئيسية للتمايز. في اليوم 0 ، يتم تصنيع EBs عن طريق رفع مستعمرات iPSC برفق (الشكل 1B) باستخدام ماصة زجاجية مسحوبة في CDM تحتوي على SB4315...

Discussion

تعد القدرة على نمذجة نمو المخيخ البشري في المختبر مهمة لنمذجة الأمراض بالإضافة إلى تعزيز فهم نمو الدماغ الطبيعي. تخلق البروتوكولات الأقل تعقيدا وفعالية من حيث التكلفة المزيد من الفرص لتوليد البيانات القابلة للتكرار والتنفيذ الواسع عبر مختبرات علمية متعددة. يتم وصف بروتوكول تمايز ا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه.

Acknowledgements

نشكر جيني غرينغر ريتشاردز على عملها الشامل في التحقق من صحة موضوعات التحكم لدينا ، والتي أنشأنا منها iPSCs للتحكم. تم دعم هذا العمل من قبل NIH T32 MH019113 (إلى D.A.M. و K.A.K.) ، و Nellie Ball Trust (إلى T.H.W. و A.J.W.) ، NIH R01 MH111578 (إلى V.A.M. و J.A.W.) ، NIH KL2 TR002536 (إلى A.J.W.) ، وصندوق Roy J. Carver الخيري (إلى V.A.M. ، J.A.W. ، و A.J.W.). تم إنشاء الأرقام مع BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Serological pipetteFisher Scientific13-678-26D
1-thio-glycerolSigmaM6145
2 mL Serological pipetteFisher Scientific13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm DiaFisher ScientificFB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture DishFalcon353001
4D Nucleofector core unitLonza276885Nucleofector
5 mL Serological pipetteFisher Scientific13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture DishFalcon353004
6-well ultra-low attachment platesCorning3471
9" Disposable Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-20D
Apo-transferrinSigmaT1147
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA9418
Cell culture grade waterCytivaSH30529.02
Chemically defined lipid concentrateGibco11905031
Chroman 1Cayman34681
Class II, Type A2, Biological safety CabinetNuAire, Inc.NU-540-600Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treatedCorning3526
Costar 6-well plate, TC treatedCorning3516
DAPI solutionThermo Scientific62248
DMEMGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide)SigmaD2438
DPBS+/+Gibco14040133
EmricasanCayman22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kitLife TechnologiesA15960
Essential 8-FlexGibcoA2858501PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging systemLife TechnologiesAMEX1000
Fetal bovine serum - Premium SelectAtlanta BiologicalsS11150
FGF2Peprotech100-18B
GlutaMAX supplementGibco35050061L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient MixGibco11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubatorThermo Scientific50144906
Human Anti-EN2, mouseSanta Cruz Biotechnologysc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbitR&D SystemsMAB7617
Human anti-PTF1a, rabbitNovus BiologicalsNBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouseBiolegend801213
IMDMGibco12440053
InsulinGibco12585
Laminin Mouse ProteinGibco23017015
Matrigel MatrixCorning354234Basement membrane matrix
MEM-NEAAGibco11140050
Mini CentrifugeLabnet InternationalC1310Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg)New England BioLabsT2040Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep KitNew England BioLabsT2010Silica spin columns
N-2 supplementGibco17502-048
Neurobasal mediumGibco21103049
PBS, pH 7.4Gibco10010023
PFA 16%Electron Microscopy Sciences15710
Polyamine supplementSigmaP8483
Poly-L-Ornithine (PLO)Sigma3655
Potassium chlorideSigma746436
SB431542Sigma54317
See through self-sealable pouchesSterikingSS-T2 (90x250)Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate Fisher ScientificS279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm DiaResearch Products International256131
Trans-ISRIBCayman16258
TRIzol ReagentInvitrogen15596018Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x)Gibco12604039Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometerWescor, Inc.Model 5520Osmometer
Y-27632Biogems1293823

References

  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187 3D 2D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved