JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מסביר את יצירתו של מונולאייר דו-ממדי של תאי המוח הקטן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לחקר השלבים המוקדמים של התפתחות המוח הקטן.

Abstract

ההתפתחות המדויקת והמתוזמנת של המוח הקטן חיונית לא רק לתיאום ואיזון מוטורי מדויקים אלא גם לקוגניציה. בנוסף, הפרעה בהתפתחות המוח הקטן מעורבת בהפרעות נוירו-התפתחותיות רבות, כולל אוטיזם, הפרעת קשב וריכוז (ADHD) וסכיזופרניה. חקירות של התפתחות המוח הקטן בבני אדם התאפשרו בעבר רק באמצעות מחקרים שלאחר המוות או הדמיה מוחית, אך שיטות אלה אינן מספיקות להבנת השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים ב- vivo במהלך ההתפתחות המוקדמת, כאשר נוצרות הפרעות נוירו-התפתחותיות רבות. הופעתן של טכניקות ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) הנגרמים על ידי בני אדם מתאים סומטיים והיכולת להתמיין מחדש עוד יותר תאי גזע פלוריפוטנטיים לנוירונים סללו את הדרך למודלים חוץ-גופיים של התפתחות מוחית מוקדמת. המחקר הנוכחי מספק צעדים פשוטים לקראת יצירת תאים cerebellar עבור יישומים הדורשים מבנה חד-שכבתי דו-ממדי (2D). תאי Cerebellar המייצגים שלבי התפתחות מוקדמים נגזרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים באמצעות השלבים הבאים: ראשית, גופים עובריים מיוצרים בתרבית תלת-ממדית (3D), לאחר מכן הם מטופלים ב-FGF2 ובאינסולין כדי לקדם את מפרט הגורל של המוח הקטן, ולבסוף, הם מובחנים באופן סופי כמונו-שכבה על מצעים מצופים פולי-l-אורניתין (אש"ף)/למינין. לאחר 35 ימים של התמיינות, תרביות תאים צרבלריים שמקורם ב-iPSC מבטאות סמנים של המוח הקטן, כולל ATOH1, PTF1α, PAX6 ו-KIRREL2, מה שמרמז על כך שפרוטוקול זה יוצר מבשרי תאי צרבלר גלוטמטרגיים ו-GABAergic cerebellar, כמו גם אבות של תאי Purkinje. יתר על כן, התאים הממוינים מראים מורפולוגיה עצבית מובהקת והם חיוביים לסמנים אימונופלואורסצנטיים של זהות עצבית כגון TUBB3. תאים אלה מבטאים מולקולות הנחיה אקסונאליות, כולל סמפורין-4C, פלקסין-B2 ונוירופילין-1, ויכולים לשמש מודל לחקר המנגנונים המולקולריים של צמיחת נויריט וקישוריות סינפטית. שיטה זו יוצרת נוירונים במוח הקטן האנושי שימושיים עבור יישומים במורד הזרם, כולל ביטוי גנים, מחקרים פיזיולוגיים ומורפולוגיים הדורשים פורמטים חד-שכבתיים דו-ממדיים.

Introduction

הבנת התפתחות המוח הקטן האנושי וחלונות הזמן הקריטיים של תהליך זה חשובה לא רק לפענוח הגורמים האפשריים להפרעות נוירו-התפתחותיות, אלא גם לזיהוי מטרות חדשות להתערבות טיפולית. מידול התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה היה מאתגר, אך עם הזמן, פרוטוקולים רבים המבדילים בין תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) או iPSCs עם גורלות שושלת המוח הקטן התגלו 1,2,3,4,5,6,7,8 . יתר על כן, חשוב לפתח פרוטוקולים המניבים תוצאות הניתנות לשחזור, הם פשוטים יחסית (כדי להפחית טעויות), ואינם כבדים בעלויות כספיות.

הפרוטוקולים הראשונים להתמיינות המוח הקטן נוצרו מתרביות דו-ממדיות מגופים עובריים מצופים (EBs), מה שגרם לגורל המוח הקטן עם גורמי גדילה שונים הדומים להתפתחות in vivo, כולל WNT, BMPs ו-FGFs 1,9. פרוטוקולים שפורסמו לאחרונה גרמו להבחנה בעיקר בתרבית אורגנואידית תלת-ממדית עם FGF2 ואינסולין, ולאחר מכן FGF19 ו-SDF1 עבור מבנים דמויי שפתיים רומביים3,4, או השתמשו בשילוב של FGF2, FGF4 ו-FGF85. שתי שיטות האינדוקציה האורגנואידית של המוח הקטן הביאו לאורגנואידים תלת-ממדיים דומים של המוח הקטן, שכן שני הפרוטוקולים דיווחו על ביטוי דומה של סמן המוח הקטן בנקודות זמן זהות. הולמס והיינה הרחיבו את פרוטוקול 5 התלת-ממדישלהם כדי להראות שתאי המוח הקטן הדו-ממדיים יכולים להיווצר מתאי גזע עובריים ו-iPSCs, שמתחילים כאגרגטים תלת-ממדיים. בנוסף, Silva et al.7 הראו כי תאים המייצגים נוירונים בוגרים במוח הקטן בדו-ממד יכולים להיווצר בגישה דומה להולמס והיינה, תוך שימוש בנקודת זמן שונה למעבר מתלת-ממד לדו-ממד ולהארכת זמן הגדילה וההתבגרות.

הפרוטוקול הנוכחי גורם לגורל המוח הקטן ב-iPSCs נטולי הזנה על ידי יצירת גופים עובריים צפים חופשיים (EBs) באמצעות אינסולין ו-FGF2 ולאחר מכן ציפוי ה-EBs על כלים מצופים אש"ף/למינין ביום ה-14 לגדילה והתמיינות דו-ממדית. עד יום 35, תאים עם זהות cerebellar מתקבלים. היכולת לשחזר את השלבים המוקדמים של התפתחות המוח הקטן, במיוחד בסביבה דו-ממדית, מאפשרת לחוקרים לענות על שאלות ספציפיות הדורשות ניסויים עם מבנה חד-שכבתי. פרוטוקול זה מקובל גם על שינויים נוספים כגון משטחים מיקרו-מפוסלים, מבחני צמיחה אקסונאליים ומיון תאים כדי להעשיר את אוכלוסיות התאים הרצויות.

Protocol

המחקר בבני אדם אושר תחת אישור מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת איווה מספר 201805995 ואישור ועדת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים של אוניברסיטת איווה מספר 2017-02. ביופסיות עור התקבלו מהנבדקים לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב. הפיברובלסטים גודלו בתרבית ב-DMEM עם 15% סרום בקר עוברי (FBS) ותמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. פיברובלסטים תוכנתו מחדש באמצעות ערכת תכנות מחדש אפיזומלית בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראו טבלת חומרים) תוך שימוש בנוקלאופקטור לאלקטרופורציה. כל ההליכים בוצעו בארון בטיחות ביולוגי מסוג A2 מסוג II ("מכסה מנוע" בקיצור). כל אמצעי התקשורת של תרביות התאים היו נקיים מאנטיביוטיקה; לכן, כל רכיב שנכנס למכסה המנוע נוקה עם 70% אתנול. כל מדיות תרביות התאים ומרכיביהן סוננו באופן סטרילי או נפתחו במכסה המנוע כדי לשמור על סטריליותם.

1. הכנה ניסיונית

  1. הכינו לוחות מצופים מטריצת קרום מרתף (BMM).
    הערה: BMM מתמצק מהר יותר בטמפרטורות חמות יותר. יש להכין צלחות במהירות ובאופן מיידי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאחסון.
    1. הפשירו את ה-BMM (ראו טבלת חומרים) על קרח, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות, או למשך הלילה.
    2. יש לערבב DMEM/F12 ו-BMM עד לריכוז סופי של 80 מיקרוגרם/מ"ל. מפיצים את תמיסת ה-BMM במנות תרבית רקמה (1 מ"ל ל-35 מ"מ ו-2 מ"ל לכלים בקוטר 60 מ"מ) ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות או למשך הלילה לפני ציפוי התאים.
      הערה: ניתן לאחסן את הכלים שאינם בשימוש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים.
  2. הכינו לוחות מצופים פולי-L-אורניתין/למינין (אש"ף/למינין).
    1. הכינו 20 מיקרוגרם/מ"ל אש"ף (ראו טבלת חומרים) ב-DPBS+/+ סטרילי והוסיפו 1 מ"ל לכל באר של צלחת 6 בארות. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
    2. למחרת, שאפו את אש"ף עם שואב אבק ושטפו פעמיים עם DPBS+/+. יש לייבש את האוויר במכסה המנוע.
      הערה: ניתן לאחסן צלחות מיובשות באוויר בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים, עטופות בנייר אלומיניום, לשימוש עתידי.
    3. הכינו 10 מיקרוגרם/מ"ל למינין (ראו טבלת חומרים) ב-DPBS+/+ והוסיפו 1 מ"ל לכל באר של צלחת בת 6 בארות. דגירה לפחות במשך 3 שעות או לילה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
    4. שאפו את הלמינין עם שואב אבק והוסיפו 1 מ"ל של DPBS +/+ בינוני או סטרילי.
      הערה: אסור שציפוי הלמינין יתייבש. יש להוסיף PBS או מדיום תרבות מתאים באופן מיידי כדי למנוע זאת. צלחות מצופות ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך עד 2 שבועות.
  3. הכן פתרון העברת PSC.
    הערה: יש צורך באוסמומטר (ראה טבלת חומרים) כדי להפוך את פתרון העברת ה-PSCל-10.
    1. יש להמיס 11.49 גרם אשלגן כלורי (KCl) ו-0.147 גרם נתרן ציטראט דיהידראט (HOC(COONa)(CH 2 COONa)2*2H2O) ב-400 מ"ל של מים בדרגה של תרבית תאים סטרילית (ראו טבלת חומרים).
    2. מדוד את עוצמת הקול של התמיסה והקלט אותה כעוצמת הקול הראשונית (Vi).
    3. מדוד את האוסמולריות והתאם אותה ל-570 mOsm על ידי הוספת מים בדרגה של תרבית תאים סטרילית באמצעות הנוסחה Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
    4. לסנן-לעקר את התמיסה עם מסנן 0.20 מיקרומטר ולעשות 10 מ"ל aliquots. יש לאחסן את האליקוטים בטמפרטורת החדר (RT) למשך עד 6 חודשים.
  4. הכינו מדיום תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC).
    הערה: iPSCs נשמרים בתווך המכיל FGF2 יציב בחום (ראה טבלת חומרים), ומספקים לוח זמנים להזנה ללא סוף שבוע. מדיות PSC אחרות הזמינות מסחרית לא נוסו עבור פרוטוקול זה.
    1. להפשיר את התוסף הבינוני PSC בלילה ב 4 °C (64 °F).
    2. יש להוסיף תוסף של 10 מ"ל PSC בינוני ל-500 מ"ל של תוסף PSC בסיסי. הכינו 25 מ"ל ואחסנו בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן אליקוטים קפואים בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים. יש לאחסן אליקוטים מופשרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בהם תוך שבועיים. ניתן להקפיא תאים לאחסון לטווח ארוך במדיום PSC עם 10% (v/v) דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
  5. הכן מדיום הפשרה PSC.
    1. תוסף PSC בינוני עם כרומן 50 ננומטר, אמריקסאן 1.5 מיקרומטר, תוסף פוליאמין 1x וטרנס-ISRIB של 0.7 מיקרומטר (קוקטייל CEPT11) (ראו טבלת חומרים).
    2. סננו-עיקור באמצעות מסנן 0.20 מיקרומטר ואחסן ב-4 °C למשך עד 4 שבועות.
  6. הכינו פיפטות זכוכית משוכות.
    1. משכו פיפטות זכוכית בקוטר 22.9 ס"מ לשתי חתיכות מעל מבער בונזן, ~ 2 ס"מ מתחת לצוואר, ויצרו שתי פיפטות, כאשר הצד הדק יותר קצר ~ 4 ס"מ מהשני.
    2. בעזרת הלהבה, לכופף את הקצוות של הצד נמשך כדי ליצור "r" חלק.
    3. מניחים את הפיפטות המשוכות בשרוולים של אוטוקלאב ואוטוקלאב לעיקור.
  7. הכן מדיום הבחנה cerebellar (CDM).
    1. ערבבו את תערובת החומרים המזינים של IMDM ו-F12 ביחס של 1:1. הוסיפו את התערובת עם תוסף L-אלנין-L-L-גלוטמין אחד, תרכיז שומנים 1% (v/v) המוגדר כימית, 0.45 mM 1-thio-glycerol, 15 μL/mL apo-transferrin, אלבומין בסרום בקר (BSA) של 5 מ"ג/מ"ל ואינסולין של 7 מיקרוגרם/מ"ל (ראו טבלת חומרים).
    2. לסנן-לעקר עם מסנן 0.20 מיקרומטר, לאחסן ב 4 °C, ולהשתמש בתוך 1 חודש.
  8. הכן מדיום התבגרות המוח הקטן (CMM).
    1. תוסף נוירובסאל בינוני עם תוסף L-אלנין-L-L-גלוטמין אחד ותוסף N-2 אחד (ראו טבלת חומרים).
    2. לסנן-לעקר עם מסנן 0.20 מיקרומטר, לאחסן ב 4 °C, ולהשתמש בתוך 2 שבועות.

2. תרבות iPSC נטולת מזינים

  1. הפשירו את התאים הבאים לפי השלבים הבאים.
    1. הכניסו צלחת BMM (שלב 1.1) לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס כדי לג'ל לפחות שעה אחת או לילה לפני הפשרת התאים.
    2. חימום מראש של 10 מ"ל של PSC בינוני (שלב 1.5) ב-37 מעלות צלזיוס.
    3. להעביר את cryovial עם תאים מחנקן נוזלי לאמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: כדי למנוע יצירת מקור זיהום במרחב תרבית התאים, לא מומלץ להשתמש באמבט מים סטנדרטי. במקום זאת, ניתן לחמם מים מתוקים בכוס קטנה ל-37 מעלות צלזיוס כדי ליצור אמבט מים חד פעמי.
    4. כאשר נותרה חתיכת קרח קטנה בצינור, הוציאו אותה מאמבט המים, ייבשו את הצינור ורססו ב-70% אתנול. העבירו את הצינור למכסה המנוע והשתמשו בפיפטה סרולוגית של 2 מ"ל או 5 מ"ל (ראו טבלת חומרים) כדי להעביר בעדינות את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    5. הוסיפו 8 מ"ל של מדיום הפשרת PSC לתאים תוך כדי סיבוב הצינור החרוטי. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
    6. שאפו בזהירות את הסופרנטנט עם שואב ואקום מבלי להפריע לכדור התא. יש לתלות את התאים ב-2 מ"ל של מדיום הפשרת PSC.
    7. שאפו את ה-BMM מהצלחת והוסיפו את התאים המחודשים בכל הצלחת לחלוקה שווה.
    8. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. רעננו את המדיום למחרת עם PSC medium. לאחר מכן, לשנות את המדיום מדי יום.
  2. שמור על התאים בהתאם לשלבים הבאים.
    1. יש לחמם מראש את הנפח הדרוש של מדיום PSC ב-37°C (לדוגמה, 1 מ"ל בינוני לכל צלחת 35 מ"מ).
    2. לחקור את הלוחות עבור תאים מובחנים או מושבות ולהסיר את התאים הממוינים עם פיפטה זכוכית משוכה (שלב 1.6).
      הערה: למושבות iPSC יש קצוות חלקים עם תאים זהים מבחינה מורפולוגית.
    3. שנה את המדיום בילה מדי יום ואת המעבר כל 3-4 ימים או כאשר 70% מפגש הוא הגיע.
  3. מעבירים את התאים.
    1. הכניסו את הכמות הדרושה של צלחות BMM לתוך אינקובטור לפחות 1 שעה או לילה לפני המעבר. מחממים מראש את הכמות הדרושה של PSC בינוני (שלב 1.3) ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. באמצעות פיפטה מזכוכית משוכה, נקו את כל התאים או המושבות הממוינים.
    3. שאפו את המדיום המושקע עם שואף ואקום והוסיפו מדיום דיסוציאציה PSC, 1 מ"ל לכל צלחת 35 מ"מ. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 דקות.
      הערה: אם מושבות מתרוממות בתמיסת המעבר של PSC לפני הוספת מדיום PSC, ניתן לקצר את זמן הדגירה.
    4. שאפו את פתרון העברת ה-PSC והוסיפו מדיום PSC שחומם מראש.
    5. באמצעות קצה פיפטה סטרילי של 200 μL, קווי גירוד מקבילים זה לזה בכיוון אחד, מסובבים את הלוח ב-90°, ויוצרים קבוצה שנייה של קווי שריטה בניצב לקודמיהם (יצירת תבנית צולבת לרוחב הצלחת).
    6. שאפו את תמיסת ה- BMM מלוחות הסט. לאסוף את המושבות באמצעות פיפטה סרולוגית ולהפיץ אותם ללוחות BMM חדשים.
    7. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. שנה את המדיום מדי יום.
  4. הקפיאו את התאים.
    1. הכינו קריוביאלים על ידי סימון התכולה ועקרו תחת אור אולטרה סגול (UV) במכסה המנוע (ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות.
    2. הכינו את מדיום הקפאת PSC על ידי הוספת תוסף PSC בינוני עם 10% (v/v) DMSO. בצע את השלבים 2.3.2-2.3.5.
    3. העבר את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל עם פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 200 x g למשך 5 דקות ב- RT.
    4. שאפו בזהירות את המדיום והחזירו את גלולת התא במדיום הקפאת PSC.
    5. להפיץ לתוך cryovials. מכניסים את הבקבוקונים למיכל הקפאה ומניחים את המיכל במקפיא של −80 מעלות צלזיוס.
    6. למחרת, העבירו את הקריביאלים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

3. הבחנה Cerebellar

הערה: לפני תחילת ההבחנה, iPSCs מועברים לשש מנות בקוטר 35 מ"מ ומוכנים להבחנה כאשר הם נמצאים במפגש של 70%. כל צלחת 35 מ"מ תועבר לבאר אחת של צלחת 6 בארות.

  1. ביום 0, הרימו את מושבות ה-iPSC הבריאות להיווצרות EB.
    1. הוסף 1 מ"ל של CDM (שלב 1.7) בתוספת 10 μM Y-27632 ו- 10 μM SB431542 (ראה טבלת חומרים) לכל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד (ULA) של 6 בארות והנח באינקובטור עד שהמושבות המורמות מוכנות להוספה לבארות.
    2. נקו את התאים הממוינים באמצעות פיפטה מזכוכית משוכה. שאפו את המדיום והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת PSC עבור כל צלחת 35 מ"מ. דגירה במשך 3 דקות ב 37 °C, לשאוף, ולהוסיף 2 מ"ל של CDM בתוספת 10 μM Y-27632 ו 10 μM SB431542.
      הערה: אם מושבות מתרוממות בתמיסת המעבר של PSC לפני הוספת CDM, ניתן לקצר את זמן הדגירה.
    3. תחת מיקרוסקופ הפוך של אור מועבר, הרימו בעדינות את המושבות באמצעות הקצה הכפוף של פיפטה הזכוכית המשוכה באמצעות הגדלה של פי 4. לאחר הרמת כל מושבה, העבירו בעדינות את כולם לבאר אחת של צלחת ULA בעלת 6 בארות באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. חזור על תהליך זה עבור כל צלחת iPSC. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
      הערה: אם המושבות גדולות מדי או ממוזגות, ניתן לפרוס אותן עם קצה פיפטה הזכוכית הנמשכת כדי ליצור EBs קטנים יותר.
  2. ביום השני, יש להוסיף FGF2 לכל באר עד לריכוז סופי של 50 ננוגרם/מ"ל.
    הערה: ה-FGF2 המשמש להבחנה במוח הקטן אינו יציב בחום. פרוטוקול זה לא נבדק עם FGF2 יציב בחום.
  3. ביום 7, בצע שינוי בינוני של 1/3. עבור 3 מ"ל של בינוני כולל בבאר, עם פיפטור 1,000 μL, בעדינות לשאוף 1 מ"ל של בינוני בילה ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של CDM טרי. דגירה של EBs במשך 7 ימים.
  4. ביום ה-14, שאפו בעדינות כמעט את כל המדיום המושקע באמצעות פיפטור של 1,000 μL. כדי להבטיח נזק מינימלי ל-EBs, סובבו את הצלחת כדי לאסוף את כל ה-EBs במרכז הצלחת, ולאחר מכן הטו את הצלחת ושאפו באיטיות מהקצה.
    1. ככל שהכמות הבינונית פוחתת, הניחו לאט לאט את הצלחת שטוחה והמשיכו לשאוף. יש להשאיר כמות מספקת של מדיום כדי למנוע ייבוש של ה-EBs. לאחר מכן, יש להוסיף 3 מ"ל של CDM טרי בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632. מעבירים את ה-EBs באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל לצלחת מצופה אש"ף/למינין (שלב 1.2).
      הערה: בהתאם ליישום במורד הזרם, ניתן להעביר את ה-EBs לצלחת PLO/laminin בעלת 6 בארות או EBs בודדים יכולים להיות מועברים לבאר אחת של צלחת או כיסוי מצופים של אש"ף/למינין.
  5. ביום ה -15, שאף את המדיום והחלף אותו ב- CDM טרי.
    הערה: חשוב להוסיף מספיק מדיום לבארות כדי להבטיח מספיק בינוניות בין האכלות, שכן עם הזמן יהיה אידוי (למשל, עבור באר בצלחת של 6 בארות, להוסיף 3 מ"ל של בינוני). אם המדיום התחיל להתחמצן (להפוך ברור וצהוב), רענן את המדיום גם אם הוא לא נמצא בלוח הזמנים של ההזנה עד סוף הפרוטוקול.
  6. ביום 21, לשאוף את המדיום בילה ולהחליף אותו עם CMM. ביום 28, החלף את המדיום עם CMM טרי. ביום ה-35, קצרו את התאים ליישומים נוספים.

4. הכנת דגימה לבידוד RNA

  1. שאפו את המדיום והוסיפו 500 μL של מגיב דיסוציאציה של תאים (ראו טבלת חומרים) לכל באר של צלחת 6 בארות. השאירו אותו דולק לכמה שניות ושאפו.
  2. לדגור את הצלחת, עם המכסה על, בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות. הקישו על דפנות הלוח כדי לנתק את התאים.
  3. הוסף 1 מ"ל של CMM (שלב 1.8) ואסוף את התאים לתוך צינור 1.5 מ"ל.
  4. גלולו את התאים על ידי צנטריפוגה באמצעות צנטריפוגה קטנה (ראו טבלת חומרים) במשך 30 שניות ב-RT (מהירות מרבית 2000 x גרם), השליכו את המדיום והוסיפו 1 מ"ל של 1x PBS pH 7.4 כדי לשטוף את כדור התא.
  5. גלולו את התאים שוב באמצעות צנטריפוגה מיני ספסל למשך 30 שניות ב-RT ושטפו עם PBS פעם נוספת.
  6. גלולה את התאים והשליכו את ה- PBS. ליזה של התאים בפנול וגואנידין איזותיוציאנט המכילים ריאגנט (ראו טבלת חומרים).
    הערה: ניתן לאחסן תאים המכילים פנול וגואנידין איזותיוציאנט המכילים ריאגנט בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס למשך עד שנה. ניתן לתלות תאים ישירות בצלחת בהתאם לשיטת בידוד ה-RNA והריאגנטים שבהם נעשה שימוש. בשל המספר הנמוך של תאים בצלחת, בידוד RNA באמצעות עמודות ספין סיליקה (ראו טבלת חומרים) יביא לתפוקות גבוהות יותר של RNA.

5. הכנת תאים להכתמה אימונופלואורסצנטית

הערה: עבור צלחת של 24 בארות, EB אחד לכל באר מספיק.

  1. ביום ה-35, שאפו את המדיום המושקע ושטפו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של DPBS+/+ לכל באר (לבאר אחת מתוך צלחת של 24 בארות).
  2. שאפו את ה-DPBS+/+ והוסיפו 500 מיקרון של פרפורמלדהיד קר 4% (PFA, ראו טבלת חומרים) שהוכנו ב-DPBS+/+ לכל באר. דגירה במשך 20 דקות ב- RT.
  3. יש להסיר 4% PFA ולשטוף את התאים פעמיים באמצעות DPBS+/+, כמו בשלב 5.1. יש להוסיף 1 מ"ל של DPBS+/+ ולאחסן את התאים בטמפרטורה של 4°C עד לסיום ההכתמה.
    הערה: מומלץ לבצע צביעה אימונופלואורסצנטית תוך שבוע לאחר הקיבוע כדי למנוע ניתוק תאים ואובדן אנטיגנים. עם זאת, בהתאם לנוגדן ולמיקום הסלולרי של המטרה, צביעה יכולה להיעשות בזמנים מאוחרים יותר עד 4 שבועות לאחר קיבוע.

תוצאות

סקירה כללית של ההבחנה בין המוח הקטן מתלת-ממד לדו-ממד
תאים Cerebellar נוצרים החל מ- iPSCs. איור 1A מציג את זרימת העבודה הכוללת ואת התוספת של רכיבים עיקריים לבידול. ביום 0, EBs מיוצרים על-ידי הרמה עדינה של מושבות iPSC (איור 1B) באמצעות פיפטה מזכוכית משוכה ב-CDM המכיל?...

Discussion

היכולת למדל את התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה חשובה למידול מחלות, כמו גם לקידום ההבנה של התפתחות מוחית תקינה. פרוטוקולים פחות מסובכים וחסכוניים יוצרים יותר הזדמנויות ליצירת נתונים הניתנים לשכפול וליישום נרחב במעבדות מדעיות מרובות. פרוטוקול הבחנה של המוח הקטן מתואר כאן באמצעות שיט?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

אנו מודים לג'ני גרינגר ריצ'רדס על עבודתה היסודית באימות נושאי הבקרה שלנו, שמהם יצרנו את ה- iPSCs של הבקרה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH T32 MH019113 (ל- D.A.M. ו- K.A.K.), קרן נלי בול (ל- T.H.W. ו- A.J.W.), NIH R01 MH111578 (ל- V.A.M. ו- J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (ל- A.J.W.), וקרן הצדקה רוי ג'יי קארבר (ל- V.A.M., J.A.W. ו- A.J.W.). הדמויות נוצרו עם BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Serological pipetteFisher Scientific13-678-26D
1-thio-glycerolSigmaM6145
2 mL Serological pipetteFisher Scientific13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm DiaFisher ScientificFB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture DishFalcon353001
4D Nucleofector core unitLonza276885Nucleofector
5 mL Serological pipetteFisher Scientific13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture DishFalcon353004
6-well ultra-low attachment platesCorning3471
9" Disposable Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-20D
Apo-transferrinSigmaT1147
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA9418
Cell culture grade waterCytivaSH30529.02
Chemically defined lipid concentrateGibco11905031
Chroman 1Cayman34681
Class II, Type A2, Biological safety CabinetNuAire, Inc.NU-540-600Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treatedCorning3526
Costar 6-well plate, TC treatedCorning3516
DAPI solutionThermo Scientific62248
DMEMGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide)SigmaD2438
DPBS+/+Gibco14040133
EmricasanCayman22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kitLife TechnologiesA15960
Essential 8-FlexGibcoA2858501PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging systemLife TechnologiesAMEX1000
Fetal bovine serum - Premium SelectAtlanta BiologicalsS11150
FGF2Peprotech100-18B
GlutaMAX supplementGibco35050061L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient MixGibco11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubatorThermo Scientific50144906
Human Anti-EN2, mouseSanta Cruz Biotechnologysc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbitR&D SystemsMAB7617
Human anti-PTF1a, rabbitNovus BiologicalsNBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouseBiolegend801213
IMDMGibco12440053
InsulinGibco12585
Laminin Mouse ProteinGibco23017015
Matrigel MatrixCorning354234Basement membrane matrix
MEM-NEAAGibco11140050
Mini CentrifugeLabnet InternationalC1310Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg)New England BioLabsT2040Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep KitNew England BioLabsT2010Silica spin columns
N-2 supplementGibco17502-048
Neurobasal mediumGibco21103049
PBS, pH 7.4Gibco10010023
PFA 16%Electron Microscopy Sciences15710
Polyamine supplementSigmaP8483
Poly-L-Ornithine (PLO)Sigma3655
Potassium chlorideSigma746436
SB431542Sigma54317
See through self-sealable pouchesSterikingSS-T2 (90x250)Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate Fisher ScientificS279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm DiaResearch Products International256131
Trans-ISRIBCayman16258
TRIzol ReagentInvitrogen15596018Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x)Gibco12604039Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometerWescor, Inc.Model 5520Osmometer
Y-27632Biogems1293823

References

  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1873D 2D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved