Моделирование развития мозжечка человека in vitro в 2D структуре

Резюме

Настоящий протокол объясняет генерацию 2D-монослоя мозжечковых клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для исследования ранних стадий развития мозжечка.

Аннотация

Точное и своевременное развитие мозжечка имеет решающее значение не только для точной координации и равновесия движений, но и для познания. Кроме того, нарушение развития мозжечка было связано со многими расстройствами нервного развития, включая аутизм, синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) и шизофрению. Исследования развития мозжечка у людей ранее были возможны только с помощью посмертных исследований или нейровизуализации, но этих методов недостаточно для понимания молекулярных и клеточных изменений, происходящих in vivo во время раннего развития, когда возникают многие нарушения нервного развития. Появление методов генерации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из соматических клеток и способность к дальнейшей редифференцировке иПСК в нейроны проложили путь для моделирования in vitro раннего развития мозга. Настоящее исследование предлагает упрощенные шаги к созданию мозжечковых клеток для приложений, требующих 2-мерной (2D) монослойной структуры. Мозжечковые клетки, представляющие ранние стадии развития, получают из человеческих ИПСК с помощью следующих этапов: сначала эмбриоидные тела создаются в 3-мерной (3D) культуре, затем их обрабатывают FGF2 и инсулином для содействия спецификации мозжечковой судьбы, и, наконец, они терминально дифференцируются как монослой на поли-l-орнитиновых (PLO) / ламининовых субстратах. Через 35 дней дифференцировки культуры мозжечковых клеток, полученные из iPSC, экспрессируют мозжечковые маркеры, включая ATOH1, PTF1α, PAX6 и KIRREL2, предполагая, что этот протокол генерирует глутаматергические и ГАМКергические предшественники мозжечковых нейронов, а также предшественников клеток Пуркинье. Кроме того, дифференцированные клетки демонстрируют отчетливую морфологию нейронов и являются положительными для иммунофлуоресцентных маркеров нейронной идентичности, таких как TUBB3. Эти клетки экспрессируют аксональные направляющие молекулы, включая семафорин-4C, плексин-B2 и нейропилин-1, и могут служить моделью для исследования молекулярных механизмов роста нейритов и синаптической связности. Этот метод генерирует мозжечковые нейроны человека, полезные для последующих применений, включая экспрессию генов, физиологические и морфологические исследования, требующие 2D-монослойных форматов.

Введение

Понимание развития мозжечка человека и критических временных окон этого процесса важно не только для расшифровки возможных причин нарушений развития нервной системы, но и для выявления новых целей терапевтического вмешательства. Моделирование развития мозжечка человека in vitro было сложной задачей, но со временем появилось множество протоколов, дифференцирующих человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) или IPSCs с судьбами мозжечковой линии^{, 1,2,3,4,5,6,7,8}

протокол

Исследование на людях было одобрено в соответствии с номером одобрения Совета по институциональному обзору Университета Айовы 201805995 и номером одобрения Комитета по плюрипотентным стволовым клеткам человека Университета Айовы 2017-02. Биопсия кожи была получена от испытуемых после получения письменного информированного согласия. Фибробласты культивировали в ДМЭМ с 15% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% раствором MEM-заменимых аминокислот при 37 °C и 5% CO₂. Фибробласты перепрограммировались с использованием набора эписомального перепрограммирования в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов) с использованием ну....

Результаты

Обзор дифференциации мозжечка от 3D до 2D
Мозжечковые клетки генерируются начиная с иПСК. На рисунке 1А показан общий рабочий процесс и добавление основных компонентов для дифференциации. На 0-й день ЭБ производятся путем осторожного подъема колоний iPSC (

Обсуждение

Способность моделировать развитие мозжечка человека in vitro важна для моделирования заболеваний, а также для дальнейшего понимания нормального развития мозга. Менее сложные и экономичные протоколы создают больше возможностей для генерации реплицируемых данных и широкого внедрен?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Serological pipette	Fisher Scientific	13-678-26D
1-thio-glycerol	Sigma	M6145
2 mL Serological pipette	Fisher Scientific	13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia	Fisher Scientific	FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish	Falcon	353001
4D Nucleofector core unit	Lonza	276885	Nucleofector
5 mL Serological pipette	Fisher Scientific	13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish	Falcon	353004
6-well ultra-low attachment plates	Corning	3471
9" Disposable Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-20D
Apo-transferrin	Sigma	T1147
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9418
Cell culture grade water	Cytiva	SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate	Gibco	11905031
Chroman 1	Cayman	34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet	NuAire, Inc.	NU-540-600	Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated	Corning	3526
Costar 6-well plate, TC treated	Corning	3516
DAPI solution	Thermo Scientific	62248
DMEM	Gibco	11965092
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide)	Sigma	D2438
DPBS+/+	Gibco	14040133
Emricasan	Cayman	22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit	Life Technologies	A15960
Essential 8-Flex	Gibco	A2858501	PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system	Life Technologies	AMEX1000
Fetal bovine serum - Premium Select	Atlanta Biologicals	S11150
FGF2	Peprotech	100-18B
GlutaMAX supplement	Gibco	35050061	L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix	Gibco	11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific	50144906
Human Anti-EN2, mouse	Santa Cruz Biotechnology	sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit	R&D Systems	MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit	Novus Biologicals	NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse	Biolegend	801213
IMDM	Gibco	12440053
Insulin	Gibco	12585
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017015
Matrigel Matrix	Corning	354234	Basement membrane matrix
MEM-NEAA	Gibco	11140050
Mini Centrifuge	Labnet International	C1310	Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg)	New England BioLabs	T2040	Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit	New England BioLabs	T2010	Silica spin columns
N-2 supplement	Gibco	17502-048
Neurobasal medium	Gibco	21103049
PBS, pH 7.4	Gibco	10010023
PFA 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Polyamine supplement	Sigma	P8483
Poly-L-Ornithine (PLO)	Sigma	3655
Potassium chloride	Sigma	746436
SB431542	Sigma	54317
See through self-sealable pouches	Steriking	SS-T2 (90x250)	Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate	Fisher Scientific	S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia	Research Products International	256131
Trans-ISRIB	Cayman	16258
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596018	Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x)	Gibco	12604039	Cell dissociation reagent
Vapor pressure osmometer	Wescor, Inc.	Model 5520	Osmometer
Y-27632	Biogems	1293823