JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол объясняет генерацию 2D-монослоя мозжечковых клеток из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для исследования ранних стадий развития мозжечка.

Аннотация

Точное и своевременное развитие мозжечка имеет решающее значение не только для точной координации и равновесия движений, но и для познания. Кроме того, нарушение развития мозжечка было связано со многими расстройствами нервного развития, включая аутизм, синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ) и шизофрению. Исследования развития мозжечка у людей ранее были возможны только с помощью посмертных исследований или нейровизуализации, но этих методов недостаточно для понимания молекулярных и клеточных изменений, происходящих in vivo во время раннего развития, когда возникают многие нарушения нервного развития. Появление методов генерации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из соматических клеток и способность к дальнейшей редифференцировке иПСК в нейроны проложили путь для моделирования in vitro раннего развития мозга. Настоящее исследование предлагает упрощенные шаги к созданию мозжечковых клеток для приложений, требующих 2-мерной (2D) монослойной структуры. Мозжечковые клетки, представляющие ранние стадии развития, получают из человеческих ИПСК с помощью следующих этапов: сначала эмбриоидные тела создаются в 3-мерной (3D) культуре, затем их обрабатывают FGF2 и инсулином для содействия спецификации мозжечковой судьбы, и, наконец, они терминально дифференцируются как монослой на поли-l-орнитиновых (PLO) / ламининовых субстратах. Через 35 дней дифференцировки культуры мозжечковых клеток, полученные из iPSC, экспрессируют мозжечковые маркеры, включая ATOH1, PTF1α, PAX6 и KIRREL2, предполагая, что этот протокол генерирует глутаматергические и ГАМКергические предшественники мозжечковых нейронов, а также предшественников клеток Пуркинье. Кроме того, дифференцированные клетки демонстрируют отчетливую морфологию нейронов и являются положительными для иммунофлуоресцентных маркеров нейронной идентичности, таких как TUBB3. Эти клетки экспрессируют аксональные направляющие молекулы, включая семафорин-4C, плексин-B2 и нейропилин-1, и могут служить моделью для исследования молекулярных механизмов роста нейритов и синаптической связности. Этот метод генерирует мозжечковые нейроны человека, полезные для последующих применений, включая экспрессию генов, физиологические и морфологические исследования, требующие 2D-монослойных форматов.

Введение

Понимание развития мозжечка человека и критических временных окон этого процесса важно не только для расшифровки возможных причин нарушений развития нервной системы, но и для выявления новых целей терапевтического вмешательства. Моделирование развития мозжечка человека in vitro было сложной задачей, но со временем появилось множество протоколов, дифференцирующих человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) или IPSCs с судьбами мозжечковой линии, 1,2,3,4,5,6,7,8 . Кроме того, важно разработать протоколы, которые генерируют воспроизводимые результаты, относительно просты (для уменьшения ошибок) и не являются тяжелыми для денежных затрат.

Первые протоколы дифференцировки мозжечка были сгенерированы из 2D-культур из покрытых эмбриоидных тел (ЭБ), вызывая судьбу мозжечка с различными факторами роста, аналогичными развитию in vivo, включая WNT, BMP и FGF 1,9. Более поздние опубликованные протоколы индуцировали дифференцировку в основном в 3D органоидной культуре с FGF2 и инсулином, за которыми следовали FGF19 и SDF1 для ромбических губоподобных структур 3,4, или использовали комбинацию FGF2, FGF4 и FGF85. Оба метода индукции мозжечковых органоидов привели к получению аналогичных 3D-органоидов мозжечка, поскольку оба протокола сообщали о сходной экспрессии мозжечковых маркеров в одинаковые моменты времени. Холмс и Гейне расширили свой 3D-протокол5, чтобы показать, что 2D-мозжечковые клетки могут быть сгенерированы из hESCs и iPSCs, которые начинаются как 3D-агрегаты. Кроме того, Silva et al.7 продемонстрировали, что клетки, представляющие зрелые мозжечковые нейроны в 2D, могут быть сгенерированы с помощью аналогичного подхода Холмса и Гейне, используя другую точку времени для переключения с 3D на 2D и продления времени роста и созревания.

Текущий протокол индуцирует мозжечковую судьбу в IPSC без кормушек путем генерации свободно плавающих эмбриональных тел (ЭБ) с использованием инсулина и FGF2, а затем покрытия ЭБ на посуде с покрытием PLO / ламинином на 14-й день для 2D-роста и дифференцировки. К 35 дню получают клетки с мозжечковой идентичностью. Способность повторять ранние стадии развития мозжечка, особенно в 2D-среде, позволяет исследователям отвечать на конкретные вопросы, требующие экспериментов с однослойной структурой. Этот протокол также поддается дальнейшим модификациям, таким как микроструктурированные поверхности, анализы аксонального роста и сортировка клеток для обогащения желаемых клеточных популяций.

протокол

Исследование на людях было одобрено в соответствии с номером одобрения Совета по институциональному обзору Университета Айовы 201805995 и номером одобрения Комитета по плюрипотентным стволовым клеткам человека Университета Айовы 2017-02. Биопсия кожи была получена от испытуемых после получения письменного информированного согласия. Фибробласты культивировали в ДМЭМ с 15% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% раствором MEM-заменимых аминокислот при 37 °C и 5% CO2. Фибробласты перепрограммировались с использованием набора эписомального перепрограммирования в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов) с использованием нуклеофектора для электропорации. Все процедуры проводились в шкафу биологической безопасности класса II типа А2 («капюшон» для краткости). Все клеточные культуральные среды не содержали антибиотиков; поэтому каждый компонент, попавший в вытяжку, очищался 70% этанолом. Все клеточные питательные среды и компоненты были стерильно отфильтрованы или открыты в вытяжке для поддержания их стерильности.

1. Экспериментальная подготовка

  1. Подготовьте пластины с покрытием базальной мембранной матрицы (BMM).
    ПРИМЕЧАНИЕ: BMM затвердевает быстрее при более высоких температурах. Пластины должны быть быстро подготовлены и немедленно помещены при температуре 4 °C для хранения.
    1. Разморозить БММ (см. Таблицу материалов) на льду при 4 °C в течение не менее 2 ч или на ночь.
    2. Смешайте DMEM/F12 и BMM до конечной концентрации 80 мкг/мл. Распределить раствор БММ в посуде для культивирования тканей (1 мл на 35 мм и 2 мл на посуду по 60 мм) и инкубировать при 37°С в течение не менее 1 ч или на ночь перед покрытием клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неиспользованная посуда может храниться при температуре 4 °C в течение 2 недель.
  2. Приготовьте пластины с поли-L-орнитиновым/ламининовым (PLO/ламининовым) покрытием.
    1. Приготовьте 20 мкг/мл PLO (см. Таблицу материалов) в стерильном DPBS+/+ и добавьте 1 мл в каждую лунку 6-луночной пластины. Инкубировать на ночь при 37 °C в инкубаторе.
    2. На следующий день аспирируйте PLO вакуумным аспиратором и дважды помойте DPBS+/+. Воздух сухой в вытяжке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные на воздухе пластины можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель, завернув в алюминиевую фольгу, для будущего использования.
    3. Приготовьте 10 мкг/мл ламинина (см. Таблицу материалов) в DPBS+/+ и добавьте по 1 мл в каждую лунку 6-луночной пластины. Инкубировать не менее 3 ч или на ночь при 37 °C в инкубаторе.
    4. Аспирировать ламинин вакуумным аспиратором и добавить либо 1 мл среднего, либо стерильного DPBS+/+.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ламининовое покрытие не должно высыхать. PBS или соответствующая культуральная среда должны быть немедленно добавлены, чтобы предотвратить это. Пластины с покрытием можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
  3. Подготовьте раствор для пассажа PSC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для изготовления раствора 10 PSC требуется осмометр (см. Таблицу материалов).
    1. Растворить 11,49 г хлорида калия (KCl) и 0,147 г дигидрата цитрата натрия (HOC(COONa)(CH2COONa)2*2H2O) в 400 мл стерильной воды для культивирования клеток (см. Таблицу материалов).
    2. Измерьте объем раствора и запишите его как начальный объем (Vi).
    3. Измерьте осмолярность и отрегулируйте ее до 570 мОсм, добавив стерильную воду для культивирования клеток с использованием формулы Vi × Oi = Vf × 570 мОсм.
    4. Фильтруют-стерилизуют раствор фильтром 0,20 мкм и делают аликвоты по 10 мл. Храните аликвоты при комнатной температуре (РТ) до 6 месяцев.
  4. Готовят плюрипотентную среду стволовых клеток (ПСК).
    ПРИМЕЧАНИЕ: ИПСК поддерживаются в среде, содержащей термостабильный FGF2 (см. Таблицу материалов), обеспечивая график кормления без выходных. Другие коммерчески доступные носители PSC не были опробованы для этого протокола.
    1. Разморозьте добавку PSC medium в течение ночи при 4 °C.
    2. Добавьте 10 мл добавки среды PSC к 500 мл базальной среды PSC. Сделайте аликвоты по 25 мл и храните при −20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные аликвоты можно хранить при −20 °C в течение 6 месяцев. Размороженные аликвоты необходимо хранить при температуре 4 °C и использовать в течение 2 недель. Клетки могут быть заморожены для длительного хранения в среде PSC с 10% (v/v) диметилсульфоксидом (DMSO).
  5. Подготовьте Таяние среды PSC.
    1. Добавка среды PSC с 50 нМ хромана, 1,5 мкМ эмриказана, 1x полиаминовой добавки и 0,7 мкМ транс-ISRIB (коктейль CEPT11) (см. Таблицу материалов).
    2. Фильтруют-стерилизуют фильтром 0,20 мкм и хранят при 4 °C до 4 недель.
  6. Приготовьте вытянутые стеклянные пипетки.
    1. Потяните стеклянные пипетки Пастера размером 22,9 см (9 дюймов) на две части над горелкой Бунзена, ~ 2 см ниже шеи, создав две пипетки, причем более тонкая сторона будет ~ 4 см короче другой.
    2. С помощью пламени согните кончики вытянутой стороны, чтобы создать плавную «р».
    3. Поместите вытянутые пипетки в рукава автоклава и автоклав для стерилизации.
  7. Подготовьте мозжечковую дифференцирующую среду (CDM).
    1. Смешайте IMDM и питательную смесь F12 ветчины в соотношении 1:1. Дополните смесь 1x добавкой L-аланина-L-глутамина, 1% (v/v) химически определенного липидного концентрата, 0,45 мМ 1-тио-глицерина, 15 мкл/мл апо-трансферрина, 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 7 мкг/мл инсулина (см. Таблицу материалов).
    2. Фильтр-стерилизуют фильтром 0,20 мкм, хранят при 4 °C и используют в течение 1 месяца.
  8. Подготовьте мозжечковую среду созревания (КИМ).
    1. Дополнить нейробазальную среду 1x добавкой L-аланин-L-глутамина и 1x добавкой N-2 (см. Таблицу материалов).
    2. Фильтруют-стерилизуют фильтром 0,20 мкм, хранят при 4 °C и используют в течение 2 недель.

2. Культура iPSC без фидеров

  1. Разморозьте клетки, выполнив следующие действия.
    1. Поместите пластину BMM (стадия 1.1) в инкубатор при температуре 37 °C для геля в течение не менее 1 ч или на ночь перед размораживанием клеток.
    2. Предварительно прогреть 10 мл оттаивающей среды PSC (шаг 1,5) при 37 °C.
    3. Перенесите криовиаль с клетками из жидкого азота на водяную баню при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать создания источника загрязнения в пространстве клеточной культуры, использование стандартной водяной бани не рекомендуется. Вместо этого пресную воду можно нагревать в небольшом стакане до 37 ° C для создания одноразовой водяной бани.
    4. Когда в трубке останется небольшой кусочек льда, извлеките его из водяной бани, высушите трубку и опрыскайте 70% этанола. Перенесите трубку в капот и используйте серологическую пипетку 2 мл или 5 мл (см. Таблицу материалов), чтобы аккуратно перенести клетки в коническую трубку объемом 15 мл.
    5. Добавьте 8 мл размораживающей среды PSC к ячейкам по каплям, одновременно закручивая коническую трубку. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при РТ.
    6. Осторожно аспирируйте супернатант с помощью вакуумного аспиратора, не нарушая ячейку гранулы. Повторное суспендирование клеток в 2 мл оттаивающей среды PSC.
    7. Аспирируйте BMM с пластины и добавьте повторно суспендированные ячейки по каплям по всей пластине для равномерного распределения.
    8. Поместите пластину в инкубатор при 37 °C, 5% CO2. Обновите носитель на следующий день с помощью PSC medium. После этого меняйте среду ежедневно.
  2. Сохраните ячейки, выполнив следующие действия.
    1. Предварительно нагрейте необходимый объем среды PSC при 37 °C (например, 1 мл среды на пластину 35 мм).
    2. Исследуйте пластины для дифференцированных клеток или колоний и удалите дифференцированные клетки с помощью вытянутой стеклянной пипетки (шаг 1.6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: колонии iPSC имеют гладкие края с морфологически идентичными клетками.
    3. Меняйте израсходованный средний суточный и проход каждые 3-4 дня или при достижении 70% слияния.
  3. Прохождение клеток.
    1. Поместите необходимое количество пластин BMM в инкубатор не менее чем на 1 ч или на ночь перед пассажированием. Предварительно прогрейте необходимое количество среды PSC (стадия 1.3) при 37 °C.
    2. Используя вытянутую стеклянную пипетку, очистите любые дифференцированные клетки или колонии.
    3. Аспирировать отработанную среду вакуумным аспиратором и добавить среду диссоциации ПСК, 1 мл на тарелку 35 мм. Инкубировать при 37 °C в течение 1-3 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если колонии взлетают в растворе пропускания PSC перед добавлением среды PSC, время инкубации может быть сокращено.
    4. Аспирируйте раствор для пассирования PSC и добавьте предварительно нагретую среду PSC.
    5. Используя стерильный наконечник пипетки объемом 200 мкл, поцарапайте параллельные друг другу линии в одном направлении, поверните пластину на 90° и сделайте второй набор линий царапин перпендикулярно предыдущим (делая перекрестно заштрихованный узор поперек пластины).
    6. Аспирируйте раствор BMM из установленных пластин. Соберите колонии с помощью серологической пипетки и распределите их по новым пластинам BMM.
    7. Инкубировать при 37 °C, 5% CO2. Меняйте среду ежедневно.
  4. Заморозьте клетки.
    1. Приготовьте криовиалы, маркируя содержимое, и стерилизуйте под ультрафиолетовым (УФ) светом в вытяжке (см. Таблицу материалов) в течение 30 минут.
    2. Приготовьте замораживающую среду PSC, добавив 10% (v/v) DMSO. Выполните шаги 2.3.2-2.3.5.
    3. Переведите клетки в коническую трубку объемом 15 мл с серологической пипеткой 5 мл и центрифугой при 200 х г в течение 5 мин при РТ.
    4. Осторожно аспирируйте среду и повторно суспендируйте ячейку гранулы в морозильной среде PSC.
    5. Распределите по криовиалам. Поместите флаконы в морозильную емкость и поместите контейнер в морозильную камеру с температурой −80 °C.
    6. На следующий день переведите криовиалы в жидкий азот для длительного хранения.

3. Дифференциация мозжечка

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом дифференциации иПСК проходят к шести 35-миллиметровым тарелкам и готовы к дифференциации, когда они находятся при 70% слиянии. Каждая 35-миллиметровая плита будет перенесена в одну скважину из 6-луночного листа.

  1. На 0-й день поднимите здоровые колонии iPSC для образования EB.
    1. Добавить 1 мл CDM (стадия 1.7), дополненную 10 мкМ Y-27632 и 10 мкМ SB431542 (см. Таблицу материалов) в каждую скважину из 6-луночной пластины сверхнизкого прикрепления (ULA), и поместить в инкубатор до тех пор, пока поднятые колонии не будут готовы к добавлению в скважины.
    2. Очистите дифференцированные клетки с помощью вытянутой стеклянной пипетки. Аспирировать среду и добавить 1 мл раствора PSC для прохождения на каждую посуду размером 35 мм. Инкубировать в течение 3 мин при 37 °C, аспирировать и добавлять 2 мл CDM, дополненных 10 мкМ Y-27632 и 10 мкМ SB431542.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если колонии взлетают в растворе PSC перед добавлением CDM, время инкубации может быть сокращено.
    3. Под перевернутым микроскопом, проходящим светом, осторожно поднимите колонии, используя изогнутый край вытянутой стеклянной пипетки, используя 4-кратное увеличение. Как только каждая колония будет поднята, аккуратно переложите все в один колодец 6-луночной пластины ULA, используя серологическую пипетку объемом 10 мл. Повторите этот процесс для каждой пластины iPSC. Инкубируют клетки при 37 °C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если колонии слишком велики или объединены, их можно нарезать кончиком вытянутой стеклянной пипетки, чтобы создать меньшие ЭБ.
  2. На 2-й день добавьте FGF2 в каждую лунку до конечной концентрации 50 нг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: FGF2, используемый для дифференциации мозжечка, не является термостабильным. Этот протокол не был протестирован с термостабильным FGF2.
  3. На 7 день сделайте 1/3 среднего изменения. Для 3 мл общей среды в скважине с пипетром 1000 мкл осторожно аспирировать 1 мл отработанной среды и заменить ее 1 мл свежего CDM. Инкубируйте ЭБ в течение 7 дней.
  4. На 14-й день осторожно аспирируйте почти всю отработанную среду, используя пипеттор объемом 1000 мкл. Чтобы обеспечить минимальное повреждение ЭБ, закрутите пластину, чтобы собрать все ЭБ в центре пластины, а затем наклоните пластину и медленно аспирируйте от края.
    1. Когда среднее количество уменьшится, медленно положите пластину плоско и продолжайте аспирировать. Оставьте достаточное количество среды, чтобы избежать высыхания ЭБ. После этого добавьте 3 мл свежего CDM, дополненного 10 мкМ Y-27632. Переложите ЭБ с помощью серологической пипетки объемом 10 мл в посуду, покрытую ПЛО/ламинином (шаг 1.2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от последующего применения, ЭБ могут быть перенесены на 6-луночную пластину PLO/laminin или одиночные ЭБ могут быть перенесены в одну скважину 24-луночной пластины или крышки с покрытием PLO/ламинином.
  5. На 15-й день аспирируйте среду и замените ее свежим CDM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно добавить достаточное количество среды в скважины, чтобы обеспечить достаточное количество среды между подачами, так как со временем произойдет испарение (например, для скважины в 6-луночной плите добавьте 3 мл среды). Если среда начала подкисляться (становиться прозрачной и желтой), освежите среду, даже если ее нет в графике кормления до конца протокола.
  6. На 21-й день аспирируйте отработанную среду и замените ее ШМ. На 28-й день замените среду свежей ШМ. На 35-й день соберите клетки для дальнейшего применения.

4. Пробоподготовка к выделению РНК

  1. Аспирировать среду и добавить 500 мкл реагента диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) в каждую лунку 6-луночной пластины. Оставьте его включенным на пару секунд и аспирируйте.
  2. Инкубировать пластину, с крышкой, при комнатной температуре в течение 2 мин. Коснитесь боковых сторон пластины, чтобы отсоединить ячейки.
  3. Добавьте 1 мл КИМ (этап 1,8) и соберите ячейки в трубку объемом 1,5 мл.
  4. Гранулируйте ячейки центрифугированием с помощью настольной мини-центрифуги (см. Таблицу материалов) в течение 30 с при RT (максимальная скорость 2000 x g), отбросьте среду и добавьте 1 мл 1x PBS pH 7,4 для промывки ячейки гранулы.
  5. Снова гранулируйте ячейки с помощью настольной мини-центрифуги в течение 30 с на RT и снова мойте PBS.
  6. Гранулируйте ячейки и выбросьте PBS. Лизируйте клетки фенолом и гуанидином изотиоцианатом, содержащим реагент (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, содержащие фенол и изотиоцианат гуанидина, могут храниться при температуре −80 °C до 1 года. Клетки могут быть лизированы непосредственно в чашке в зависимости от метода выделения РНК и используемых реагентов. Из-за низкого количества клеток в чашке выделение РНК с использованием спиновых колонок кремнезема (см. Таблицу материалов) приведет к более высоким выходам РНК.

5. Подготовка клеток к иммунофлуоресцентному окрашиванию

ПРИМЕЧАНИЕ: Для плиты с 24 скважинами достаточно одного ЭБ на скважину.

  1. На 35-й день аспирируйте отработанную среду и промывайте клетки, добавляя 1 мл DPBS+/+ на лунку (для одной лунки из 24-луночной пластины).
  2. Аспирировать DPBS+/+ и добавить 500 мкл холодного 4% параформальдегида (PFA, см. Таблицу материалов), приготовленного в DPBS+/+ на скважину. Инкубировать в течение 20 мин на РТ.
  3. Удалите 4% PFA и дважды промойте ячейки с помощью DPBS+/+, как на шаге 5.1. Добавьте 1 мл DPBS+/+ и храните ячейки при 4 °C до окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется делать иммунофлуоресцентное окрашивание в течение 1 недели после фиксации, чтобы избежать отслоения клеток и потери антигенов. Однако, в зависимости от антитела и клеточного расположения мишени, окрашивание может быть сделано в более поздние сроки до 4 недель после фиксации.

Результаты

Обзор дифференциации мозжечка от 3D до 2D
Мозжечковые клетки генерируются начиная с иПСК. На рисунке 1А показан общий рабочий процесс и добавление основных компонентов для дифференциации. На 0-й день ЭБ производятся путем осторожного подъема колоний iPSC (

Обсуждение

Способность моделировать развитие мозжечка человека in vitro важна для моделирования заболеваний, а также для дальнейшего понимания нормального развития мозга. Менее сложные и экономичные протоколы создают больше возможностей для генерации реплицируемых данных и широкого внедрен?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим Дженни Грингер Ричардс за ее тщательную работу по проверке наших контрольных субъектов, из которых мы создали контрольные iPSC. Эта работа была поддержана NIH T32 MH019113 (D.A.M. и K.A.K.), Nellie Ball Trust (T.H.W. и A.J.W.), NIH R01 MH111578 (V.A.M. и J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (A.J.W.) и Roy J. Carver Charitable Trust (V.A.M., J.A.W. и A.J.W.). Фигуры создавались с BioRender.com.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Serological pipetteFisher Scientific13-678-26D
1-thio-glycerolSigmaM6145
2 mL Serological pipetteFisher Scientific13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm DiaFisher ScientificFB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture DishFalcon353001
4D Nucleofector core unitLonza276885Nucleofector
5 mL Serological pipetteFisher Scientific13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture DishFalcon353004
6-well ultra-low attachment platesCorning3471
9" Disposable Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-20D
Apo-transferrinSigmaT1147
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA9418
Cell culture grade waterCytivaSH30529.02
Chemically defined lipid concentrateGibco11905031
Chroman 1Cayman34681
Class II, Type A2, Biological safety CabinetNuAire, Inc.NU-540-600Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treatedCorning3526
Costar 6-well plate, TC treatedCorning3516
DAPI solutionThermo Scientific62248
DMEMGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide)SigmaD2438
DPBS+/+Gibco14040133
EmricasanCayman22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kitLife TechnologiesA15960
Essential 8-FlexGibcoA2858501PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging systemLife TechnologiesAMEX1000
Fetal bovine serum - Premium SelectAtlanta BiologicalsS11150
FGF2Peprotech100-18B
GlutaMAX supplementGibco35050061L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient MixGibco11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubatorThermo Scientific50144906
Human Anti-EN2, mouseSanta Cruz Biotechnologysc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbitR&D SystemsMAB7617
Human anti-PTF1a, rabbitNovus BiologicalsNBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouseBiolegend801213
IMDMGibco12440053
InsulinGibco12585
Laminin Mouse ProteinGibco23017015
Matrigel MatrixCorning354234Basement membrane matrix
MEM-NEAAGibco11140050
Mini CentrifugeLabnet InternationalC1310Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg)New England BioLabsT2040Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep KitNew England BioLabsT2010Silica spin columns
N-2 supplementGibco17502-048
Neurobasal mediumGibco21103049
PBS, pH 7.4Gibco10010023
PFA 16%Electron Microscopy Sciences15710
Polyamine supplementSigmaP8483
Poly-L-Ornithine (PLO)Sigma3655
Potassium chlorideSigma746436
SB431542Sigma54317
See through self-sealable pouchesSterikingSS-T2 (90x250)Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate Fisher ScientificS279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm DiaResearch Products International256131
Trans-ISRIBCayman16258
TRIzol ReagentInvitrogen15596018Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x)Gibco12604039Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometerWescor, Inc.Model 5520Osmometer
Y-27632Biogems1293823

Ссылки

  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1873D 2D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены