إنشاء نموذج إصابة الحبل الشوكي لكدمة الفأر بناء على تقنية طفيفة التوغل

Summary

تعمل التقنيات طفيفة التوغل وجهاز مختبري بسيط على تحسين استنساخ نموذج إصابة الحبل الشوكي عن طريق تقليل الأضرار الجراحية لحيوانات التجارب والسماح بصيانة التشكل التشريحي. هذه الطريقة جديرة بالاهتمام لأن النتائج الموثوقة والإجراءات القابلة للتكرار تسهل التحقيقات في آليات تعويض المرض.

Abstract

يمكن أن يؤدي استخدام طرق طفيفة التوغل لنمذجة إصابة الحبل الشوكي (SCI) إلى تقليل الاختلافات السلوكية والنسيجية بين التجارب ، وبالتالي تحسين قابلية استنساخ التجارب.

تحتاج هذه الطرق إلى متطلبين يجب الوفاء بهما: وضوح المسار التشريحي الجراحي وبساطة وراحة جهاز المختبر. بشكل حاسم بالنسبة للمشغل ، يوفر المسار التشريحي الواضح تعرضا طفيف التوغل ، مما يتجنب الضرر الإضافي لحيوان التجارب أثناء العمليات الجراحية ويسمح للحيوان بالحفاظ على مورفولوجيا تشريحية متسقة ومستقرة أثناء التجربة.

في هذه الدراسة ، تم البحث في استخدام منصة متكاملة جديدة تسمى منصة SCI المحورية لإصابة الحبل الشوكي في الحيوانات الصغيرة لفضح الحبل الشوكي على مستوى T9 بطريقة طفيفة التوغل وتثبيت وتثبيت فقرة الفئران باستخدام مثبت العمود الفقري ، وأخيرا ، يتم استخدام تأثير الجاذبية المحورية لضغط الحبل الشوكي للفئران على الاقتراب من درجات مختلفة من إصابة الحبل الشوكي T9. أخيرا ، يتم توفير النتائج النسيجية كمرجع للقراء.

Introduction

إصابة الحبل الشوكي الرضحية (SCI) تهيئ الفرد بسهولة لعواقب وخيمة¹ ؛ ومع ذلك ، لا يوجد علاج فعال في الوقت الحاضر ^1,2. تعد نماذج كدمة الحيوانات إحدى الطرق الرئيسية لدراسة اصابات النخاع الشوكي ^3,4.

من عام 2004 إلى عام 2014 ، تم استخدام^{الفئران} ككائنات نموذجية في 289 من 407 دراسة (71٪) والفئران في 69 (16.9٪). في الواقع ، زادت نسبة التجارب على الفئران تدريجيا على مر السنين بسبب مزاياها على النماذج الأخرى ، وخاصة الإمكانات الكبيرة لدراسات تنظيم الجينات³،^4،5. لذلك ، هناك حاجة إلى المزيد من الأدوات المتوافقة لإجراء المزيد من الدراسات باستخدام الماوس كنموذج بسبب الأهمية الكبيرة التي تعلق على اتساق النموذج⁶. تعتمد الأجهزة الشائعة التي تم الإبلاغ عنها في الدراسات السابقة بشكل أساسي على مبدأ تأثير الحبل الشوكي لألن ، على سبيل المثال ، تأثير انخفاض الوزن الأساسي^7,8 ، وجامعة نيويورك (NYU) / دراسات إصابة الحبل الشوكي الحيواني متعدد المراكز (MASCIS)^1,9 ، وتأثير الأفق اللانهائي (IH) ^10,11 . يشترك مصدم انخفاض الوزن وصدم جامعة نيويورك / MASCIS في نفس مبدأ التصويب على الحبل الشوكي المستهدف وإسقاط وزن ثابت من ارتفاعات مختلفة لإحداث شدة إصابة مختلفة. يخلق المؤثر IH إصابة الحبل الشوكي وفقا لقوى مختلفة.

للراحة في استخدام نموذج الماوس في دراسات اصابات النخاع الشوكي ولوضع الأساس لطرق العلاج الفعالة ، تم تطوير منصة متكاملة لإصابة الحبل الشوكي للفأر ، تسمى المنصة المحورية لإصابة الحبل الشوكي (SCICP). تتكون المنصة من أربعة مكونات رئيسية: (1) طاولة تشغيل حيوانية مصممة لوضع مناسب للفئران التي يتم تشغيلها ، وهي مدمجة للغاية وتوفر الراحة دون قيود على الموضع. (2) مبعدة دقيقة على كلا الجانبين لعقد عضلات الفقرية أثناء العملية ؛ (3) مثبت فقري لتثبيت الفقرة قبل إجراء اصابات النخاع الشوكي (يتوفر مثبتان فقريان للتشغيل على الحيوانات الكبيرة مثل الفئران) ؛ (4) كم ، طرف صدم ، أوزان ، ودبوس سحب. يجب تجميع الأجزاء الثلاثة على ذراع X-Y-Z قابل للإزالة. للاستهداف الدقيق ، يتم وضع طرف الصدمة على سطح الحبل الشوكي ، ويتم نزول ذراع X-Y-Z برفق إلى الارتفاع المتوقع بمساعدة العلامة بين طرف الصدمة والأكمام. يتكون طرف الصدمة من سبيكة ألومنيوم 0.12 جم لتجنب تلف الحبل الشوكي الناتج عن ضغط الوزن الكبير قبل الإجراء. دبوس السحب مخصص لتثبيت الأوزان الموجودة أعلى الغلاف لتحضير انخفاض الوزن (الشكل 1).

في الدراسات السابقة ، تم تعريف تقسيم قوة التأثير وفقا لبيانات قوة التأثير لجهاز IH ، وهي 30 Kdyn و 50 Kdyn و 70 Kdyn على التوالي ^6,10. أثناء عملية البحث ، ثبت أن الدرجات التسلسلية لنماذج اصابات النخاع الشوكي قد تم تأسيسها بناء على SCICP ، والتي يمكن استخدامها في دراسات مختلفة. لذلك ، قبل بدء التجربة رسميا ، تم اختبار قوى التأثير الناتجة عن أوزان مختلفة من كتل مختلفة باستخدام جهاز اختبار ضغط الذروة. نتيجة لذلك ، تم اختيار ثلاثة نماذج تمثيلية موحدة لفئران اصابات النخاع الشوكي كثلاث درجات مختلفة من الإصابة ، بما في ذلك المجموعات الخفيفة والمتوسطة والشديدة المتدرجة ، على التوالي ^6,10 ، وتم إطلاق الأوزان في نفس الارتفاع ، مع وزن 1.3 جرام للخفيف ، و 2.0 جرام للمعتدل ، و 2.7 جرام للأضرار الشديدة.

كوسيلة أخرى لضمان قابلية التشغيل والدقة ، تم الإبلاغ عن نهج تشغيلي جديد وطفيف التوغل. من خلال البحث في تشريح الفئران الطبيعية ، تم العثور على طريقة جديدة لتحديد موقع الفضاء بين العمود من T12-T13. طريقة تحديد موقع الفقرات في خطوات العملية سهلة الإتقان ودقيقة ، مما يضمن تحديد الموقع بدقة للعمليات طفيفة التوغل.

نأمل أن تساعد تقنية إصابة الكدمة هذه في البحث وفهم إصابة الحبل الشوكي ، بما في ذلك فهم الفيزيولوجيا المرضية وتقييم الإدارة وما إلى ذلك.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة أخلاقيات ورعاية المختبر في كلية تشيلو للطب بجامعة شاندونغ (رقم الموافقة: 21L60) وتم إجراؤها وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر الذي نشرته المعاهد الوطنية للصحة (منشورات المعاهد الوطنية للصحة رقم 85-23 ، المنقحة عام 1996).

1. آلية إصابة الحبل الشوكي منصة محورية والاختبارات الميكانيكية

1. قم بتجميع المنصة بطاولة عمليات جراحية ومثبت فقري وطرف صدمي (الشكل 1).
   ملاحظة: حافظ على انخفاض الوزن وفتحات العادم ، والتي تمنع الوزن من مواجهة التيارات الهوائية ، نظيفة ، لأن أي أوساخ على انخفاض الوزن أو الأكمام يمكن أن تؤثر على دقة المنصة.
2. ضع الطرف ، الذي يسمح بتحديد موقع الحبل الشوكي بدقة ، في الكم.
3. حدد الكتل المناسبة لقطرات الوزن للتجربة ، وهي 1.3 جم و 2.0 جم و 2.7 جم للمجموعات الخفيفة والمتوسطة والشديدة على التوالي.
4. قم بتوصيل دبوس السحب في فتحات انخفاض الوزن.
5. قم بتجميع انخفاض الوزن إلى أعلى الكم باستخدام دبوس السحب المثبت في الأخدود الموجود على ذراع X-Y-Z بحيث ، بمجرد اكتمال تحديد الموقع ، يتم تحرير الوزن لضرب طرف الصدمة ، وبالتالي الضغط على الحبل الشوكي ، وتلاحظ التغيرات في الحبل الشوكي تحت المجهر.
6. اضبط ذراع X-Y-Z بدقة 0.1 مم القابل للإزالة لتوفير مساحة عمل كافية (الشكل 1D ، E).
   ملاحظة: لتأكيد اتساق نتائج الدراسة ، قبل بدء التجربة ، قم بقياس القوة المتولدة عند انخفاض الوزن داخل الغلاف باستخدام جهاز الكشف عن ضغط الذروة. تكرار التأكيد ليس ضروريا للدراسات المستقبلية.
7. قم بتشغيل الجهاز ، ضع مستقبل الضغط المعدني أسفل الطرف ، وقم بتصفير المحول ، وحرر دبوس السحب ، وسجل قوة التأثير الفعلية.

2. تحديد موقع واستئصال الصفيحة الفقرية^{للفقرة الصدرية} التاسعة (T9)

ملاحظة: تم شراء إناث الفئران C57BL / 6J التي تتراوح أعمارها بين 9 و 10 أسابيع من شركة Jinan Pengyue Experimental Animal Company (جينان ، الصين).

1. الأوتوكلاف مجموعة من الأدوات الجراحية للتجربة وتعقيم طاولة العمليات مع الكحول 75 ٪ قبل الجراحة.
2. حقن البوبرينورفين لتسكين الألم (0.05-2.0 ملغم / كغم ، SQ) قبل 30 دقيقة من التخدير لعمليات الإصابة. بعد ذلك ، قم بتخدير الماوس باستخدام الأيزوفلوران (الحث: ~ 3٪ -5٪ ، الصيانة: ~ 1.5٪ -2٪). تحقق مما إذا كان الحيوان قد تم تخديره بالكامل عن طريق ردود فعل قرصة الذيل أو إصبع القدم. بمجرد أن يصبح التخدير ساري المفعول ، ضع الماوس في وضع الانبطاح في جزء مخصص من طاولة العمليات وقم بتغطية القرنية بمرهم العيون (ضع مرهم العيون على القرنيات لحماية العينين من الجفاف أثناء الجراحة).
   1. احلق الشعر من الذيلية إلى المنضدة باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية فوق العمود الفقري الصدري القطني. تعقيم الجلد عدة مرات في حركة دائرية مع اليودوفور لمدة 30 ثانية تليها 75 ٪ الكحول. ضع ستارة جراحية معقمة وقم بعمل شق طولي يبلغ حوالي 1.5 سم على الجلد من T6 إلى T13 تقريبا بمشرط وشفرة.
      ملاحظة: الجس على طول الهامش الساحلي إلى خط الوسط ، حيث يقع الفضاء بين العمود T12-T13. قم بعمل شق 1.5 سم على المنبر ، ويكون الشق متدفقا تقريبا مع فقرات T6-T13.
3. استكشف الضلع 13 على جانب واحد من الجزء العظمي تحت مجهر التشغيل. استكشف العملية الشائكة في خط الوسط عن طريق لمس منطقة الزاوية الضلعية الفقرية برفق ثم باتجاه المنبر لتحديد الفضاء بين العمود الفقري ل T12-T13. استكشف الفضاء بين الشوكة ل T9-T10 من مساحة T12-T13 إلى الجانب المنبقي. (الشكل 2 أ ، 3 أ)
4. تشريح العضلات المجاورة للعمود الفقري على طول العملية الشائكة ل T9 إلى المفاصل الأمامية والخلفية لكلا الجانبين باستخدام مقص دقيق (الشكل 3 ب). سحب العضلات المجاورة للعمود الفقري مع المبعدات الدقيقة وتنظيف الأنسجة الرخوة على الصفيحة وفي الفضاء بين العمود من T8-T9 و T9-T10 مع مقص دقيق.
5. قم بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية T9 ، وقم بتثبيت العملية الشائكة ل T9 باستخدام ملقط الجراحة المجهرية ، وارفعه قليلا ، وأدخل المقص الصغير بالتوازي على طول الجانب الظهري الجانبي الأيمن من الصفيحة ، وتجنب تلف الحبل الشوكي ، وقطع الصفيحة بمقص دقيق. كرر على الجانب الأيسر ، ويمكن أن يتعرض الحبل الشوكي (الشكل 2B ، 3C).
6. قبل تثبيت الفقرة ، قم بفك الذراع العالمي ، وقم ببطء بتثبيت المفاصل الجانبية من 9 إلى 10 على جانبي الفقرة باستخدام ملقط البعوض الصغير لجهاز التثبيت الفقري. تشديد البراغي على ملقط البعوض الصغير ، وبالتالي يتم تثبيت الفقرة. اضبط الحبل الشوكي على المستوى الأفقي ، وشد الذراع العالمي ، وتم إصلاح الفقرة (الشكل 3D).

3. إصابة كدمة T9

1. بمجرد كشف الحبل الشوكي من مستوى T9 وإصلاح الفقرة ، استهدف الحبل الشوكي من الطرف الموجود داخل الكم تحت المجهر التشغيلي (الشكل 3E).
2. تحقق مما إذا كان سطح الطرف موازيا للحبل الشوكي من الجوانب الخلفية والجانبية للحبل الشوكي ، لأنه من السهل ملاحظة العلاقة بين الحبل الشوكي والطرف تحت المجهر ، وأنه يمكن قلب طاولة العمليات بسهولة.
3. تحقق مما إذا كان سطح الطرف موازيا للحدود الثنائية للصفيحة المجنونة قبل أن يكون الطرف ملامسا للحبل الشوكي بعد استئصال الصفيحة الفقرية لأنه مستوى مرجعي طبيعي مواز للحبل الشوكي.
4. بعد تحديد المساحة المتداخلة ل T12-T13 ، قم بخفض الغلاف حتى تتوافق نهاية الصدمة مع العلامة الموجودة على نافذة المراقبة ويتم الوصول إلى الارتفاع المحدد البالغ 22 مم. اسحب دبوس السحب لتحرير الوزن (1.3 جم أو 2.0 جم أو 2.7 جم وفقا للمجموعة ، مع كل مجموعة تضم 3 فئران ولكل مجموعة فأرة واحدة لكل نقطة زمنية).
   ملاحظة: يجب أن يكون الحبل الشوكي موازيا للأرض وعموديا على الطرف. حرك طاولة العمليات لضمان المجال البصري المجهري ، لأن الطاولة مضغوطة للغاية.
5. قم بإزالة الصدمة عند إجراء الكدمة ومراقبة درجة اصابات النخاع الشوكي تحت مجهر التشغيل. في المجموعة الخفيفة ، يمكن رؤية تغيير اللون الأحمر الفاتح ، بينما في المجموعة المعتدلة ، يظهر موقع الإصابة اللون الأحمر الداكن في 3-4 ثوان ، وربما يمكن ملاحظة السماحة. في المجموعة الشديدة ، قد تظهر المظاهر الحمراء الداكنة على الفور ، ويتجلى سماحة واضحة في الجافية ، لكن الجافية لا تزال في شكل ثابت (الشكل 3F).
6. خياطة اللفافة السطحية والجلد بالغرز (خياطة البولي بروبلين غير القابلة للامتصاص ، الحجم: 6-0).
7. بعد الانتهاء من الخياطة ، قم بتعقيم المنطقة الجراحية ، ضع الماوس على وسادة يتم التحكم في درجة حرارتها حتى يتم استعادة الوعي الكامل ، ثم ضع الماوس في أقفاص الماوس.

4. رعاية الحيوان

1. ضع الحيوان على وسادة التدفئة للتعافي ومراقبة حركة كلا الطرفين الخلفيين.
   ملاحظة: لا ينبغي إعادة الحيوانات التي خضعت لعملية جراحية إلى صحبة الحيوانات الأخرى حتى تتعافى تماما.
2. ضع نظاما غذائيا عالي الماء على أرضية القفص حتى تتمكن الحيوانات من الوصول بسهولة إلى الطعام. بدلا من ذلك ، استخدم قفصا مع طاولة تغذية أقل.
3. إفراغ مثانات الفئران مرتين في اليوم بعد العملية لأنه من الصعب على مجموعات الإصابات المتوسطة والشديدة استعادة وظيفة المثانة. حقن البوبرينورفين للتسكين (0.05-2.0 ملغم / كغم ، SQ) 8-12 ساعة / يوم لمدة 3 أيام.

5. التروية عبر القلب ، تلطيخ ، وتلطيخ المناعة

1. في الأيام 1 و 28 و 56 بعد الإصابة ، ضحي بفأر واحد من كل مجموعة ، على التوالي ، عن طريق التروية.
   1. قم بتخلل الفئران مع 60 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) و 20 مل من 4٪ بارافورمالدهيد بعد التخدير المفرط (4٪ -6٪ إيزوفلوران).
   2. جمع العمود الفقري مع مقص صغير ، وتمتد rostrally و ذيلية 1 سم ، على التوالي ، من مركز الآفة.
   3. استئصال العضلات الزائدة ، والاحتفاظ بأجزاء العمود الفقري سليمة مع أضلاع جزئية للأدوات لعقد في الخطوة 5.1.4 ونقعها في 4 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة.
   4. قم بتثبيت الأضلاع بملقط مرقئ للتثبيت وتحديد مركز الآفة تحت المجهر وفقا للصفيحة المقطوعة وتغيير اللون في مركز الآفة في الحبل الشوكي.
   5. استئصال جميع الصفيحات والعمليات المفصلية بمقص دقيق من الذيلية.
   6. قطع جذور الأعصاب مع مقص دقيق وإخراج الحبل الشوكي.
   7. جمع 0.5 سم من الحبل الشوكي تمتد ذيلية و rostrally ، على التوالي ، من مركز الآفة مع مقص صغير.
   8. ضع الحبل الشوكي في 30٪ سكروز عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة.
2. قطع الأنسجة إلى أقسام بسمك 6 ميكرومتر بعد التجميد وفقا لنوع الفحص النسيجي.
3. أداء تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E).
   1. أعد تدفئة المقاطع إلى درجة حرارة الغرفة وانقع المقاطع التي يبلغ سمكها 6 ميكرومتر في 4٪ فورمالديهايد لمدة 15 دقيقة تقريبا ، تليها النقع في 1x PBS لمدة دقيقة واحدة أربع مرات لإزالة OCT المتبقي.
   2. وصمة عار المقاطع مع الهيماتوكسيلين لمدة 90 ثانية ، وشطف بالماء المقطر المزدوج.
   3. ثم اغسل الأقسام بالماء الجاري لمدة 3 دقائق.
   4. تلطخ باليوزين لمدة 4 دقائق وتنقع في 95٪ كحول لمدة 30 ثانية مرتين لشطف اليوزين الزائد.
   5. أخيرا ، جفف بالكحول المتدرج (95٪ كحول و 50٪ كحول مرة واحدة على التوالي) لمدة 30 ثانية ونقع في الزيلين للشفافية لمدة 2 دقيقة. بعد ذلك ، قم بختم العينات بهلام الراتنج (قسم المستوى الإكليلي: الشكل 4 ؛ قسم المستوى السهمي: الشكل 5).
4. أداء تلطيخ المناعي.
   1. أعد تسخين الأقسام إلى درجة حرارة الغرفة وانقع المقاطع التي يبلغ سمكها 6 ميكرومتر في 4٪ فورمالديهايد لمدة 2 دقيقة تقريبا.
   2. اغسل الأقسام في TBST لمدة 5 دقائق لمدة ثلاث مرات.
   3. احتضان الأقسام بمحلول مانع (10٪ مصل الماعز الطبيعي في PBS) وكتلة لمدة 1 ساعة لمنع الارتباط غير المحدد للغلوبولين المناعي.
   4. احتضان أقسام الحبل الشوكي طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع كل من البروتين الحمضي الليفي المضاد للفأر (GFAP ، علامة للخلايا النجمية التفاعلية) ، والجسم المضاد متعدد النسيلة (1: 600) ، والجسم المضاد للأرانب NF200 (1: 2000) ، وهو علامة للخيوط العصبية في 0.4 مل من محلول الحجب.
   5. اشطف الأقسام باستخدام PBS وأضف 0.4 مل من محلول الحجب باستخدام IgG المقترن Alexa 594 المضاد للأرانب (1: 1,000) والأجسام المضادة الثانوية المضادة للماعز Alexa 488-conjugated IgG (1: 1,000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
   6. التقط صورا باستخدام مجهر فلوري بمعدل 10x عن طريق المسح البانورامي التلقائي بأطوال موجية تبلغ 594 نانومتر و 488 نانومتر على التوالي (الشكل 6).
      1. قم بتشغيل مجهر التألق ، ووضع الشريحة على مرحلة المجهر ، والتبديل إلى قناة التألق ، واستخدام مفتاح تحديد المواقع لوضع ثلاث إلى أربع نقاط على الأنسجة ، والتركيز لإكمال التصوير. بعد الانتهاء من التصوير ، احفظ صور القنوات المختلفة بالتنسيق المطلوب ، ثم احفظ الصورة المدمجة.

النتائج

لاختبار دقة الجهاز ، تم قياس القوة التي صنعتها ثلاث كتل مختلفة من الأوزان من نفس الارتفاع باستخدام جهاز اختبار ضغط الذروة. تم إجراء أربعة وعشرين اختبارا بمجموعات مختلفة من الأوزان ، مما أدى إلى (متوسط ± SD) 0.323 نيوتن ± 0.02 نيوتن لأوزان 1.3 جرام ، و 0.543 نيوتن ± 0.15 نيوتن لأوزان 2.0 جرام ، و 0.723 نيوتن ± 0.26 نيوتن لأوزان 2.7 جرام (الشكل 7). اعتمدت الدراسات السابقة داين (دين) أو كيلودين (كدين) كوحدات لقياس شدة الكدمة. لإجراء مقارنة أفضل مع الدراسات السابقة ، تم سرد التحويلات بين نيوتن (N) و dyne / Kilodyne (1 N = 1 كجم × 1 م / ث 2 = 1 × 10 3 جم × 1 × 100 سم / ثانية² = 1 × 10⁵ داين ؛ 0.323 نيوتن = 32.3 كدين ؛ 0.543 نيوتن = 54.3 كدين ؛ 0.723 ن = 72.3 كدين).

يوضح الجدول 1 والشكل 4 بيانات آفات المجموعات الخفيفة والمتوسطة والشديدة في المقاطع الإكليلية. انطلاقا من الشكل 4 ، في اليوم 28 بعد الإصابة ، انخفضت استمرارية حدود المادة الرمادية والبيضاء المميزة في المجموعات الخفيفة والمتوسطة والشديدة على التوالي ، مع نمو مساحة النسيج الندبي بشكل أكبر ونسبة متزايدة على المقطع العرضي لمركز الآفة. كانت هناك اختلافات مورفولوجية واضحة في جميع المجموعات التجريبية مقارنة بالمجموعة العادية. هذا أثبت عقلانية تقسيم درجات الإصابة في المجموعات التجريبية.

يصف الجدول 2 والشكل 5 إصابة الحبل الشوكي في اليومين 1 و 56 بعد الإصابة في المقاطع السهمية. يمكن ملاحظة أن منطقة الآفة زادت تدريجيا بشكل ملحوظ من المجموعات الخفيفة إلى الشديدة في يوم 1st بعد الإصابة. وفي الوقت نفسه ، كانت استمرارية المادة البيضاء على جانبي الحبل الشوكي أفضل في المجموعة الخفيفة ، مع فجوات دائرية صغيرة يمكن ملاحظتها ، وهي خصائص الوذمة الخلالية. في المجموعة المعتدلة ، أظهرت المادة البيضاء استمرارية ضعيفة ، ولم يتم ترتيب بنية المادة البيضاء البطنية. في المجموعة الشديدة ، أظهرت المادة البيضاء البطنية اضطرابا أكثر حدة ، وظهرت مساحة كبيرة من التجويف في وسط الإصابة. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الأنسجة المحيطة امتلاء واضحا لخلايا الدم الحمراء ، وتجمعت خلايا الدم الحمراء بالقرب من القناة المركزية في شرائح. في اليوم 56 بعد الإصابة ، لوحظ تكوين ندبة في مركز الإصابة للمجموعات الثلاث ، التي زادت مساحتها وفقا لشدة الإصابة.

يمكن أيضا اشتقاق سلامة الخيوط العصبية للحبل الشوكي في اليوم 56 بعد الإصابة من تحليل نتائج تلطيخ التألق المناعي (الشكل 6). يوضح الشكل أيضا أن الخلايا النجمية المتداخلة المكونة للندبة كانت مرئية في وسط جميع مجموعات الإصابات الثلاث ، مع زيادة طول منطقة الإصابة مع شدة الإصابة ، بينما انخفض قطر الندبة. هذا يشير إلى وجود تقلص ندبة ، مما قد يؤدي إلى انخفاض في قطر الحبل الشوكي.

الشكل 1: معرض كامل وأجزاء من المنصة المحورية لإصابة الحبل الشوكي. (أ) يمكن فصل ذراع X-Y-Z وطاولة العمليات ، مما يترك مساحة كافية لإجراء العملية التي يتعرض خلالها الحبل الشوكي لحيوان صغير. يمكن تحريك طاولة التشغيل بحرية أثناء التشغيل ، مما يقلل من صعوبة التشغيل المحتملة التي تعزى إلى قيود الموضع. يحتوي جسم المثبت الفقري على ذراع عالمي ثلاثي المفاصل للمساعدة في الاتجاه ، مما يزيد من مرونته. (ب) ضع طرف الصدمة في الكم وقم بتجميع الأخير في ذراع X-Y-Z. ضع طرف دبوس السحب في فتحات الوزن لمنع الوزن من الانخفاض ووضع الوزن في الغلاف. مع تجميع الأجزاء ، حدد موقع منطقة الإصابة المستهدفة تحت المجهر. بعد ذلك ، قم بخفض ذراع X-Y-Z حتى تتوافق نهاية طرف الصدمة مع المستوى السفلي لنافذة المراقبة ، مما يشير إلى الوصول إلى ارتفاع كدمة موحد (الارتفاع بين الوزن وطرف الصدمة هو 22 مم عندما يبدأ السقوط). اسحب دبوس السحب ، وسيتم التأثير. (ج) بعد تعرض منطقة الإصابة ، استخدم المشابك لتثبيت وتثبيت العمود الفقري للماوس ومسمار الشد لتثبيت مثبت العمود الفقري. (د) الوظائف الموصى بها للأخاديد الموجودة على طاولة العمليات. من المفترض أن يتم وضع التجارب في الأخدود الأوسط ، مع الرأس نحو الجزء الأمامي الصدري على المنحدر. يتم فصل ذراع X-Y-Z عن طاولة العمليات. (ه) عرض SCICP المجمع. الأسهم تشير إلى الأجزاء. مع توجيه الطرف إلى منطقة الكدمة المستهدفة ، لبدء الكدمة ، اسحب دبوس السحب ، وسينخفض الوزن على طرف الصدمة لضغط الحبل الشوكي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: رسم بياني تصويري لطريقة تحديد موقع الفقرة الضلعية الفقرية T13. (أ) الضلع الثالث عشر و T13 تراكيب تشريحية ثابتة نسبيا. يمكن اكتشاف الزاوية الضلعية الفقرية T13 بسهولة تحت المجهر ، والتي يمكن للمشغل من خلالها التحقيق نحو العملية الشائكة والعثور على الفضاء بين العمود T12-T13. بعد ذلك ، تحقق نحو الجانب المنبر على التوالي للعثور على فقرة الإصابة المستهدفة (على سبيل المثال ، T9). (ب) يمكن لاستئصال الصفيحة الفقرية الصدرية 9 طفيفة التوغل أن يحافظ على الصفيحة الكافية والمفاصل الجانبية بين الأجسام الفقرية المجاورة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: التعرض وكدمة الحبل الشوكي على مستوى T9 في الفئران. أ: دقق في الزاوية الضلعية الفقرية T13. (ب) مع سحب العضلة المجاورة للعمود الفقري بواسطة المبعدات الدقيقة لتوفير مساحة كافية للتشغيل ، قم بتعريض T9. (ج) إجراء استئصال الصفيحة الفقرية T9 بالمقص الدقيق. د: تثبيت الفقرة باستخدام مشابك مثبت العمود الفقري. (ه) استهدف منطقة الكدمة المستهدفة بطرف الصدمة. (و) تلاحظ الوذمة والازدحام في منطقة الإصابة بعد الكدمة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: أقسام تمثيلية في اليوم 28 بعد درجات مختلفة من اصابات النخاع الشوكي في الفئران (الأقسام الإكليلية). أ: الحبل الشوكي الصدري الطبيعي للفأر. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) بالنسبة للمجموعة الخفيفة ، يمكن ملاحظة إصابة طفيفة في الجانب الظهري للحبل الشوكي ، بينما يتم الحفاظ على مورفولوجيا المادة البيضاء والمادة الرمادية بشكل كبير. (ج) بالنسبة للمجموعة المتوسطة، يلاحظ وجود نسيج ندبي واضح في الحبل الشوكي (يشار إليه بعلامة النجمة الحمراء). بالكاد يمكن تمييز الخصائص المميزة بين المادة البيضاء والمادة الرمادية. (د) بالمقارنة، فقد الحبل الشوكي للمجموعة الشديدة مورفولوجيته الأصلية تقريبا، وحل محله تقريبا نسيج ندبي. يشير الخط الأخضر المتقطع إلى منطقة الضرر ، ويشير الخط الأسود المتقطع إلى حدود المادة الرمادية التي يمكن ملاحظتها. مع زيادة شدة الإصابة ، ظهرت آفة أكبر وبنية أقل نجاة في الحبل الشوكي للفأر ، مع حدود المادة الرمادية بالكاد يمكن تمييزها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: أقسام تمثيلية في اليومين 1 و 56 بعد إصابة الحبل الشوكي للفئران (المقاطع السهمية). أ: الحبل الشوكي الصدري الطبيعي للفأر. (ب) يمثل B1-B3 ، على التوالي ، الحبل الشوكي في اليوم الأول بعد الإصابة في المجموعات الخفيفة والمتوسطة والشديدة. يمكن ملاحظة أنه مع زيادة الضرر ، تعطلت مساحة أكبر أو تسييلها في مركز الآفة. اختلفت استمرارية المادة البيضاء في الحبل الشوكي البطني بسبب شدة الإصابة المختلفة. يوضح B1 أن المادة البيضاء في الحبل الشوكي البطني لديها استمرارية أفضل مع وذمة طفيفة. يظهر B2 استمرارية أضعف للمادة البيضاء في الحبل الشوكي البطني وذمة أكثر حدة. فقدت الأنسجة الموجودة في وسط B3 SCI كل الاستمرارية تقريبا ، وهناك وذمة واسعة النطاق في المنطقة خارج مركز الإصابة. (ج) يمثل C1-C3 ، على التوالي ، الحبل الشوكي في اليوم 56 بعد الإصابة في المجموعات الخفيفة والمتوسطة والشديدة. درجات مختلفة من تقلص الندبة تجلى في مركز الإصابة بين المجموعات المختلفة ، وكان هناك اختلاف كبير في قطر منطقة الإصابة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: أقسام تمثيلية في اليوم 56 بعد إصابة الحبل الشوكي في الفئران (المقاطع السهمية). أ: القسم التمثيلي للمجموعة الخفيفة. يشير NF200 إلى الخيوط العصبية ، بينما يشير GFAP إلى الخلايا النجمية. لوحظت الخلايا النجمية المتداخلة في مركز الآفة ، في حين أن الخيوط العصبية في الجزء البطني من الحبل الشوكي في استمرارية جيدة. (ب) القسم التمثيلي للمجموعة المتوسطة. يمكن ملاحظة مركزين للندبة (يشار إليهما بعلامات نجمية حمراء) بالإضافة إلى الخلايا النجمية المتداخلة ، في حين أن الخيوط العصبية في الجانب البطني لها استمرارية. (ج) مقطع تمثيلي للمجموعة الشديدة ، مع نطاق آفة كبير وخلايا نجمية ضخمة مكونة للندبات. لا يوجد مركز ندبة واضح لوحظ ، والخيوط العصبية لديها استمرارية ضعيفة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: القوة المتولدة من نفس الارتفاع ولكن بأوزان مختلفة. قبل التجربة ، تم الكشف عن القوة الناتجة عن كتل مختلفة من الأوزان المنبعثة من نفس الارتفاع باستخدام جهاز الكشف عن ضغط الذروة. بعد أن أكملت كل مجموعة 24 اكتشافا ، تم الحصول على بيانات جاذبية أكثر موثوقية للإشارة إلى القوة الضاربة. تم تحليل البيانات باستخدام البرنامج الإحصائي SPSS19.0. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD ، n = 24 في كل مجموعة. استندت المقارنات بين مجموعات أكبر إلى تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) المستخدم لاختبار الاختلافات. P < 0.05 اعتبرت ذات دلالة إحصائية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

28 نقطة في البوصة
مجموعة	GMR (٪)	WMR (٪)	DR (٪)
عادي	35.44	64.57	0
متوسط	11.59	64.88	23.53
المعتدل	0	41.14	58.86
شديد	0	0	100

الجدول 1: معدل المادة البيضاء والمادة الرمادية والضرر في اليوم 28 بعد الإصابة. الاختصارات: dpi = أيام بعد الإصابة ، DA = المنطقة التالفة ؛ GMR = معدل المادة الرمادية ؛ WMR = معدل المادة البيضاء ؛ DR = معدل التالفة.

مجموعة	1 نقطة في البوصة DA (ميكرومتر2)	56 نقطة في البوصة DA (ميكرومتر2)
عادي	0	0
متوسط	2391250	666091
المعتدل	4383381	1263191
شديد	5118833	1943962

الجدول 2: مقارنات بين الآفة على المقاطع السهمية في اليومين 1 و 56 بعد الإصابة.

Discussion

من خلال الإجراء الموحد ، يمكن الحصول على بيانات مستقرة ، خاصة في تجارب الحيوانات الصغيرة في الجسم الحي ، والتي يمكن أن تقلل من انحراف النتائج الناجمة عن الفروق الفردية بين الحيوانات. بناء على الشروط المذكورة أعلاه وأدوات التطبيق المريحة ، يمكن إنشاء نماذج SCI موحدة وطفيفة التوغل ودقيقة وقابلة للتكرار.

نظرا لقابليته للتطبيق العملي والراحة ، في السابق ، تم استخدام أداة تأثير انخفاض الوزن في الغالب³. يشترك المؤثر الذي تم تقديمه في هذه الدراسة في نفس المبدأ مع نموذج ألين¹². لحسن الحظ ، نظرا لمزايا التصنيع الدقيقة لتكنولوجيا التصنيع الحديثة ، صمم فريق البحث أداة تصادم لانخفاض الوزن مع مزايا كونها سهلة التشغيل ومستقرة بقوة ونادرا ما تكون غير دقيقة. تم استخدام جهاز الكشف عن ضغط الذروة لقياس جاذبية الأوزان المختلفة. أفادت الدراسات السابقة⁶،10 حول تأثير Infinite Horizons أن نطاق ±5 Kdyn للقوة المنحرفة عن القوة المقصودة مقبول في مجموعات 30 Kdyn و 50 Kdyn و ⁷⁰ Kdyn ^، مما يوفر مرجعا للدراسة الحالية من حيث تقسيم المجموعة واختيار درجة الكدمة. في هذا البحث ، تم قياس القوة المحتملة للمجموعات المختلفة مسبقا ، وتم الحصول على بيانات أكثر دقة.

أكثر أهمية من الجهاز في تجارب النماذج الحيوانية هو فهم واستخدام تشريح الفأر. الاستفادة الجيدة من علم التشريح يمكن أن تجعل الإجراءات طفيفة التوغل. تؤثر الجراحة طفيفة التوغل بشكل مباشر على استقرار الحالة الوظيفية لحيوان التجارب واتساق استعادة الماوس اللاحقة. أظهرت الدراسات السابقة أن إنشاء نماذج اصابات النخاع الشوكي طفيفة التوغل يزيد من استقرار البنية الفقرية ويتجنب الضرر الإضافي الناجم عن عدم استقرار العمود الفقري أثناء الشفاء في الفئران¹. فرضية الجراحة طفيفة التوغل هي الاستخدام المعقول للهياكل التشريحية الطبيعية. لذلك ، يجب أن يتم تحديد الموقع السريع والدقيق لشرائح الحبل الشوكي وفقا للهيكل التشريحي للفئران. كما ورد ، تم استخدام طريقة التصوير للعثور على الفقرة¹³. على الرغم من أنها تتمتع بدقة عالية ، إلا أنه في عملية التشغيل التجريبي الفعلية ، فإن طريقة التصوير لتحديد الموقع لها عيوب التشغيل غير المريح ، ووقت التشغيل الطويل ، واقتناء المعدات المعقدة ، ومتطلبات دقة المعدات العالية. وصف ماكدونو وآخرون تحديد موقع T7 من خلال الزوايا السفلية للكتف¹⁴ ، في حين أن الفئران تعمل في السجود ، لذلك من المفترض أن تكون الزوايا السفلية المذكورة زوايا خلفية. علاوة على ذلك ، فإن استخدام النصائح الكتفية السفلية للعثور على T7 هو طريقة تحديد موقع لموضع معين في علم التشريح البشري¹⁵ ، وهو غير مناسب للفئران. أخيرا ، أثبتت بيانات Micro-CT أيضا صحة الفرضية القائلة بأن الزوايا الخلفية للكتف لا تتدفق مع T7 بغض النظر عما إذا كان الفأر في وضع جسمه الطبيعي أو المحدد. ذكر McDonough et ^al.14 أيضا تحديد أعلى نقطة في الخلف عندما يكون الماوس مقوسا وتحديد أعلى نقطة على أنها T12. نسبيا ، في هذا البحث ، يقع T9 بمساعدة الفضاء بين العمود T12-T13 ، والذي لا يرتبط ولا يتأثر بوضعية الماوس. إلى جانب ذلك ، مع هذه الطريقة ، يمكن تحديد موقع الفقرة المستهدفة وتشغيلها بسهولة. يجب على المرء أن يسبر الضلع الثالث عشر تحت المجهر ، ويلمس بلطف منطقة الزاوية الضلعية الفقرية ، ويرسم خطا نحو العملية الشائكة ، ثم يسبر المسافة بين العمليات الشائكة ل T12-T13 باتجاه الرأس. استخدم فريق البحث الفضاء بين الشوكتين T12-T13 لتحديد موقع T9 من 12 فئران. أخيرا ، خضعت 12 أنثى من الفئران C57BL / 6J لفحص Micro-CT بعد موقع T9 واستئصال الصفيحة الفقرية. أشارت نتيجة الفحص بالأشعة المقطعية الدقيقة إلى أن الصفيحة التي تمت إزالتها في جميع الفئران ال 12 كانت T9. أظهرت نتائج التصوير المقطعي المحوسب الدقيق أن جميع T9 تم تحديد موقعها بدقة ، وكانت الدقة أعلى بكثير من طريقة تحديد موقع لوح الكتف. توفر لنا هذه الطريقة طريقة سريعة ودقيقة لتحديد الموقع ، مما يساهم في اتساق نموذج الإصابة.

الحد الأدنى من غزو البروتوكول الحالي واضح في ثلاثة جوانب رئيسية. أولا ، بعد تحديد الموقع ، يتم سحب العضلات المجاورة للعمود الفقري عند مستوى T9 فقط عن طريق المبعدات الدقيقة ، دون الإضرار بالعضلات عند مستويات T8 أو T10. إلى جانب ذلك ، فإن تعرض الصفيحة بواسطة المبعدات الدقيقة لا يتداخل مع المجال البصري. ثانيا ، فقدان الدم ، والذي يكون في الغالب من استئصال الصفيحة الفقرية ، والذي قد يتسبب في تدفق الدم من العظم الملغي ، منخفض جدا في إجراء العملية ، ولا يزيد تقريبا عن حجم تلطيخ قطعة قطن مثلثة 2 مم × 2 مم × 3 مم. ثالثا ، تم إجراء استئصال الصفيحة الفقرية على المنطقة المطلوبة إلى أقصى حد ، مع الحفاظ على استمرارية الجزء الجانبي من الصفيحة وتخفيف عدم استقرار الفقرة بشكل كبير. مقارنة بالبروتوكولات السابقة^16,17 ، يقلل البروتوكول الحالي من الكثير من الأضرار غير الضرورية.

لتقييم الدرجات المختلفة ل SCI ، تمت مقارنة النتائج بين جميع المجموعات في علم أمراض الأنسجة مع ما أظهرته الدراسات السابقة بالفعل⁹،^11،18. هذه النتائج كافية لإكمال دراسة رصدية لدرجات مختلفة من الإصابة والتغيرات في فترات مختلفة. أظهر HE و immunofluorescence أنه مع زيادة شدة اصابات النخاع الشوكي ، ظهر مورفولوجيا أكثر شذوذا في أنسجة الحبل الشوكي ، كما أدت الزيادة في درجة الضرر إلى زيادة في درجة الاضطراب الهيكلي للحبل الشوكي. من منظور مراقبة مورفولوجيا الأنسجة ، فإن درجة وانتظام تغيرات مورفولوجيا الأنسجة في كل مجموعة تجريبية في هذه الدراسة تتفق إلى حد كبير مع الدراسات السابقة.

وفقا لنتائج الاختبار النسيجي الحالية ، يشار إلى تغييرات واضحة في المؤشرات المختلفة بعد درجات مختلفة من اصابات النخاع الشوكي المؤلمة ، مما يؤكد بشكل أكبر موثوقية النموذج المحدد في هذه الدراسة.

على الرغم من دقة وفعالية هذه التقنية ، يمكن أن توجد قيود محتملة على الأساليب. فيما يتعلق باستئصال الصفيحة الفقرية ، يجب أن يكون المشغل ماهرا في العمليات تحت المجهر لمنع تلف الحبل الشوكي عن طريق الخطأ. أيضا ، يعتمد إعداد النظام الأساسي بأكمله على الهياكل الميكانيكية ، مما يؤدي إلى زيادة الطلب على المشغل مقارنة بالمعدات الآلية. في الواقع ، يمكن تحسين جميع المشاكل المذكورة عن طريق التدريب المتكرر للعملية.

يمكن ملاحظة أن النمذجة طفيفة التوغل والموحدة مفيدة في جعل النتائج أكثر اتساقا واستقرارا وقابلية للتكرار ، وتقييم فعالية خطط العلاج المختلفة بدقة ، وتحسين خطة البحث لإصابات النخاع الشوكي المؤلمة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% fixative solution	Solarbio	P1110	4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody	abcam	ab8135	Dilution ratio (1: 2000)
Eosin Staining Solution (water soluble)	biosharp	BL727B
Ethanol	Fuyu Reagent	64-17-5
Fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X800
Frozen Slicer	leica	CM3050 S
GFAP (GA5) Mouse mAb	Cell Signaling TECHNOLOGY	#3670	Dilution ratio (1: 600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32723TR	Dilution ratio (1: 1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32740	Dilution ratio (1: 1000)
Hematoxylin Staining Solution	biosharp	BL702A
Mice	Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany	C57BL/6J
Microsurgery apparatus	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	All the surgey instruments are custom-made	Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution)	Zhong Shan Jin Qiao	ZLI-9022	working solution
O.C.T. Compound	SAKURA	4583
PBS (phosphate buffered solution)	Solarbio	P1020	pH 7.2-7.4
RWD Laboratory inhalation anesthetic station	RWD Life Science Co., Ltd	R550
Small animal in vivo microCT imaging system	PerkinElmer	Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Custom-made(Feng's standard)	(https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1)
Surgery microscope	Zumax Medical Co., Ltd.	zumax, OMS2355
TBST (Tris Buffered Saline+Tween)	Solarbio	T1082	Dilution ratio (1: 19)
Xylene	Fuyu Reagent	1330-20-7