הקמת מודל פגיעה בעמוד השדרה של חבלה בעכבר המבוסס על טכניקה זעיר פולשנית

Summary

טכניקות זעיר פולשניות ומכשיר מעבדה פשוט משפרים את יכולת השכפול של מודל הפגיעה בחוט השדרה על ידי הפחתת הנזק האופרטיבי לחיות הניסוי ומתן אפשרות לתחזוקה של המורפולוגיה האנטומית. השיטה כדאית משום שהתוצאות האמינות וההליך הניתן לשחזור מקלים על חקירת מנגנוני תיקון המחלה.

Abstract

שימוש בשיטות זעיר פולשניות למודל פגיעה בחוט השדרה (SCI) יכול למזער הבדלים התנהגותיים והיסטולוגיים בין חיות ניסוי, ובכך לשפר את יכולת השחזור של הניסויים.

שיטות אלה צריכות להתמלא שתי דרישות: בהירות המסלול האנטומי הניתוחי ופשטות ונוחות של מכשיר המעבדה. באופן מכריע עבור המפעיל, מסלול אנטומי ברור מספק חשיפה זעיר פולשנית, אשר מונעת נזק נוסף לחיה הניסיונית במהלך ההליכים הכירורגיים ומאפשרת לבעל החיים לשמור על מורפולוגיה אנטומית עקבית ויציבה במהלך הניסוי.

במחקר זה נחקר השימוש בפלטפורמה משולבת חדשנית הנקראת פלטפורמה קואקסיאלית SCI לפגיעה בחוט השדרה בחיות קטנות כדי לחשוף את חוט השדרה ברמת T9 בצורה זעיר פולשנית ולייצב ולשתק את החוליה של עכברים באמצעות מייצב חוליות, ולבסוף, משפיע כבידה קואקסיאלי משמש כדי לקונן את חוט השדרה של עכברים להתקרב לדרגות שונות של פגיעה בחוט השדרה T9. לבסוף, תוצאות היסטולוגיות מסופקות כהפניה לקוראים.

Introduction

פגיעה טראומטית בחוט השדרה (SCI) גורמת בקלות לאדם לתוצאות חמורות¹; עם זאת, אין כיום טיפול יעיל ^1,2. מודלים של חבלה בבעלי חיים הם אחת השיטות העיקריות לחקר SCI ^3,4.

בין השנים 2004 ל-2014⁴, חולדות שימשו כאורגניזמי מודל ב-289 מתוך 407 מחקרים (71%) ועכברים ב-69 (16.9%). ואכן, שיעור הניסויים בעכברים גדל בהדרגה עם השנים בשל יתרונותיהם על פני מודלים אחרים, במיוחד הפוטנציאל הגדול למחקרי ויסות גנים ^3,4,5. לכן, נדרשים כלים תואמים יותר כדי לערוך מחקרים נוספים המשתמשים בעכבר כמודל בגלל החשיבות הרבה המיוחסת לעקביות המודל⁶. המכשירים הנפוצים שדווחו במחקרים קודמים מבוססים בעיקרון על עקרון ההשפעה של חוט השדרה של אלן, למשל, משפיע ירידת המשקל הבסיסי^7,8, המשפיע על אוניברסיטת ניו יורק (NYU)/ מחקרי פגיעה בחוט השדרה של בעלי חיים רב-מרכזיים (MASCIS)^1,9, ומשפיע האופק האינסופי (IH) ^10,11 . משפיע ירידת המשקל ומשפיע NYU/MASCIS חולקים את אותו עיקרון של הכוונה לחוט השדרה הממוקד והטלת משקל קבוע מגבהים שונים כדי ליצור חומרת פציעה שונה. משפיע ה- IH יוצר את הפגיעה בחוט השדרה על פי כוחות שונים.

לנוחות בשימוש במודל העכבר במחקרי SCI וכדי לבסס את הבסיס לשיטות טיפול יעילות, פותחה פלטפורמה משולבת לפגיעה בחוט השדרה של עכבר, הנקראת פלטפורמה קואקסיאלית לפגיעה בחוט השדרה (SCICP). הפלטפורמה מורכבת מארבעה מרכיבים עיקריים: (1) שולחן ניתוח לבעלי חיים המיועד לתנוחה מתאימה לעכברים המופעלים, שהוא קומפקטי מאוד ומספק נוחות ללא הגבלת מיקום; (2) מיקרו-משענת משני הצדדים להחזקת השרירים הפרא-חולייתיים במהלך הפעולה; (3) מייצב חוליות שיחזיק את החוליה לפני הליך ה-SCI (שני מייצבי חוליות זמינים להפעלה בבעלי חיים גדולים יותר כגון חולדות); (4) שרוול, קצה משפיע, משקולות וסיכת משיכה. יש להרכיב את שלושת החלקים לזרוע X-Y-Z נשלפת. לצורך מיקוד מדויק, קצה הפגיעה ממוקם על פני חוט השדרה, וזרוע ה- X-Y-Z יורדת בעדינות לגובה הצפוי בעזרת הסימן שבין קצה הפוגע לשרוול. קצה הפגיעה עשוי מסגסוגת אלומיניום של 0.12 גרם כדי למנוע נזק לחוט השדרה המיוחס לדחיסת משקל גדולה לפני ההליך. פין המשיכה נועד להחזקת המשקולות בחלק העליון של השרוול כדי להכין את ירידת המשקל (איור 1).

במחקרים קודמים, חטיבת כוח ההשפעה הוגדרה על פי נתוני כוח ההשפעה של מכשיר IH, שהם 30 Kdyn, 50 Kdyn ו- 70 Kdyn, בהתאמה ^6,10. במהלך תהליך המחקר הוכחו דרגות סידוריות של מודלים של SCI על בסיס SCICP, אשר ניתן להשתמש בהם במחקרים שונים. לכן, לפני תחילת הניסוי באופן רשמי, כוחות ההשפעה שנוצרו על ידי משקלים שונים של מסות שונות נבדקו באמצעות מכשיר בדיקת לחץ שיא. כתוצאה מכך, נבחרו שלושה מודלים סטנדרטיים של עכברי SCI מייצגים כשלוש דרגות שונות של פגיעה, כולל קבוצות קלות, בינוניות וחמורות מדורגות,^{בהתאמה 6,10}, והמשקולות שוחררו באותו גובה, עם משקל של 1.3 גרם עבור קל^, 2.0 גרם עבור בינוני ו-2.7 גרם עבור נזק חמור.

כאמצעי נוסף להבטחת יכולת תפעול ודיוק, מדווחת גישה ניתוחית חדשנית וזעיר פולשנית. באמצעות חקר האנטומיה של עכברים רגילים, נמצאה שיטה חדשה לאיתור החלל הבין-ספיני של T12-T13. שיטת איתור החוליות בשלבי הפעולה קלה לשליטה ומדויקת, מה שמבטיח איתור מדויק לפעולות זעיר פולשניות.

יש לקוות שטכניקה זו של פגיעה בקונטוזיה עשויה לסייע במחקר ובהבנה של פגיעה בחוט השדרה, כולל הבנת פתופיזיולוגיה, הערכת ניהול וכן הלאה.

Protocol

הערה: כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה האתית והרווחה של חיות מעבדה של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת שאנדונג Cheeloo (מספר אישור: 21L60) ובוצעו על פי המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (פרסומי NIH מס '85-23, מתוקן 1996).

1. מנגנון הפלטפורמה הקואקסיאלית של פגיעה בחוט השדרה ובדיקות מכניות

1. הרכיבו את הפלטפורמה עם שולחן ניתוחים כירורגי, מייצב חוליות וקצה משפיע (איור 1).
   הערה: שמור על ירידת המשקל וחריצי הפליטה, המונעים מהמשקל להיתקל בזרמי אוויר, נקיים, מכיוון שכל לכלוך על ירידת המשקל או השרוול עלול להשפיע על דיוק הפלטפורמה.
2. הכניסו את הקצה, המאפשר איתור מדויק של חוט השדרה, לתוך השרוול.
3. בחר מסות מתאימות של טיפות המשקל לניסוי, שהן 1.3 גרם, 2.0 גרם ו -2.7 גרם עבור הקבוצות המתונות, הבינוניות והחמורות, בהתאמה.
4. חבר את סיכת המשיכה לחורים של ירידת המשקל.
5. הרכיבו את ירידת המשקולת לחלק העליון של השרוול עם פין המשיכה המותקן בחריץ על זרוע X-Y-Z, כך שלאחר השלמת האיתור, המשקולת משתחררת כדי לפגוע בקצה המשפיע, וכתוצאה מכך מכניסה את חוט השדרה, ושינויים בחוט השדרה נצפים מתחת למיקרוסקופ.
6. התאם את זרוע X-Y-Z הנשלפת בגודל 0.1 מ"מ מדויקת לנוחות המפעיל כדי לספק מרחב עבודה הולם (איור 1D, E).
   הערה: כדי לאשר את עקביות תוצאות המחקר, לפני תחילת הניסוי, מדוד את הכוח שנוצר כאשר המשקל נשמט בתוך השרוול באמצעות מכשיר זיהוי לחץ שיא. חזרה על אישור אינה הכרחית למחקרים עתידיים.
7. הפעל את המכשיר, הנח את קולטן הלחץ המתכתי מתחת לקצה, אפס את המתאם, שחרר את פין המשיכה ורשום את כוח הפגיעה בפועל.

2. איתור וכריתת למינקטומיה של חוליית החזה^{התשיעית} (T9)

הערה: נקבות C57BL/6J עכברים בני 9-10 שבועות נרכשו מחברת החיות הניסיונית Jinan Pengyue (ג'ינאן, סין).

1. אוטוקלב חבילת מכשירי ניתוח לניסוי ועקר את שולחן הניתוחים ב-75% אלכוהול לפני הניתוח.
2. להזריק buprenorphine עבור משכך כאבים (0.05-2.0 מ"ג / ק"ג, SQ) 30 דקות לפני הרדמה עבור פעולות פציעה. לאחר מכן, להרדים את העכבר עם isoflurane (אינדוקציה: ~ 3%-5%, תחזוקה: ~ 1.5%-2%). בדוק אם החיה מורדמת לחלוטין על ידי רפלקסים של זנב או צביטה בבוהן. ברגע שההרדמה בתוקף, הניחו את העכבר בתנוחה נוטה בחלק ייעודי של שולחן הניתוחים וצפו את הקרנית במשחה אופטלמית (מרחו משחה אופטלמית על הקרניות כדי להגן על העיניים מפני התייבשות במהלך הניתוח).
   1. לגלח את השיער מן caudal כדי rostral עם מכונת גילוח חשמלית מעל עמוד השדרה thoracolumbar. לעקר את העור מספר פעמים בתנועה מעגלית עם יודופור במשך 30 שניות ואחריו 75% אלכוהול. החל וילון כירורגי סטרילי ולעשות חתך אורכי של כ 1.5 ס"מ על העור מ כ T6 עד T13 עם אזמל ולהב.
      הערה: מישוש לאורך השוליים הקוסטליים עד לקו האמצע, שם ממוקם החלל הבין-ספיני T12-T13. בצע חתך של 1.5 ס"מ לרוסטרל, והחתך הוא בערך סמוק עם חוליות T6-T13.
3. חקור את הצלע ה-13 בצד אחד מהחלק הגרמי שמתחת למיקרוסקופ ההפעלה. חקור את התהליך הסיבובי בקו האמצע על ידי נגיעה קלה באזור הזווית הקוסטוברטבלית ולאחר מכן לכיוון הרוסטרל כדי לאתר את החלל הבין-ספיני של T12-T13. חקור את המרחב הבין-ספיני של T9-T10 מהמרחב של T12-T13 לצד הרוסטרלי. (איור 2A, 3A)
4. נתחו את השריר הפאראספינלי לאורך התהליך הסיבובי של ה-T9 אל מפרקי הפאצט הקדמיים והאחוריים של שני הצדדים באמצעות מיקרו-מספריים (איור 3B). החזירו את השרירים הפאראספינליים עם מיקרו-רטרקטורים ונקו את הרקמה הרכה על הלמינה ובמרחב הבין-ספיני של T8-T9 ו- T9-T10 עם מספריים זעירים.
5. בצע T9 laminectomy, להדק את התהליך הסיבובי של T9 עם מלקחיים microsurgery, להרים אותו מעט למעלה, להחדיר את מספריים מיקרו במקביל לאורך הצד הגבי הימני של lamina, הימנעות נזק חוט השדרה, לחתוך את lamina עם מספריים מיקרו. חזרו על הפעולה בצד שמאל, וחוט השדרה יכול להיחשף (איור 2B, 3C).
6. לפני תיקון החוליה, שחררו את הזרוע האוניברסלית, ומהדקים באיטיות את מפרקי הפאה ה-9 עד ה-10 משני צידי החוליה בעזרת מלקחיים זעירים של מייצב החוליות. הדקו את הברגים על מלקחיים מיקרו יתושים, וכך החוליה מתייצבת. התאימו את חוט השדרה למישור האופקי, הדקו את הזרוע האוניברסלית והחוליה תהיה קבועה (איור 3D).

3. פציעת חבלה T9

1. ברגע שחוט השדרה ברמת T9 נחשף והחוליה מקובעת, כוון אל חוט השדרה דרך הקצה שבתוך השרוול מתחת למיקרוסקופי הניתוחי (איור 3E).
2. בדוק אם פני השטח של הקצה מקבילים לחוט השדרה מההיבטים האחוריים והרוחביים של חוט השדרה, שכן קל לראות את היחסים בין חוט השדרה לבין הקצה מתחת למיקרוסקופ, וכי ניתן להפוך את שולחן הניתוחים בקלות.
3. בדוק אם פני השטח של הקצה מקבילים לגבולות הדו-צדדיים של הלמינה החסכה לפני שהקצה נמצא במגע עם חוט השדרה לאחר כריתת הלמינציה מכיוון שמדובר במישור ייחוס טבעי המקביל לחוט השדרה.
4. לאחר איתור החלל הבין-ספיני של T12-T13, הורידו את השרוול עד שסוף המשפיע עולה בקנה אחד עם הסימן על חלון התצפית ומגיעים לגובה שצוין של 22 מ"מ. שלפו את פין המשיכה כדי לשחרר את המשקל (1.3 גרם, 2.0 גרם, או 2.7 גרם בהתאם לקבוצה, כאשר כל קבוצה כוללת 3 עכברים ולכל קבוצה יש עכבר אחד לכל נקודת זמן).
   הערה: חוט השדרה צריך להיות מקביל לקרקע וניצב לקצה; הזז את שולחן הניתוחים כדי להבטיח את שדה הראייה המיקרוסקופי, מכיוון שהשולחן קומפקטי מאוד.
5. הסר את המשפיע כאשר החבלה נעשית ובחן את מידת ה- SCI תחת מיקרוסקופ ההפעלה. בקבוצה המתונה ניתן לראות שינוי בצבע אדום בהיר, בעוד שבקבוצה המתונה, אתר הפציעה מציג אדום כהה ב 3-4 שניות, ואולי, ניתן לראות. בקבוצה החמורה, הביטויים האדומים הכהים עשויים להופיע מיד, והבולטות הברורה בדורה באה לידי ביטוי, אך הדורה עדיין במצב עקבי (איור 3F).
6. תפר את החיתולית והעור השטחיים עם תפרים (תפר פוליפרופילן שאינו נספג, גודל: 6-0).
7. לאחר השלמת התפר, לעקר את אזור הניתוח, להניח את העכבר על כרית מבוקרת טמפרטורה עד להכרה מלאה משוחזר, ולאחר מכן לשים את העכבר בכלובי העכבר.

4. טיפול בבעלי חיים

1. מניחים את החיה על כרית החימום להתאוששות ומתבוננים בתנועה של שתי הגפיים האחוריות.
   הערה: אין להחזיר בעלי חיים שעברו ניתוח לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמתם המלאה.
2. שים דיאטה עשירה במים על רצפת הכלוב, כך שבעלי חיים יכולים להגיע בקלות למזון. לחלופין, השתמשו בכלוב עם שולחן האכלה תחתון.
3. יש לרוקן את שלפוחית השתן של העכברים פעמיים ביום לאחר הניתוח, משום שקשה לקבוצות הפגיעה הבינונית והחמורה לשקם את תפקוד שלפוחית השתן. להזריק buprenorphine עבור משכך כאבים (0.05-2.0 מ"ג / ק"ג, SQ) 8-12 שעות / יום במשך 3 ימים.

5. זלוף שריר הלב, הכתמה וחיזוק חיסוני

1. בימים הראשון, ה-28 וה-56 לאחר הפציעה, הקריבו עכבר אחד מכל קבוצה, בהתאמה, על ידי זלוף.
   1. הוסיפו לעכברים 60 מ"ל של מי מלח עם מאגרי פוספט (PBS) ו-20 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד לאחר הרדמה מוגזמת (4%-6% איזופלורן).
   2. לאסוף את עמוד השדרה עם מספריים מיקרו, הרחבת rostrally ו caudally 1 ס"מ, בהתאמה, ממרכז הנגע.
   3. כרתו את השרירים העודפים, שמרו מקטעי עמוד שדרה שלמים עם צלעות חלקיות למכשירים להחזיק בשלב 5.1.4 והשרו אותו ב-4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות.
   4. מהדקים את הצלעות במלקחיים המוסטטיים לקיבוע ומגדירים את מרכז הנגע מתחת למיקרוסקופ על פי הלמינה הכרתית ושינוי הצבע במרכז הנגע של חוט השדרה.
   5. כרתו את כל התהליכים הלמינאיים והמפרקיים בעזרת מיקרו-מספריים מהקאודל.
   6. חותכים את שורשי העצבים עם מיקרו מספריים ומוציאים את חוט השדרה.
   7. לאסוף 0.5 ס"מ של חוט השדרה המשתרע caudally ו rostrally, בהתאמה, ממרכז הנגע עם מספריים מיקרו.
   8. שים את חוט השדרה ב 30% סוכרוז ב 4 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
2. חותכים את הרקמות למקטעים בעובי 6 מיקרומטר לאחר ההקפאה בהתאם לסוג הבדיקה ההיסטולוגית.
3. בצע צביעת המטוקסילין ואוזין (H&E).
   1. מחממים את המקטעים לטמפרטורת החדר ומשרים את המקטעים בעובי 6 מיקרומטר בפורמלדהיד של 4% למשך כ-15 דקות, ולאחר מכן משרים PBS 1x למשך דקה אחת ארבע פעמים כדי להסיר את שאריות ה-OCT.
   2. מכתימים את החלקים בהמטוקסילין למשך 90 שניות, ושוטפים במים מזוקקים כפולים.
   3. לאחר מכן, לשטוף את החלקים עם מים זורמים במשך 3 דקות.
   4. יש להכתים עם eosin למשך 4 דקות ולהשרות ב-95% אלכוהול למשך 30 שניות פעמיים כדי לשטוף את עודפי האוזין.
   5. לבסוף, התייבשו עם אלכוהול הדרגתי (95% אלכוהול ו-50% אלכוהול פעם אחת, ברצף) למשך 30 שניות והשרו את הקסילן לשקיפות למשך 2 דקות. לאחר מכן, אטמו את הדגימות בג'ל שרף (מקטע מישור קורונלי: איור 4; מקטע מישור סגיטלי: איור 5).
4. בצע צביעה אימונופלואורסצנטית.
   1. מחממים מחדש את החלקים לטמפרטורת החדר ומשרים את החלקים בעובי 6 מיקרומטר בפורמלדהיד של 4% למשך כ-2 דקות.
   2. לשטוף את החלקים ב TBST במשך 5 דקות במשך שלוש פעמים.
   3. לדגום את החלקים עם תמיסה חוסמת (10% עז סרום רגיל ב- PBS) ולחסום למשך שעה אחת כדי לחסום קשירה לא ספציפית של אימונוגלובולין.
   4. דגירה של מקטעי חוט השדרה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם חלבון חומצי נגד גליה (GFAP, סמן לאסטרוציטים תגובתיים), נוגדן פוליקלונלי (1:600) ונוגדן נגד NF200 ארנב (1:2000), סמן לנוירופילמנט ב-0.4 מ"ל של תמיסה חוסמת.
   5. שטפו את החלקים עם PBS והוסיפו 0.4 מ"ל של תמיסת חסימה עם IgG מצומד נגד עזים Alexa 594-מצומד (1:1,000) ונוגדנים משניים נגד עיזים Alexa 488-מצומדים IgG (1:1,000) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   6. צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בגודל 10x באמצעות סריקה פנורמית אוטומטית באורכי גל של 594 ננומטר ו-488 ננומטר, בהתאמה (איור 6).
      1. הפעל את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, הנח את המגלשה על במת המיקרוסקופ, עבור לערוץ הפלואורסצנטי, השתמש במקש המיקום כדי למקם שלוש עד ארבע נקודות על הרקמה, והתמקד בהשלמת הצילום. לאחר סיום הצילום, שמור את התמונות של ערוצים שונים בפורמט הרצוי ולאחר מכן שמור את התמונה הממוזגת.

תוצאות

כדי לבחון את דיוק המכשיר, נמדד הכוח ששלוש מסות שונות של משקולות עשויות מאותו גובה באמצעות מכשיר בדיקת לחץ שיא. עשרים וארבע בדיקות בוצעו עם קבוצות שונות של משקלים, וכתוצאה מכך (ממוצע ± SD) 0.323 N ± 0.02 N עבור 1.3 גרם משקולות, 0.543 N ± 0.15 N עבור 2.0 גרם משקולות, ו- 0.723 N ± 0.26 N עבור משקולות 2.7 גרם (איור 7). מחקרים קודמים אימצו את dyne (dyn) או Kilodyne (Kdyn) כיחידות למדידת עוצמות החבלה. להשוואה טובה יותר עם מחקרים קודמים, ההמרות בין ניוטון (N) לבין דיין/קילודין מפורטות (1 N = 1 ק"ג × 1 m/s 2 = 1 × 10 3 גרם × 1 × 100 ס"מ לשנייה² = 1 × 10⁵ dyn; 0.323 N = 32.3 Kdyn; 0.543 N = 54.3 Kdyn; 0.723 N = 72.3 Kdyn).

טבלה 1 ותרשים 4 מציגים נתונים של נגעים של קבוצות קלות, בינוניות וחמורות בחתכים קורונליים. אם לשפוט על פי איור 4, ביום ה-28 שלאחר הפציעה, ההמשכיות של גבולות החומר האפור והלבן הניתנים להבחנה בקבוצות המתונות, הבינוניות והחמורות פחתה ברצף, כאשר שטח הרקמה הצלקתית גדל ושיעור הולך וגדל בחתך הרוחב של מרכז הנגע. היו הבדלים מורפולוגיים ברורים בכל קבוצות הניסוי בהשוואה לקבוצה הרגילה. זה הוכיח את הרציונליות של חלוקת דרגות הפציעה בקבוצות הניסוי.

טבלה 2 ואיור 5 מתארים פגיעה בחוט השדרה בימים 1 ו-56 לאחר הפציעה בניתוחים סגיטליים. ניתן לראות כי אזור הנגע גדל בהדרגה באופן משמעותי מקבוצות קלות עד קשות ביום הראשון לאחר הפציעה. בינתיים, ההמשכיות של החומר הלבן משני צידי חוט השדרה הייתה טובה יותר בקבוצה המתונה, עם vacuoles עגולים קטנים נצפים, שהם המאפיינים של בצקת interstitial. בקבוצה המתונה, החומר הלבן הפגין המשכיות לקויה, ומבנה החומר הלבן הגחוני לא היה מסודר. בקבוצה הקשה, החומר הלבן הגחוני הפגין הפרעה חמורה יותר, ושטח גדול של החלל הופיע במרכז הפציעה. בנוסף, הרקמה שמסביב הראתה מילוי ברור של תאי הדם האדומים, ותאי הדם האדומים ליד התעלה המרכזית שנאספו לרצועות. ביום ה-56 לאחר הפציעה נצפתה היווצרות צלקת במרכז הפציעה של שלוש הקבוצות, ששטחן גדל בהתאם לחומרת הפציעה.

ניתן לגזור את שלמות הנוירופילמנט של חוט השדרה ביום ה-56 שלאחר הפציעה גם מניתוח תוצאות הכתם האימונופלואורסצנטי (איור 6). האיור מראה גם כי אסטרוציטים יוצרי צלקת חופפים נראו במרכז כל שלוש קבוצות הפציעות, כאשר אורך אזור הפציעה גדל עם חומרת הפציעה, בעוד קוטר הצלקת ירד. זה מצביע על נוכחות של התכווצות צלקת, אשר עשוי להוביל לירידה בקוטר חוט השדרה.

איור 1: תערוכה שלמה וחלקים של הפלטפורמה הקואקסיאלית של פגיעה בחוט השדרה . (A) ניתן להפריד בין זרוע X-Y-Z לבין שולחן הניתוחים, מה שמשאיר מקום הולם להליך הניתוח שבמהלכו נחשף חוט השדרה של בעל חיים קטן. ניתן להזיז את שולחן הניתוחים בחופשיות במהלך הפעולה, ובכך להפחית את הקושי התפעולי הפוטנציאלי המיוחס למגבלות המיקום. לגוף מייצב החוליות יש זרוע אוניברסלית בעלת שלושה מפרקים לסיוע בכיוון, מה שמגדיל את גמישותו. (B) הכניסו את קצה הפוגע לשרוול והרכיבו את האחרון לזרוע X-Y-Z. הכניסו את קצה סיכת המשיכה לתוך חורי המשקולת כדי למנוע את ירידת המשקולת והכניסו את המשקולת לשרוול. כאשר החלקים מורכבים, אתר את אזור הפגיעה הממוקדת מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, הורידו את זרוע ה-X-Y-Z עד שסוף קצה הפגיעה תואם את המפלס התחתון של חלון התצפית, מה שמעיד על כך שהגיע לגובה חבלה אחיד (הגובה בין המשקל לקצה הפוגע הוא 22 מ"מ כאשר הנפילה מתחילה). משוך את סיכת המשיכה, וההשפעה תיעשה. (C) לאחר חשיפת אזור הפציעה, השתמש בקליפסים כדי להדק ולקבע את עמוד השדרה של העכבר ואת הבריח המתהדק כדי לייצב את מייצב החוליות. (D) פונקציות מומלצות לחריצים על שולחן הניתוחים. החיה הניסיונית אמורה להיות ממוקמת בחריץ האמצעי, עם הראש לכיוון החלק הקדמי, החזי על המדרון. זרוע X-Y-Z מופרדת משולחן הניתוחים. (E) תצוגה של ה-SCICP המורכב. חצים מציינים את החלקים. כאשר הקצה מכוון לאזור חבלת המטרה, כדי להתחיל את הקונטוזיה, משוך את פין המשיכה, והמשקל יירד על קצה הפגיעה כדי להחדיר את חוט השדרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: גרף הדמיה של שיטת איתור החוליות הקוסטוברטברליות T13. (A) הצלע ה-13 וה-T13 הם מבנים אנטומיים קבועים יחסית. ניתן לזהות בקלות את הזווית הקוסטוברטברלית T13 תחת המיקרוסקופ, ממנה המפעיל יכול לחקור לכיוון התהליך הסיבובי ולמצוא את החלל הבין-ספיני T12-T13. לאחר מכן, בדקו את הצד הרוסטרלי ברצף כדי למצוא את חוליית הפגיעה במטרה (לדוגמה, T9). (B) כריתת חזה תשיעית זעיר פולשנית יכולה לשמר מפרקי למינה ופאצט נאותים בין גופי חוליות סמוכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: חשיפה וקונטוזיה של חוט השדרה ברמת T9 בעכברים . (A) לחקור את הזווית הקוסטוברלית T13. (B) כאשר השריר הפרה-ספינלי נסוג על-ידי מיקרו-רטרקטורים כדי לפנות מקום מתאים לפעולה, חשוף את ה-T9. (C) ביצוע כריתת למינקטומיה T9 עם מיקרו מספריים. (D) לייצב את החוליה בעזרת התפסים של מייצב החוליות. (E) כוון לאזור קונטוזיה של המטרה עם קצה ההשפעה. (ו) בצקת וגודש מצוינים באזור הפציעה לאחר החבלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: מקטעים מייצגים ביום ה-28 לאחר דרגות שונות של SCI בעכברים (חתכים קורונליים). (A) חוט השדרה החזי התקין של העכבר. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) עבור הקבוצה המתונה, ניתן להבחין בפגיעה קלה בהיבט הגבי של חוט השדרה, בעוד המורפולוגיה של החומר הלבן החסכון והחומר האפור נשמרת באופן משמעותי. (C) עבור הקבוצה המתונה נצפתה רקמת צלקת ברורה בחוט השדרה (מסומנת על ידי הכוכבית האדומה). בקושי ניתן להבחין בין המאפיינים המבדילים בין החומר הלבן לחומר האפור. (D) באופן יחסי, חוט השדרה של הקבוצה הקשה כמעט איבד את המורפולוגיה המקורית שלו וכמעט הוחלף ברקמה צלקתית. הקו המקווקו הירוק מציין את שטח הנזק, והקו המקווקו השחור מציין את גבול החומר האפור הנצפה. ככל שחומרת הפציעה גדלה, נגע גדול יותר ומבנה פחות חסכן הופיע בחוט השדרה של העכבר, כאשר גבול החומר האפור בקושי ניתן להבחין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: מקטעים מייצגים ביום הראשון וה-56 לאחר פגיעה בחוט השדרה של עכברים (מקטעי סגיטל). (A) חוט השדרה החזי התקין של העכבר. (B) B1-B3 מייצגים, בהתאמה, את חוט השדרה ביום הראשון לאחר הפציעה בקבוצות קלות, בינוניות וקשות. ניתן לראות שככל שהנזק גדל, שטח גדול יותר שובש או נוזל במרכז הנגע. ההמשכיות של החומר הלבן בחוט השדרה הגחוני הייתה שונה עקב עוצמות פציעה שונות. B1 מראה כי החומר הלבן בחוט השדרה הגחוני יש המשכיות טובה יותר עם בצקת קלה. B2 מראה המשכיות ירודה יותר של החומר הלבן בחוט השדרה הגחוני ובצקת חמורה יותר. הרקמה במרכז ה-B3 SCI איבדה כמעט כל המשכיות, ויש בצקת נרחבת באזור שמחוץ למרכז הפציעה. (C) C1-C3 מייצגים, בהתאמה, את חוט השדרה ביום ה-56 לאחר הפציעה בקבוצות הקלות, הבינוניות והקשות. דרגות שונות של התכווצות צלקת באו לידי ביטוי במרכז הפגיעה בין קבוצות שונות, והיה הבדל משמעותי בקוטר אזור הפציעה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 6: מקטעים מייצגים ביום ה-56 לאחר פגיעה בחוט השדרה בעכברים (מקטעים סגיטליים). (A) החלק הייצוגי של הקבוצה המתונה. NF200 מציין את הנוירופילמנט, בעוד GFAP מציין אסטרוציטים. אסטרוציטים חופפים נצפים במוקד הנגע, בעוד שהנוירופילמנט בחלק הגחוני של חוט השדרה נמצא בהמשכיות טובה. (ב) החלק הייצוגי של הקבוצה המתונה. שני מרכזי צלקת ניתן לראות (מסומן על ידי כוכביות אדומות) בנוסף אסטרוציטים חופפים, בעוד neurofilament בהיבט הגחון יש המשכיות. (C) חלק מייצג של הקבוצה החמורה, עם טווח נגעים גדול ואסטרוציטים מסיביים יוצרי צלקת. לא נצפה מרכז צלקת ברור, ולנוירופילמנט יש המשכיות לקויה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7: כוח שנוצר מאותו גובה אך עם משקלים שונים. לפני הניסוי, הכוח שנוצר על ידי מסות שונות של משקולות ששוחררו מאותו גובה זוהה באמצעות מכשיר גילוי לחץ שיא. לאחר שכל קבוצה השלימה 24 גילויים, התקבלו נתוני כבידה אמינים יותר לייחוס הכוח המכה. הנתונים נותחו באמצעות התוכנה הסטטיסטית SPSS19.0. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD, n = 24 בכל קבוצה. ההשוואות בין קבוצות נוספות התבססו על ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ששימש לבדיקת ההבדלים; p < 0.05 נחשב למובהק סטטיסטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

28 dpi
קבוצה	GMR (%)	WMR (%)	ד"ר (%)
רגיל	35.44	64.57	0
מתון	11.59	64.88	23.53
מתון	0	41.14	58.86
חמור	0	0	100

טבלה 1: שיעור החומר הלבן, החומר האפור והנזק ביום ה-28 לאחר הפציעה. קיצורים: dpi = ימים לאחר הפציעה, DA = אזור פגום; GMR = קצב החומר האפור; WMR = קצב החומר הלבן; DR = שיעור פגום.

קבוצה	1dpi DA (μm2)	56dpi DA (μm2)
רגיל	0	0
מתון	2391250	666091
מתון	4383381	1263191
חמור	5118833	1943962

טבלה 2: השוואות בין הנגע בקטעים סגיטליים ביום הראשון וה-56 לאחר הפציעה.

Discussion

באמצעות ההליך הסטנדרטי, ניתן לקבל נתונים יציבים, במיוחד בניסויים קטנים בבעלי חיים in vivo , אשר יכולים למזער את סטיית התוצאות הנגרמת על ידי הבדלים בודדים בין בעלי החיים. בהתבסס על התנאים לעיל ומכשירי יישום נוחים, ניתן לקבוע מודלים סטנדרטיים, פולשניים, מדויקים וחוזרים על עצמם של SCI.

בשל המעשיות והנוחות שלו, בעבר, משפיע ירידת המשקל שימש בעיקר³. המשפיע שהוצג במחקר זה חולק את אותו עיקרון עם מודל¹² של אלן. למרבה המזל, בשל יתרונות הייצור המדויקים של טכנולוגיית עיבוד שבבי מודרנית, צוות המחקר תכנן משפיע על ירידת משקל עם היתרונות של היותו קל לתפעול, יציב מאוד, ולעתים רחוקות לא מדויק. מכשיר לגילוי לחץ שיא שימש למדידת כוח המשיכה של משקלים שונים. מחקרים קודמים ^6,10 על אפקט האופקים האינסופיים דיווחו כי טווח כוח של ±5 Kdyn החורג מהכוח המיועד מתקבל בקבוצות 30 Kdyn, 50 Kdyn ו- ⁷⁰ Kdyn, מה שמספק התייחסות למחקר הנוכחי במונחים של חלוקת קבוצות ובחירת תואר קונטוזיה. במחקר הנוכחי נמדד מראש הכוח האפשרי של קבוצות שונות, והתקבלו נתונים מדויקים יותר.

קריטי יותר מהמכשיר בניסויים במודלים של בעלי חיים הוא ההבנה והניצול של האנטומיה של העכבר. שימוש טוב באנטומיה יכול להפוך את ההליכים לפולשניים מינימליים. ניתוח זעיר פולשני משפיע ישירות על יציבות המצב התפקודי של חיית הניסוי ועל עקביות התאוששות העכבר לאחר מכן. מחקרים קודמים הראו כי התבססות זעיר פולשנית של מודלים מד"ב מגבירה את יציבות מבנה החוליות ומונעת נזק נוסף הנגרם על ידי חוסר יציבות בעמוד השדרה במהלך ההתאוששות בחולדות¹. הנחת היסוד של ניתוח זעיר פולשני היא שימוש סביר במבנים אנטומיים טבעיים. לכן, האיתור המהיר והמדויק של מקטעי חוט השדרה צריך להיעשות בהתאם למבנה האנטומי של עכברים. כפי שדווח, שיטת ההדמיה שימשה למציאת החוליה¹³. למרות שיש לה דיוק גבוה, בתהליך הפעולה הניסיוני בפועל, לשיטת ההדמיה לאיתור יש את החסרונות של פעולה לא נוחה, זמן פעולה ארוך, רכישת ציוד מורכב ודרישות דיוק ציוד גבוהות. McDonough et al. תיארו את איתור T7 דרך הזוויות הנחותות של עצם השכמה¹⁴, בעוד שעכברים פועלים בשכבת שקר, כך שהזוויות הנחותות המוזכרות אמורות להיות זוויות אחוריות. יתר על כן, שימוש בקצוות השכמה התחתונים כדי למצוא את T7 היא שיטת איתור למיקום מסוים באנטומיה האנושית¹⁵, שאינה מתאימה לעכברים. לבסוף, נתוני Micro-CT אימתו גם את ההשערה שהזוויות האחוריות של עצם השכמה אינן צמודות ל-T7 ללא קשר לשאלה אם העכבר נמצא בתנוחת הגוף הטבעית או הספציפית שלו. McDonough et ^al.14 הזכירו גם את איתור הנקודה הגבוהה ביותר של הגב כאשר העכבר מקושת והגדרת הנקודה הגבוהה ביותר כ- T12. באופן יחסי, במחקר הנוכחי, T9 ממוקם בעזרת T12-T13 interspinous שטח, אשר אינו קשור או מושפע על ידי היציבה של העכבר. חוץ מזה, בשיטה זו, ניתן לאתר בקלות את חוליית המטרה ולהפעיל אותה. יש לחקור את הצלע ה-13 מתחת למיקרוסקופ, לגעת בעדינות באזור הזווית הקוסטוברטברלית, לשרטט קו לכיוון התהליך הסיבובי, ואז לחקור את הרווח בין התהליכים הסיבוביים של T12-T13 לכיוון הראש. צוות המחקר השתמש בחלל הבין-ספיני T12-T13 כדי לאתר את T9 של 12 עכברים. לבסוף, 12 נקבות עכברי C57BL/6J עברו סריקת מיקרו-CT לאחר מיקום T9 וכריתת למינציה. התוצאה של סריקת Micro-CT הצביעה על כך שהלמינה שהוסרה בכל 12 העכברים הייתה T9. תוצאות המיקרו-CT הראו כי כל ה-T9 אותרו במדויק, והדיוק היה גבוה משמעותית משיטת איתור עצם השכמה. שיטה זו מספקת לנו דרך מהירה ומדויקת לאיתור, התורמת לעקביות של מודל הפציעה.

הפולשנות המינימלית של הפרוטוקול הנוכחי בולטת בעיקר בשלושה היבטים. ראשית, לאחר האיתור, השרירים הפרספינליים ברמת T9 נסוגים רק על ידי מיקרו-רטרקטורים, מבלי לפגוע בשרירים ברמות T8 או T10. חוץ מזה, החשיפה של הלמינה על ידי המיקרו-רטרקטורים אינה מפריעה לשדה הראייה. שנית, איבוד הדם, שהוא בעיקר מלמינקטומיה, שעלולה לגרום ליציאת דם מהעצם המבוטלת, הוא נמוך מאוד בהליך הניתוח, כמעט לא יותר מהנפח כדי להכתים חתיכת כותנה משולשת של 2 מ"מ x 2 מ"מ x 3 מ"מ. שלישית, כריתת הלמינקטומיה בוצעה מוגבלת לאזור הדרוש במידה הרבה ביותר, תוך שמירה על המשכיות החלק הצדדי של הלמינה והחלישה מאוד את חוסר היציבות של החוליה. בהשוואה לפרוטוקולים^{הקודמים 16,17,} הפרוטוקול הנוכחי מקטין נזקים מיותרים רבים.

כדי להעריך את הדרגות השונות של SCI, התוצאות בין כל הקבוצות בהיסטופתולוגיה הושוו עם מה שמחקרים קודמים כבר הראו 9,11,18. תוצאות אלה מספיקות כדי להשלים מחקר תצפיתי של דרגות פציעה שונות ושינויים בתקופות שונות. HE ואימונופלואורסצנציה הראו כי עם העלייה בחומרת ה- SCI, הופיעה מורפולוגיה חריגה יותר ברקמת חוט השדרה, והעלייה במידת הנזק הובילה גם לעלייה במידת ההפרעה המבנית של חוט השדרה. מנקודת המבט של תצפית מורפולוגית של רקמות, המידה והסדירות של השינויים במורפולוגיה של רקמות בכל קבוצת ניסוי במחקר זה תואמות מאוד למחקרים קודמים.

על פי תוצאות הבדיקה ההיסטולוגית הנוכחית, מסומנים שינויים ברורים באינדיקטורים שונים לאחר דרגות שונות של SCI טראומטי, מה שמאשר עוד יותר את האמינות של המודל שנקבע במחקר זה.

למרות שהטכניקה מדויקת ויעילה, יכולות להתקיים מגבלות פוטנציאליות לשיטות. לגבי כריתת למינקטומיה, המפעיל צריך להיות מיומן בפעולות מתחת למיקרוסקופ כדי למנוע פגיעה בחוט השדרה בטעות. כמו כן, ההתקנה של הפלטפורמה כולה מבוססת על מבנים מכניים, הגדרת ביקוש גבוה יותר עבור המפעיל לעומת ציוד automized. ואכן, כל הבעיות שהוזכרו ניתן לשפר על ידי הכשרה חוזרת ונשנית של המבצע.

ניתן לראות כי מודלים זעיר פולשניים וסטנדרטיים מועילים בהפיכת התוצאות לאחידות יותר, יציבות יותר וניתנות לחזרה, הערכת היעילות של תוכניות טיפול שונות במדויק, ואופטימיזציה של תוכנית המחקר עבור מדע בדיוני טראומטי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% fixative solution	Solarbio	P1110	4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody	abcam	ab8135	Dilution ratio (1: 2000)
Eosin Staining Solution (water soluble)	biosharp	BL727B
Ethanol	Fuyu Reagent	64-17-5
Fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X800
Frozen Slicer	leica	CM3050 S
GFAP (GA5) Mouse mAb	Cell Signaling TECHNOLOGY	#3670	Dilution ratio (1: 600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32723TR	Dilution ratio (1: 1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32740	Dilution ratio (1: 1000)
Hematoxylin Staining Solution	biosharp	BL702A
Mice	Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany	C57BL/6J
Microsurgery apparatus	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	All the surgey instruments are custom-made	Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution)	Zhong Shan Jin Qiao	ZLI-9022	working solution
O.C.T. Compound	SAKURA	4583
PBS (phosphate buffered solution)	Solarbio	P1020	pH 7.2-7.4
RWD Laboratory inhalation anesthetic station	RWD Life Science Co., Ltd	R550
Small animal in vivo microCT imaging system	PerkinElmer	Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Custom-made(Feng's standard)	(https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1)
Surgery microscope	Zumax Medical Co., Ltd.	zumax, OMS2355
TBST (Tris Buffered Saline+Tween)	Solarbio	T1082	Dilution ratio (1: 19)
Xylene	Fuyu Reagent	1330-20-7