JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نمت الحاجة إلى مناهج جديدة لدراسة مواقع الاتصال الغشائية (MCSs) بسبب الاهتمام المتزايد بدراسة هذه الهياكل الخلوية ومكوناتها. هنا ، نقدم بروتوكولا يدمج تقنيات الفحص المجهري المتاحة سابقا لتحديد وقياس مجمعات البروتين داخل العضيات وبين العضيات الموجودة في MCSs.

Abstract

مواقع ملامسة الأغشية (MCSs) هي مناطق قريبة من الغشاء تسمح وتنظم التبادل الديناميكي للجزيئات الحيوية المتنوعة (أي الكالسيوم والدهون) بين العضيات المتجاورة دون إشراك اندماج الغشاء. MCSs ضرورية للتوازن الخلوي ، ويتم ضمان وظائفها من خلال المكونات المقيمة ، والتي غالبا ما توجد كمجمعات بروتينية متعددة. غالبا ما تتضمن MCSs الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وهي موقع رئيسي لتخليق الدهون وتخزين الكالسيوم الخلوي ، وهي مهمة بشكل خاص للعضيات ، مثل الميتوكوندريا ، والتي يتم استبعادها من مسارات النقل الحويصلي الكلاسيكية. في السنوات الأخيرة ، تمت دراسة MCSs بين ER والميتوكوندريا على نطاق واسع ، حيث تؤثر وظائفها بشدة على التمثيل الغذائي الخلوي / الطاقة الحيوية. بدأ تحديد العديد من البروتينات في مواقع الاتصال هذه ، بما في ذلك الحبال الغشائية وقنوات الكالسيوم وبروتينات نقل الدهون ، مما يزيد من الحاجة إلى منهجيات جديدة ونهج تقنية لدراسة مكونات MCS هذه. هنا ، نصف بروتوكولا يتكون من مناهج تقنية مشتركة ، والتي تشمل مقايسة ربط القرب (PLA) ، وتلطيخ الميتوكوندريا ، وتجزئة التصوير 3D ، والتي تسمح بالكشف عن البروتينات القريبة جسديا (>40 نانومتر) من بعضها البعض والتي توجد على نفس الغشاء في ER-mitochondria MCSs. على سبيل المثال ، استخدمنا اثنين من بروتينات نقل الدهون المثبتة على ER ، ORP5 و ORP8 ، والتي ثبت سابقا أنها تتفاعل وتتمركز في ER-mitochondria و ER-plasma membrane MCSs. من خلال ربط ORP5-ORP8 PLA بتحليل برنامج التصوير الخلوي ، كان من الممكن تقدير مسافة مركب ORP5-ORP8 من سطح الميتوكوندريا وتحديد أن حوالي 50٪ من تفاعل ORP5-ORP8 PLA يحدث في المجالات الفرعية ER على مقربة من الميتوكوندريا.

Introduction

التواصل بين العضيات هو سمة مميزة للخلايا حقيقية النواة. تتمثل إحدى الطرق التي تتواصل بها العضيات في تكوين مواقع ملامسة الغشاء (MCSs) ، وهي عبارة عن تعارضات غشائية قريبة بين عضيتين يتم الحفاظ عليهما بواسطة البروتينات الهيكلية والوظيفية ، مثل الحبال وبروتينات نقل الدهون وقنوات الكالسيوم1. يمكن إنشاء MCSs بين عضيات متشابهة أو مختلفة، وهي تتوسط في تبادل المكونات الخلوية، وهو أمر مهم للحفاظ على الاتزان الداخلي الخلوي. حتى الآن ، تم تحديد العديد من MCSs ، بما في ذلك الشبكة الإندوبلازمية (ER) - الميتوكوندريا ، غشاء ER-plasma (PM) ، وملامسات قطرات الدهون ER (LD)1. من بينها ، تلك التي تشكلت بين ER والميتوكوندريا (MERCSs) هي من بين الأكثر دراسة لأنها تشارك في تنظيم العديد من الوظائف الخلوية ، بما في ذلك توازن الدهون والكالسيوم2. نظرا لأن الميتوكوندريا مستبعدة إلى حد كبير من مسارات النقل الحويصلية الكلاسيكية ، فإنها تعتمد على MERCS وعلى مكوناتها الجزيئية لاستيراد الدهون الرئيسية أو سلائف الدهون من ER. يضمن النقل غير الحويصلي لهذه الدهون عبر MERCSs الحفاظ على التركيب السليم لدهون الميتوكوندريا ، فضلا عن سلامتها الوظيفية والهيكلية3.

نظرا للمشاركة الحاسمة ل MCSs في الوظائف الخلوية المختلفة ، فقد زاد الاهتمام بتوفير فهم أعمق لمكوناتها الجزيئية بشكل كبير في السنوات الأخيرة. تم استخدام عدة أنواع من الأساليب القائمة على التصوير لتعزيز المعرفة حول MCSs. من بينها ، تم استخدام مقايسة ربط القرب القائمة على مسبار التألق (PLA) على نطاق واسع كمؤشر على وفرة MCSs من خلال الكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين بين العضيات (في نطاق الكشف عن 40 نانومتر) عند المستويات الداخلية4. على سبيل المثال ، تم تصور MERCSs وقياسها باستخدام PLA بين العديد من أزواج بروتينات الميتوكوندريا-ER ، بما في ذلك VDAC1-IP3R و GRP75-IP3R و CypD-IP3 و PTPIP51-VAPB5،6،7،8. على الرغم من استخدام هذه التقنية للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين بين العضيات الموجودة في MCS5،7،9،10،11 وتحديدها ، إلا أن معظم الدراسات لم تجمع بين PLA وتلطيخ العضيات. وبالتالي ، لم يتم تطوير طريقة كمية تسمح بقياس القرب بين تفاعلات PLA والعضيات المرتبطة بها. وهكذا ، حتى الآن ، في حالة بروتينات ER ، لم يتم تمييز تفاعلها داخل المجالات الفرعية الغشائية على اتصال مع العضيات الأخرى عن تفاعلها داخل شبكة ER الموزعة على نطاق واسع.

هنا ، نصف بروتوكولا للكشف عن تفاعلات PLA بين البروتينات الموجودة في غشاء نفس العضية وتحليل قربها من غشاء العضية الشريكة في MCS. تم تطوير هذا البروتوكول بناء على فرضيتين: 1) الدراسات السابقة التي تظهر أنه في ظروف التعبير المفرط ، فإن بروتينات نقل الدهون ER ORP5 و ORP8 تتمركز وتتفاعل في ER-mitochondria و ER-PM MCSs12،13،14،15 وأن ORP5 يتمركز في جهات اتصال ER-LD16،17 ؛ 2) التقنيات الحالية ، بما في ذلك جيش التحرير الشعبى الصينى ، المجهر متحد البؤر ، وضع العلامات العضية ، وتحليل التصوير 3D.

Protocol

1. تلطيخ الميتوكوندريا ومقايسة ربط القرب (PLA)

  1. لوحة 0.5 × 10 5-2 × 10 5 خلايا هيلا ، محفوظة في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل ب 10٪ FBS ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 1٪ أحماض أمينية غير أساسية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ، في أغطية زجاجية مقاس 13 مم في ألواح1.5 بوصة من 24 بئرا بتخفيف يسمح بالتقاء الخلايا بنسبة 75٪ -90٪ في يوم الإجراء.
    ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تقديم خلايا HeLa إلى علاجات إضافية ، مثل علاج siRNA و / أو نقل بلازميد الحمض النووي ، قبل تلطيخ الميتوكوندريا و PLA.
  2. تلطيخ الميتوكوندريا
    1. اغسل الخلايا مرة واحدة في وسط خال من المصل تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية. احتضن الخلايا بوسط خال من المصل تم تسخينه مسبقا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    2. تحضير 1 ميكرومتر علامة الميتوكوندريا الحمراء في وسط خال من المصل قبل تسخينه.
    3. احتضان الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول علامة الميتوكوندريا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. أثناء معالجة علامة الميتوكوندريا والخطوات التالية من البروتوكول ، حافظ على الخلايا الموجودة على أغطية الغطاء محمية من الضوء قدر الإمكان.
    4. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا 1x في وسط خال من المصل تم تسخينه مسبقا و 2x في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). نفذ هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن لأن خطوات الغسيل الطويلة قبل التثبيت قد تؤثر على مورفولوجيا الميتوكوندريا.
    5. قم بإزالة 1x PBS من أغطية الغطاء ، وقم بإصلاح الخلايا عن طريق احتضانها في 4٪ PFA محضرة حديثا (في 1x PBS) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (في الظلام) تحت الغطاء الكيميائي. اغسل 3x لمدة 2 دقيقة في 500 ميكرولتر من 1x PBS (باستخدام ماصات يمكن التخلص منها أو نظام تفريغ متصل بمضخة).
    6. قم بإزالة 1x PBS ، واحتضان أغطية الغطاء ب 500 ميكرولتر من 50mM NH4Cl لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (في الظلام). اغسل 1x لمدة 2 دقيقة في 500 ميكرولتر من 1x PSB باستخدام نظام تفريغ.
    7. اغسل 3x لمدة دقيقتين في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع 1 (BB1 ، 1٪ BSA ، 0.1٪ سابونين في 1x PBS) ل ORP5-ORP8 PLA أو المخزن المؤقت المانع 2 (BB2 ، 2٪ BSA ، 0.1٪ مصل الماعز العادي ، 0.1 سابونين في 1x PBS) ل ORP8-PTPIP51 PLA.
    8. انقل أغطية الغطاء من اللوحة المكونة من 24 بئرا إلى غرفة الرطوبة. بعد نقل أغطية الغطاء إلى الغرفة ، أضف 100 ميكرولتر من BB (BB1 أو BB2 ، وفقا لأزواج الأجسام المضادة المستخدمة) لتجنب الجفاف.
      ملاحظة: يمكن الحصول على غرفة الرطوبة المحمية من الضوء بسهولة وسرعة عن طريق لف طبق بتري (بلاستيك أو زجاج) بورق الألمنيوم وإضافة بعض قطع المنشفة الورقية المبللة في محيط طبق بتري.
  3. مقايسة ربط القرب (PLA)
    ملاحظة: يتبع بروتوكول PLA تعليمات الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة.
    1. حضانة الأجسام المضادة الأولية
      1. تحضير حل عمل الأجسام المضادة الأساسي. أرنب مخفف مضاد ORP5 (1: 150) بالإضافة إلى فأر مضاد ل ORP8 (1: 200) في BB1 ، ومضاد للفأر ORP8 (1: 200) بالإضافة إلى أرنب مضاد PTPIP51 (1: 200) في BB2 ، وأرنب مضاد ORP5 (1: 150) بالإضافة إلى PTPIP51 مضاد للفأر (1: 200) في BB1. تحضير (على الأقل) 40 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل غطاء (على سبيل المثال ، 0.27 ميكرولتر من الأرنب المضاد ل ORP5 ، 0.2 ميكرولتر من مضاد ORP8 للفأر ، 39.53 ميكرولتر من BB1).
      2. قم بإزالة BB من الغسيل السابق (الخطوة 1.2.8) باستخدام نظام تفريغ ، وأضف 40 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي إلى أغطية الغطاء. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة الرطوبة المحمية من الضوء.
    2. اغسل أغطية الأغطية 3x لمدة 5 دقائق مع 100 ميكرولتر من BB المقابل باستخدام نظام التفريغ.
    3. حضانة مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى
      1. إعداد حل عمل تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى. تمييع أرنب زائد (1: 5) والماوس ناقص (1: 5) تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى في BB ، وتخلط. لكل غطاء ، قم بإعداد (على الأقل) 40 ميكرولتر من محلول مسبار PLA (على سبيل المثال ، 8 ميكرولتر من مسبار الأرنب PLUS PLA ، 8 ميكرولتر من مسبار الماوس MINUS PLA ، 24 ميكرولتر من BB). اترك محلول مسبار PLA لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
      2. قم بإزالة BB من قسائم الغطاء (من الخطوة 1.3.2) باستخدام نظام تفريغ ، وأضف 40 ميكرولتر من محلول مسبار PLA إلى أغطية الغطاء. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة الرطوبة المحمية من الضوء.
    4. اغسل أغطية الغطاء 2x لمدة 5 دقائق في 100 ميكرولتر من 1x غسل المخزن المؤقت A في درجة حرارة الغرفة.
    5. الربط
      1. تمييع 5x ربط العازلة إلى 1: 5 في الماء النقي للغاية وتخلط. لكل غطاء ، قم بإعداد (على الأقل) 40 ميكرولتر من محلول الربط (8 ميكرولتر من مخزن الربط 5x ، 31 ميكرولتر من الماء النقي للغاية).
      2. أضف الرباط (1 وحدة / ميكرولتر ، يتم توفيره في مجموعة PLA) إلى مخزن ربط واحد تم إعداده في الخطوة السابقة بتخفيف 1:40 ، واخلطه.
      3. قم بإزالة 1x wash buffer A من أغطية الغطاء (من الخطوة 1.3.4) باستخدام نظام تفريغ ، وأضف 40 ميكرولتر من محلول ligase إلى أغطية الغطاء ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطوبة محمية من الضوء.
    6. اغسل أغطية الغطاء 2x لمدة دقيقتين في 100 ميكرولتر من 1x wash buffer A في درجة حرارة الغرفة باستخدام نظام التفريغ.
    7. البلمره
      1. تمييع 5x المخزن المؤقت للتضخيم 1: 5 في الماء النقي للغاية ، ويخلط. لكل قسيمة غطاء ، قم بإعداد (على الأقل) 40 ميكرولتر من محلول التضخيم (8 ميكرولتر من مخزن التضخيم 5x ، 31.5 ميكرولتر من الماء فائق النقاء).
      2. أضف البلمرة (10 وحدة / ميكرولتر ، يتم توفيرها في مجموعة PLA) إلى مخزن البلمرة 1x المحضر في الخطوة السابقة بتخفيف 1:80 ، واخلطه.
      3. قم بإزالة 1x wash buffer A من أغطية الغطاء (من الخطوة 1.3.6) باستخدام نظام تفريغ ، وأضف 40 ميكرولتر من محلول البلمرة إلى أغطية الغطاء ، واحتضانها لمدة 1 ساعة و 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة رطوبة محمية من الضوء.
    8. قم بإزالة محلول البلمرة من أغطية الغطاء ، واغسل 2x لمدة 10 دقائق في 100 ميكرولتر من 1x غسل المخزن المؤقت B في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطوبة محمية من الضوء.
    9. اغسل أغطية الغطاء 1x لمدة دقيقة واحدة في 100 ميكرولتر من 0.001x اغسل المخزن المؤقت B في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطوبة محمية من الضوء.
    10. قم بتركيب أغطية الغطاء على شرائح زجاجية للفحص المجهري باستخدام وسيط تركيب مع DAPI (تركيز بين 1.6-0.4 ميكروغرام / مل). ختم مع طلاء الأظافر.

2. الحصول على الصور

  1. راقب نتائج PLA ، واحصل على صور باستخدام المجهر البؤري الفلوري بهدف غمر الزيت 63x باستخدام البرنامج المصاحب.
  2. اضبط إثارة التألق باستخدام صمام ليزر 405 نانومتر أو ليزر ضوء أبيض ، واجمع النوافذ الطيفية باستخدام GaAsP PMTs أو أجهزة الكشف الهجينة. في كل مستوى بؤري (يمتد 300 نانومتر) ، احصل على إشارات مضان ل PLA (λex = 488 نانومتر ، λem = 505-560 نانومتر) والميتوكوندريا (λex = 543 نانومتر ، λem = 606-670 نانومتر).

3. معالجة الصور وتقييم بقع PLA المرتبطة بالميتوكوندريا

  1. قم بمعالجة الصور متحدة البؤر باستخدام برنامج لتحليل الصور يقوم بإنشاء خرائط المسافة بين المكونات الخلوية. اتبع الخطوات أدناه لإنشاء عمليات إعادة تكوين ثلاثية الأبعاد لبقع PLA وشبكة الميتوكوندريا والوصول إلى المسافة بينهما باستخدام برنامج التصوير الخلوي (الشكل 1).
  2. تثبيت ملحق خريطة المسافة 3D
    1. قم بتثبيت كل من حزمة برامج تحليل الخلايا باستخدام خيار XT وبرنامج MATLAB أو وقت تشغيل مترجم MATLAB فقط (MRC) ، والذي يمكن تنزيله مجانا من موقع الويب.
    2. قم بإعداد برنامج تحليل الخلايا لبدء تشغيل MATLAB عند تشغيل XTension كما يلي: من خيار Imaris (Mac OS X) أو قائمة تحرير (Windows)، حدد تفضيلات، قم بالتغيير إلى لوحة الأدوات المخصصة ، ثم اضبط المسار:
      جيم : \\ ملفات البرنامج \\ ماتلاب \\R201Xa_x64\ بن \\ win64 \\ ماتلاب.exe لنظام التشغيل Windows أو / تطبيقات / MATLAB_R201Xa.app / بن / ماتلاب لنظام التشغيل Mac OS X.
  3. استيراد الصور إلى البرنامج
    1. تحويل صور المكدس متحد البؤر إلى ملف . IMS ، إما مباشرة من خلال قسم Arena أو باستخدام محول الملفات المستقل الذي يسمح بتحويل الدفعات.
    2. بعد الاستيراد، تحقق من أن الصور تظل معايرة بشكل صحيح. انقر فوق تحرير > خصائص الصورة > هندسة الصورة ، وتحقق من أن حجم voxel يتوافق مع X و Y مع حجم البكسل المتوقع للصورة الفعلية (انظر معايرة الصورة في برنامج الاستحواذ) وأن حجم voxel في Z يتوافق مع الخطوة التي يطبقها المجهر لإنشاء مكدس Z. إذا كانت القيم غير صحيحة ، فقم بتعديلها لضمان التقدير الصحيح للمسافات في الخطوات التالية.
    3. اضبط تباين القنوات المختلفة في القائمة ضبط العرض بالنقر فوق تحرير > إظهار تعديل العرض. اضبط كل قناة بشكل مستقل لتحسين عرض كل لون. لا تؤثر هذه الخطوة بشكل مباشر على قيم الصورة ولكنها ضرورية لتعيين عتبات دقيقة أو اكتشاف الكائنات الضعيفة.
    4. قصر التحليل على خلية واحدة عن طريق اقتصاص الصورة باستخدام خيارات تحرير > اقتصاص 3D. لتحليل خلية أخرى في نفس مجال الرؤية ، افتح نفس الصورة مرة أخرى ، وقم باقتصاصها بشكل مختلف.
  4. كشف البقعة ORP5-ORP8
    1. اكتشف إشارات PLA التي تم إنشاؤها في موقع تفاعل ORP5 و ORP8 بالنقر فوق خيار إضافة نقاط جديدة ، والذي ينشئ مجموعة جديدة من الكائنات ويفتح معالج اكتشاف البقعة.
    2. حدد القناة التي يجب إجراء الكشف الفوري عليها.
    3. اضبط قطر XY المقدر (يجب تكييف النطاق إذا اختلف حجم الكائن) لمساعدة خوارزمية اكتشاف البقعة في العثور على الكائنات ذات الأهمية. لاحظ أنه إذا كانت القيمة المختارة عالية جدا ، فسوف تندمج الكائنات القريبة. إذا كانت القيمة صغيرة جدا ، فقد يتم اعتبار إشارة واحدة كائنات متعددة ، أو قد يتم اكتشاف إشارات شاذة.
    4. انقر فوق طرح الخلفية لإزالة خلفية الصورة قبل اكتشاف البقعة لتحسين التباين المحلي حول الكائنات محل الاهتمام.
    5. اضبط عتبة الكشف عن النقاط عن طريق الحفاظ على الجودة (الكثافة في مركز الكائن) كمعلمة العتبة والعتبة التلقائية للبرنامج ، أو قم بتعديل هذه القيمة قليلا لاكتشاف جميع الكائنات. بمجرد الانتهاء من اكتشاف البقعة ، احفظ معلمات الكشف ، وأعد استخدامها لمعالجة الصور الأخرى.
  5. الكشف عن شبكة الميتوكوندريا
    1. اكتشف شبكة الميتوكوندريا لإنشاء تجسيد سطحي بالنقر فوق إضافة أسطح جديدة لإنشاء كائن جديد ، وافتح معالج اكتشاف السطح.
    2. حدد القناة التي يجب إجراء إنشاء السطح عليها.
    3. قم بتطبيق مرشح Gaussian للحصول على سطح أكثر نعومة بالنقر فوق مربع الاختيار Smooth وبتعيين عتبة تشير إلى أصغر التفاصيل التي يمكن ملاحظتها على السطح.
    4. قم بإجراء عملية طرح في الخلفية لتحسين التباينات المحلية وللمساعدة في خطوة العتبة.
    5. اضبط العتبة للكشف عن شبكة الميتوكوندريا بناء على شدة الإشارة. إذا كان من الصعب تعيين العتبة بشكل صحيح ، فمن المستحسن العودة إلى الخطوة السابقة لضبط درجة النعومة وطرح الخلفية.
    6. إذا لزم الأمر ، ضع مرشحا على السطح لإزالة المخلفات الصغيرة الناتجة عن العتبة. للقيام بذلك ، حدد مرشح عدد Voxels في نافذة تصنيف السطح ، والعب مع العتبات العلوية والسفلية للاحتفاظ بالكائنات ذات الاهتمام فقط. بمجرد انتهاء إنشاء السطح ، احفظ معلمات الإنشاء ، وأعد استخدامها لمعالجة الصور الأخرى.
  6. توليد خريطة المسافة 3D حول الميتوكوندريا
    1. قم بإنشاء خريطة مسافة خارج سطح الميتوكوندريا تم إنشاؤها مسبقا على النحو التالي. حدد سطح الميتوكوندريا في مربع شجرة المشهد. انقر فوق معالجة الصور > وظيفة الأسطح > تحويل المسافة. سيؤدي هذا إلى استدعاء Matlab XTension الذي يطلب من المستخدم اختيار ما إذا كان يجب حساب الخريطة خارج سطح الكائن أو داخله.
    2. حدد كائن السطح الخارجي لقياس المسافة بين بقع PLA وسطح الميتوكوندريا. بمجرد إنشائها، تظهر خريطة المسافة كقناة جديدة في لوحة ضبط العرض. في هذه القناة ، كل بكسل له قيمة تتوافق مع المسافة إلى أقرب ميتوكوندريا.
  7. استخلاص مسافات الأجسام من أقرب ميتوكوندريون
    1. لقياس المسافة من كل نقطة إلى أقرب ميتوكوندريا ولتحديد وتصور أقرب النقاط ، حدد النقاط التي تم إنشاؤها مسبقا في مربع شجرة المشهد.
    2. في الإحصائيات والسجل التفصيلي، حدد قيم محددة (للحصول على قياس واحد لكل بقعة). حدد كثافة المركز Ch = X (مع X المقابلة لرقم قناة خريطة المسافة). سيقيس هذا قيمة كل مركز بقعة ، والتي تتوافق مع المسافة إلى أقرب ميتوكوندريون ، في خريطة المسافة.
    3. قم بتصدير البيانات كملف .csv بالنقر فوق رمز القرص المرن في أسفل يسار النافذة.
    4. لاستخراج مجموعة فرعية من البقع بناء على مسافاتها إلى الميتوكوندريا ، حدد البقع في شجرة المشهد ، وانقر فوق علامة التبويب المرشحات .
    5. في هذه النافذة ، أضف مرشحا جديدا يعتمد مرة أخرى على Center Intensity Ch = X ، واستخرج البقع التي تقل عن 380 نانومتر بعيدا عن الميتوكوندريا عن طريق تعيين الحد الأدنى إلى 0 ميكرومتر والعتبة العليا إلى 0.380 ميكرومتر.
      ملاحظة: تم تقدير عتبة 380 نانومتر بناء على تفاعل PLA بما في ذلك الارتباط بين الأجسام المضادة الأولية والثانوية (30 نانومتر) بالإضافة إلى نصف العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) لإشارات تضخيم PLA (350 نانومتر).
    6. للتركيز على النقاط المحددة، وعلى سبيل المثال، إعطائها لونا مميزا، قم بتنفيذ خطوة مضاعفة بالضغط على زر مضاعفة التحديد إلى نقاط جديدة .

النتائج

باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه ، اكتشفنا مواقع تفاعل اثنين من بروتينات نقل الدهون المثبتة على ER ، ORP5 و ORP8 ، وقيمنا حدوثها في المجالات الفرعية لغشاء ER في اتصال مع عضيات أخرى ، على وجه الخصوص ، مع الميتوكوندريا. لذلك ، تم تلطيخ شبكة الميتوكوندريا في خلايا HeLa بعلامة ميتوكوندريا حمراء ، وتم...

Discussion

تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد وقياس تفاعلات PLA بين البروتين بين العضيات في MCSs ، ولا سيما في MERCSs. حداثة البروتوكول هو أنه يجمع بين PLA مع وضع العلامات على عضيات متعددة ، والمجهر متحد البؤر ، وتحليل صور 3D لتوطين وقياس تفاعلات PLA بين بروتينين مقيمين في نفس الغشاء ، في هذه الحالة داخل غشاء ER على م...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD) ، وبرنامج ATIP-Avenir ، ومؤسسة البحوث الطبية (رقم 206548) ، ومؤسسة Vaincre Alzheimer (eOTP: 669122 LS 212527) ، الوكالة الوطنية للبحوث (ANR-11-EQPX-0029 / Morphoscope ، ANR-10-INBS-04 / FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02 / Saclay Plant Sciences).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)Gibco14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl)VWR21236.291
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5Agar ScientificL46R13-15
CMXRos red MitoTrackerInvitrogenM7512red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-XLeicaDMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well PlatesMerckCLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green SigmaDUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI SigmaDUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS SigmaDUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUSSigmaDUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence SigmaDUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement Gibco51985026serum free medium
Imaris software v 9.3BitplaneN/Acell imaging software
Incubator UINCU-line IL10VWR390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) Knittel Glass
mouse anti-ORP8 Santa Cruz134409
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148
rabbit anti-ORP5 SigmaHAP038712
SaponinSigma84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase freeInvitrogen10977-035

References

  1. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287 (2019).
  2. Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
  3. Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
  4. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  5. Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
  6. Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).
  7. Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
  8. Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).
  9. Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).
  10. Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
  11. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
  12. Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  13. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  14. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757 (2017).
  15. Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).
  16. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).
  17. Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 200 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved