Visualización y cuantificación de las interacciones endógenas de proteínas intraorgánulas en los sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad

Resumen

La necesidad de nuevos enfoques para estudiar los sitios de contacto de membrana (MCS) ha crecido debido al creciente interés en el estudio de estas estructuras celulares y sus componentes. Aquí, presentamos un protocolo que integra tecnologías de microscopía previamente disponibles para identificar y cuantificar complejos de proteínas intra-orgánulos e inter-orgánulos que residen en los SQM.

Resumen

Los sitios de contacto de membrana (MCS) son áreas de proximidad cercana a la membrana que permiten y regulan el intercambio dinámico de diversas biomoléculas (es decir, calcio y lípidos) entre los orgánulos yuxtapuestos sin involucrar la fusión de la membrana. Las SQM son esenciales para la homeostasis celular, y sus funciones están aseguradas por los componentes residentes, que a menudo existen como complejos de proteínas multiméricas. Las SQM a menudo involucran el retículo endoplásmico (RE), un sitio importante de síntesis de lípidos y almacenamiento de calcio celular, y son particularmente importantes para los orgánulos, como las mitocondrias, que están excluidos de las vías clásicas de transporte vesicular. En los últimos años, las SQM entre el RE y las mitocondrias han sido ampliamente estudiadas, ya que sus funciones tienen un fuerte impacto en el metabolismo/bioenergética celular. Se han comenzado a identificar varias proteínas en estos sitios de contacto, incluidas las ataduras de membrana, los canales de calcio y las proteínas de transferencia de lípidos, lo que plantea la necesidad de nuevas metodologías y enfoques técnicos para estudiar estos componentes de la SQM. Aquí, describimos un protocolo que consiste en enfoques técnicos combinados, que incluyen el ensayo de ligadura de proximidad (PLA), la tinción de mitocondrias y la segmentación por imágenes 3D, que permite la detección de proteínas que están físicamente cerca (>40 nm) entre sí y que residen en la misma membrana en los MCS ER-mitocondrias. Por ejemplo, utilizamos dos proteínas de transferencia de lípidos ancladas al RE, ORP5 y ORP8, que previamente se ha demostrado que interactúan y se localizan en las MCS de la mitocondria del RE y de la membrana plasmática del RE. Al asociar el PLA ORP5-ORP8 con el análisis de software de imágenes celulares, fue posible estimar la distancia del complejo ORP5-ORP8 desde la superficie mitocondrial y determinar que aproximadamente el 50% de la interacción ORP5-ORP8 PLA ocurre en los subdominios RE en las proximidades de las mitocondrias.

Introducción

La comunicación entre orgánulos es una característica definitoria de las células eucariotas. Una forma en que los orgánulos se comunican es mediante la formación de sitios de contacto de membrana (MCS), que son oposiciones de membrana cercanas entre dos orgánulos que son mantenidas por proteínas estructurales y funcionales, como ataduras, proteínas de transferencia de lípidos y canales de calcio¹. Los SQM pueden establecerse entre orgánulos similares o diferentes, y median el intercambio de componentes celulares, lo cual es importante para mantener la homeostasis celular. Hasta la fecha, se han identificado varias SQM, incluidos los contactos del retículo endoplásmico (RE)-mitocondrias, RE-membrana plasmática (PM) y ER-gotitas lipídicas (LD)¹. Entre ellas, las que se forman entre el RE y las mitocondrias (MERCSs) se encuentran entre las más estudiadas, ya que están implicadas en la regulación de varias funciones celulares, entre ellas la homeostasis lipídica y cálcica². Dado que las mitocondrias están excluidas en gran medida de las vías clásicas de transporte vesicular, dependen de MERCS y de sus constituyentes moleculares para importar lípidos o precursores lipídicos clave del RE. El transporte no vesicular de estos lípidos a través de los MERCS garantiza el mantenimiento de la composición lipídica mitocondrial adecuada, así como su integridad funcional y estructural³.

Dada la participación crucial de las SQM en diversas funciones celulares, el interés por proporcionar una comprensión más profunda de sus componentes moleculares ha aumentado considerablemente en los últimos años. Se han utilizado varios tipos de enfoques basados en imágenes para avanzar en el conocimiento de las SQM. Entre ellos, el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) basado en sonda de fluorescencia ha sido ampliamente utilizado como indicador de la abundancia de SQM mediante la detección de interacciones proteína-proteína entre orgánulos (en un rango de detección de 40 nm) a niveles endógenos⁴. Por ejemplo, los MERCS se han visualizado y cuantificado mediante el uso de PLA entre varios pares de proteínas mitocondrias-ER, incluidos VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 y PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Aunque esta tecnología se ha utilizado para detectar y cuantificar las interacciones proteína-proteína entre orgánulos que están presentes en el MCS 5,7,9,10,11^, la mayoría de los estudios no combinaron PLA con tinción de orgánulos. En consecuencia, aún no se ha desarrollado un método cuantitativo que permita medir la proximidad entre las interacciones del PLA y los orgánulos asociados. Por lo tanto, hasta ahora, en el caso de las proteínas RE, su interacción dentro de los subdominios de membrana en contacto con otros orgánulos no se ha distinguido de su interacción dentro de la red RE ampliamente distribuida.

Aquí, describimos un protocolo para detectar interacciones de PLA entre proteínas que residen en la membrana del mismo orgánulo y analizar su proximidad a la membrana del orgánulo asociado en el MCS. Este protocolo se desarrolló en base a dos premisas: 1) estudios previos que muestran que, en condiciones de sobreexpresión, las proteínas de transferencia de lípidos del RE ORP5 y ORP8 se colocalizan e interactúan en las mitocondrias del RE y en los MCS del RE-PM 12,13,14,15 y que el ORP5 se localiza en los contactos del RE-LD ^16,17; 2) las tecnologías existentes, como el PLA, la microscopía confocal, el marcaje de orgánulos y el análisis de imágenes en 3D.

Protocolo

1. Tinción mitocondrial y ensayo de ligadura de proximidad (PLA)

1. Placa 0,5 x 10 5-2 x 10 5 5 células HeLa, mantenidas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de aminoácidos no esenciales a 37 °C con 5% de CO₂, en cubreobjetos de vidrio de 13 mm en placas de^1,5 en 24 pocillos a una dilución que permite una confluencia celular del 75%-90% el día del procedimiento.
   NOTA: Cabe destacar que las células HeLa pueden someterse a tratamientos adicionales, como el tratamiento con siRNA y/o la transfección de plásmidos de ADN, antes de la tinción mitocondrial y el PLA.
2. Tinción mitocondrial
   1. Lavar las células una vez en un medio sin suero precalentado a 37 °C. Incubar las células con medio precalentado sin suero durante 10 min a 37 °C con 5% de CO₂.
   2. Prepare 1 μM de marcador mitocondrial rojo en medio libre de suero precalentado.
   3. Incubar las células con 500 μL de solución marcadora mitocondrial durante 30 min a 37 °C con 5% de CO₂. Durante el tratamiento con marcadores mitocondriales y los siguientes pasos del protocolo, mantenga las células en cubreobjetos protegidas de la luz tanto como sea posible.
   4. Después de la incubación, lavar las células 1 vez en medio libre de suero precalentado y 2 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Realice este paso lo más rápido posible, ya que los largos pasos de lavado antes de la fijación pueden afectar la morfología mitocondrial.
   5. Retire el 1x PBS de los cubreobjetos y fije las células incubándolas en PFA al 4% recién preparado (en 1x PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente (en la oscuridad) bajo la cubierta química. Lavar 3 veces durante 2 minutos en 500 μL de 1x PBS (usando pipetas desechables o un sistema de vacío conectado a una bomba).
   6. Retire el 1x PBS e incube los cubreobjetos con 500 μL de 50 mM de NH₄Cl durante 15 min a temperatura ambiente (en la oscuridad). Lavar 1 vez durante 2 minutos en 500 μL de 1x PSB utilizando un sistema de vacío.
   7. Lavar 3 veces durante 2 min en 500 μL de tampón de bloqueo 1 (BB1, 1% BSA, 0,1% saponina en 1x PBS) para el PLA ORP5-ORP8 o tampón de bloqueo 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% suero normal de cabra, 0,1 saponina en 1x PBS) para el ORP8-PTPIP51 PLA.
   8. Transfiera los cubreobjetos de la placa de 24 pocillos a una cámara de humedad. Después de transferir los cubreobjetos a la cámara, agregue 100 μL de BB (BB1 o BB2, según los pares de anticuerpos utilizados) para evitar la sequedad.
      NOTA: Se puede obtener fácil y rápidamente una cámara de humedad protegida de la luz envolviendo una placa de Petri (plástico o vidrio) en papel de aluminio y agregando algunos trozos de toalla de papel húmeda en la periferia de la placa de Petri.
3. Ensayo de ligadura de proximidad (PLA)
   NOTA: El protocolo PLA sigue las instrucciones del fabricante con ligeras modificaciones.
   1. Incubación primaria de anticuerpos
      1. Prepare la solución de trabajo de anticuerpos primarios. Diluir anti-ORP5 de conejo (1:150) más anti-ORP8 de ratón (1:200) en BB1, anti-ORP8 de ratón (1:200) más anti-PTPIP51 de conejo (1:200) en BB2 y anti-ORP5 de conejo (1:150) más anti-PTPIP51 de ratón (1:200) en BB1. Prepare (al menos) 40 μL de solución de anticuerpos primarios por cubreobjetos (p. ej., 0,27 μL de anti-ORP5 de conejo, 0,2 μL de anti-ORP8 de ratón, 39,53 μL de BB1).
      2. Retire el BB del lavado anterior (paso 1.2.8) mediante un sistema de vacío y añada 40 μL de solución primaria de anticuerpos a los cubreobjetos. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara de humedad protegida de la luz.
   2. Lave los cubreobjetos 3 veces durante 5 minutos con 100 μL del BB correspondiente utilizando el sistema de vacío.
   3. Incubación de sondas de PLA
      1. Prepare la solución de trabajo de las sondas PLA. Diluir las sondas de PLA de conejo PLUS (1:5) y MINUS (1:5) de ratón en BB y mezclar. Para cada cubreobjetos, prepare (al menos) 40 μL de solución de sonda de PLA (p. ej., 8 μL de sonda de PLA PLUS de conejo, 8 μL de sonda de PLA MENOS de ratón, 24 μL de BB). Deje reposar la solución de la sonda de PLA durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de usarla.
      2. Retire el BB de los cubreobjetos (a partir del paso 1.3.2) utilizando un sistema de vacío y añada 40 μL de solución de sonda de PLA a los cubreobjetos. Incubar durante 1 h a 37°C en una cámara de humedad protegida de la luz.
   4. Lave los cubreobjetos 2 veces durante 5 min en 100 μL de 1 tampón de lavado A a temperatura ambiente.
   5. Ligadura
      1. Diluir el tampón de ligadura 5x a 1:5 en agua ultrapura y mezclar. Para cada cubreobjetos, prepare (al menos) 40 μL de solución de ligadura (8 μL de tampón de ligadura 5x, 31 μL de agua ultrapura).
      2. Añadir la ligasa (1 U/μL, suministrada en el kit de PLA) a 1x tampón de ligadura preparado en el paso anterior a una dilución de 1:40, y mezclar.
      3. Retirar 1x tampón de lavado A de los cubreobjetos (a partir del paso 1.3.4) mediante un sistema de vacío, añadir 40 μL de solución de ligasa a los cubreobjetos e incubar durante 30 min a 37 °C en una cámara de humedad protegida de la luz.
   6. Lave los cubreobjetos 2 veces durante 2 minutos en 100 μL de 1 tampón de lavado A a temperatura ambiente utilizando el sistema de aspiración.
   7. Polimerización
      1. Diluir 5 tampones de amplificación 1:5 en agua ultrapura y mezclar. Para cada cubreobjetos, prepare (al menos) 40 μl de solución de amplificación (8 μl de tampón de amplificación 5x, 31,5 μl de agua ultrapura).
      2. Añadir la polimerasa (10 U/μL, suministrada en el kit de PLA) al tampón de polimerización 1x preparado en el paso anterior a una dilución de 1:80, y mezclar.
      3. Retirar 1x tampón de lavado A de los cubreobjetos (del paso 1.3.6) mediante un sistema de vacío, añadir 40 μL de solución de polimerasa a los cubreobjetos e incubar durante 1 h 40 min a 37 °C en una cámara de humedad protegida de la luz.
   8. Retire la solución de polimerasa de los cubreobjetos y lave 2 veces durante 10 min en 100 μL de 1 tampón de lavado B a temperatura ambiente en una cámara de humedad protegida de la luz.
   9. Lave los cubreobjetos 1 vez durante 1 min en 100 μL de 0,001x tampón de lavado B a temperatura ambiente en una cámara de humedad protegida de la luz.
   10. Monte los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio para microscopía utilizando un medio de montaje con DAPI (concentración entre 1,6-0,4 μg/mL). Sella con esmalte de uñas.

2. Adquisición de imágenes

1. Observe los resultados del PLA y adquiera imágenes mediante microscopía confocal de fluorescencia con un objetivo de inmersión en aceite de 63x utilizando el software adjunto.
2. Establezca la excitación de fluorescencia con un diodo láser de 405 nm o un láser de luz blanca, y recoja las ventanas espectrales con PMT de GaAsP o detectores híbridos. En cada plano focal (que abarca 300 nm), adquiera las señales de fluorescencia para PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) y mitocondrias (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).

3. Procesamiento de imágenes y evaluación de manchas de PLA asociadas a mitocondrias

1. Procese las imágenes confocales utilizando un software para el análisis de imágenes que genera mapas de distancia entre los componentes celulares. Siga los pasos que se indican a continuación para generar reconstituciones 3D de los puntos de PLA y la red mitocondrial y para acceder a la distancia entre ellos mediante un software de imágenes celulares (Figura 1).
2. Instalación de la extensión de mapa de distancia 3D
   1. Instale tanto el paquete de software de análisis celular con la opción XT como el software de MATLAB o solo un tiempo de ejecución del compilador de MATLAB (MRC), que se puede descargar gratuitamente desde el sitio web.
   2. Configure el software de análisis celular para iniciar MATLAB cuando se inicie un XTension de la siguiente manera: en la opción Imaris (Mac OS X) o en el menú Editar (Windows), seleccione Preferencias, cambie al panel Herramientas personalizadas y, a continuación, establezca la ruta:
      C:\Archivos de programa\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe para Windows o/Aplicaciones/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab para Mac OS X.
3. Importar las imágenes al software
   1. Convierta las imágenes de pila confocal en un archivo . IMS, ya sea directamente a través de la sección Arena o utilizando el convertidor de archivos independiente que permite la conversión por lotes.
   2. Después de la importación, compruebe que las imágenes permanezcan correctamente calibradas. Haga clic en Editar > Propiedades de la imagen > Geometría de la imagen y compruebe que el tamaño del vóxel corresponde en X e Y al tamaño de píxel esperado para la imagen real (consulte la calibración de la imagen en el software de adquisición) y que el tamaño del vóxel en Z corresponde al paso aplicado por el microscopio para generar la pila Z. Si los valores no son correctos, modifíquelos para garantizar una estimación correcta de las distancias en los siguientes pasos.
   3. Ajuste el contraste de los diferentes canales en el menú Ajuste de pantalla haciendo clic en Editar > Mostrar ajuste de pantalla. Ajuste cada canal de forma independiente para optimizar la visualización de cada color. Este paso no afecta directamente a los valores de la imagen, pero es esencial para establecer umbrales precisos o detectar objetos débiles.
   4. Limite el análisis a una sola celda recortando la imagen con las opciones Editar > Recortar 3D. Para analizar otra celda en el mismo campo de visión, abra la misma imagen una vez más y recórtela de manera diferente.
4. Detección puntual ORP5-ORP8
   1. Detecte las señales PLA generadas en la ubicación de la interacción de ORP5 y ORP8 haciendo clic en la opción Agregar nuevos puntos, que crea un nuevo conjunto de objetos y abre el asistente de detección de puntos.
   2. Seleccione el canal en el que se debe realizar la detección puntual.
   3. Ajuste el diámetro XY estimado (el rango debe adaptarse si el tamaño del objeto difiere) para ayudar al algoritmo de detección de puntos a encontrar los objetos de interés. Tenga en cuenta que si el valor elegido es demasiado alto, los objetos cercanos se fusionarán. Si el valor es demasiado pequeño, una señal puede considerarse como varios objetos, o se pueden detectar señales aberrantes.
   4. Haga clic en Sustracción de fondo para eliminar el fondo de la imagen antes de la detección puntual para mejorar el contraste local alrededor de los objetos de interés.
   5. Ajuste el umbral de detección puntual manteniendo la calidad (intensidad en el centro del objeto) como parámetro de umbral y el umbral automático del software, o modifique ligeramente este valor para detectar todos los objetos. Una vez finalizada la detección puntual, guarde los parámetros de detección y reutilícelos para procesar otras imágenes.
5. Detección de redes mitocondriales
   1. Detecte la red mitocondrial para generar una representación de superficie haciendo clic en Agregar nuevas superficies para crear un nuevo objeto y abra el asistente de detección de superficies.
   2. Seleccione el canal en el que se debe realizar la creación de superficies.
   3. Aplique un filtro gaussiano para obtener una superficie más suave haciendo clic en la casilla de verificación Suavizar y estableciendo un umbral que indique los detalles más pequeños observables en la superficie.
   4. Realice una resta de fondo para mejorar los contrastes locales y ayudar con el paso de umbral.
   5. Ajuste el umbral para detectar la red mitocondrial en función de la intensidad de la señal. Si es difícil establecer correctamente el umbral, se recomienda volver al paso anterior para ajustar el grado de suavidad y la resta de fondo.
   6. Si es necesario, aplique un filtro en la superficie para eliminar los pequeños residuos resultantes del umbral. Para ello, seleccione el filtro Número de vóxeles en la ventana de clasificación de superficie y juegue con los umbrales superior e inferior para mantener solo los objetos de interés. Una vez finalizada la creación de la superficie, guarde los parámetros de creación y reutilícelos para procesar otras imágenes.
6. Generación del mapa de distancias 3D alrededor de las mitocondrias
   1. Genere un mapa de distancia fuera de la superficie mitocondrial creado previamente de la siguiente manera. Seleccione la superficie de las mitocondrias en el cuadro del árbol de escenas. Haga clic en Procesamiento de imágenes > Función de superficies > Transformación de distancia. Esto llamará a un Matlab XTension que pide al usuario que elija si el mapa debe calcularse fuera o dentro de la superficie del objeto.
   2. Seleccione Objeto de superficie exterior para medir la distancia entre los puntos de PLA y la superficie de las mitocondrias. Una vez generado, el mapa de distancia aparece como un nuevo canal en el panel de ajuste de visualización. En este canal, cada píxel tiene un valor correspondiente a la distancia a la mitocondria más cercana.
7. Extracción de las distancias de los objetos a la mitocondria más cercana
   1. Para medir la distancia desde cada punto hasta la mitocondria más cercana e identificar y visualizar las más cercanas, seleccione los puntos generados previamente en el cuadro del árbol de escenas.
   2. En las estadísticas y el registro detallado, seleccione Valores específicos (para obtener una medición para cada punto). Seleccione Intensidad central Ch=X (donde X corresponde al número del canal del mapa de distancia). Esto medirá el valor de cada centro puntual, que corresponde a su distancia a la mitocondria más cercana, en el mapa de distancias.
   3. Exporte los datos como un archivo .csv haciendo clic en el icono de disquete en la parte inferior izquierda de la ventana.
   4. Para extraer una subpoblación de puntos en función de sus distancias a las mitocondrias, seleccione los puntos en el árbol de escenas y haga clic en la pestaña Filtros .
   5. En esta ventana, agregue un nuevo filtro basado una vez más en la intensidad central Ch=X, y extraiga los puntos a menos de 380 nm de distancia de las mitocondrias estableciendo el umbral inferior en 0 μm y el umbral superior en 0,380 μm.
      NOTA: El umbral de 380 nm se estimó sobre la base de una reacción de PLA que incluía la asociación entre los anticuerpos primarios y secundarios (30 nm) más la mitad del ancho total a la mitad del máximo (FWHM) de las señales de amplificación de PLA (350 nm).
   6. Para enfocar las manchas seleccionadas y, por ejemplo, darles un color distinto, realice un paso de duplicación pulsando el botón Duplicar selección a nuevas tintas .

Resultados

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, detectamos los sitios de interacción de dos proteínas de transferencia de lípidos ancladas al RE, ORP5 y ORP8, y evaluamos su ocurrencia en los subdominios de la membrana del RE en contacto con otros orgánulos, en particular, con las mitocondrias. Para ello, se tiñó la red mitocondrial en las células HeLa con un marcador mitocondrial rojo, y se detectaron puntos verdes de PLA ORP5-ORP8 después de la fijación utilizando los anticuerpos primarios anti-ORP5 y anti-ORP...

Discusión

Este protocolo fue diseñado para identificar y cuantificar las interacciones de PLA entre las proteínas de los orgánulos en los SQM, en particular en los MERCS. La novedad del protocolo es que combina el PLA con el marcaje de múltiples orgánulos, la microscopía confocal y el análisis de imágenes 3D para localizar y cuantificar las interacciones del PLA entre dos proteínas que residen en la misma membrana, en este caso dentro de la membrana del RE en estrecha proximidad con la membrana de las mitocondrias (MAM) o...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)	Gibco	14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl)	VWR	21236.291
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5	Agar Scientific	L46R13-15
CMXRos red MitoTracker	Invitrogen	M7512	red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-X	Leica	DMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates	Merck	CLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma	DUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma	DUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma	DUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	51985026	serum free medium
Imaris software v 9.3	Bitplane	N/A	cell imaging software
Incubator UINCU-line IL10	VWR	390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“)	Knittel Glass
mouse anti-ORP8	Santa Cruz	134409
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
rabbit anti-ORP5	Sigma	HAP038712
Saponin	Sigma	84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free	Invitrogen	10977-035