JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لزرع عضويات الكلى في التجويف السيلومي لأجنة الدجاج. تحفز هذه الطريقة الأوعية الدموية والنضج المعزز للعضويات في غضون 8 أيام ويمكن استخدامها لدراسة هذه العمليات بطريقة فعالة.

Abstract

تحتوي عضويات الكلى المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان على هياكل تشبه النيفرون تشبه تلك الموجودة في الكلى البالغة إلى حد ما. لسوء الحظ ، فإن قابليتها للتطبيق السريري يعوقها عدم وجود الأوعية الدموية الوظيفية وبالتالي النضج المحدود في المختبر. إن زرع عضويات الكلى في التجويف السيلومي لأجنة الدجاج يحفز الأوعية الدموية عن طريق الأوعية الدموية المثقوبة ، بما في ذلك تكوين الشعيرات الدموية الكبيبية ، ويعزز نضجها. هذه التقنية فعالة للغاية ، مما يسمح بزرع وتحليل أعداد كبيرة من المواد العضوية. تصف هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للزرع الداخلي لعضويات الكلى في أجنة الدجاج ، يليه حقن الليكتين المسمى بالفلورسنت لتلطيخ الأوعية الدموية المثقوبة ، وجمع المواد العضوية المزروعة لتحليل التصوير. يمكن استخدام هذه الطريقة للحث على دراسة الأوعية الدموية العضوية والنضج للعثور على أدلة لتعزيز هذه العمليات في المختبر وتحسين نمذجة المرض.

Introduction

لقد ثبت أن عضويات الكلى المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC) لديها إمكانات للدراسات التنموية1،2،3،4 ، وفحص السمية 5،6 ، ونمذجة المرض5،7،8،9،10،11،12،13. ومع ذلك ، فإن قابليتها للتطبيق لهذه الأغراض وأغراض الزرع السريري في نهاية المطاف محدودة بسبب عدم وجود شبكة الأوعية الدموية. أثناء نمو الكلى الجنينية ، تتفاعل الخلايا القلبية والخلايا المتوسطة والخلايا البطانية الوعائية (ECs) لتشكيل البنية المعقدة للكبيبة. بدون هذا التفاعل ، لا يمكن أن يتطور حاجز الترشيح الكبيبي ، الذي يتكون من الخلايا الدموية ، والغشاء القاعدي الكبيبي (GBM) ، و ECs ، بشكل صحيح14،15،16. على الرغم من أن عضويات الكلى في المختبر تحتوي على بعض ECs ، إلا أنها تفشل في تكوين شبكة أوعية دموية مناسبة وتتضاءل بمرور الوقت17. لذلك ليس من المستغرب أن تظل الكائنات العضوية غير ناضجة. زرع في الفئران يحفز الأوعية الدموية ونضوج عضويات الكلى18،19،20،21. لسوء الحظ ، هذه عملية كثيفة العمالة وغير مناسبة لتحليل أعداد كبيرة من المواد العضوية.

تم استخدام أجنة الدجاج لدراسة الأوعية الدموية وتطورها لأكثر منقرن 22. يمكن الوصول إليها بسهولة ، وتتطلب صيانة منخفضة ، وتفتقر إلى نظام مناعي يعمل بكامل طاقته ، ويمكن أن تتطور بشكل طبيعي بعد فتح قشر البيض23،24،25،26. ثبت أن زرع المواد العضوية على الغشاء المشيمي الولعي (CAM) يؤدي إلى الأوعية الدموية27. ومع ذلك ، فإن مدة الزرع على CAM ، وكذلك مستوى نضوج الكسب غير المشروع ، محدودة بتكوين الطب التكميلي والبديل ، والذي يستغرق حتى اليوم الجنيني 7 حتى يكتمل. لذلك ، تم تطوير طريقة مؤخرا لكفاءة الأوعية الدموية وعضويات الكلى الناضجة من خلال زرع inenterlomic في أجنة الدجاج28. من المعروف أن التجويف السيلومي لأجنة الدجاج منذ ثلاثينيات القرن العشرين هو بيئة مواتية لتمايز الأنسجة الجنينية29,30. يمكن الوصول إليه في وقت مبكر من التطور الجنيني ويسمح بتوسع غير محدود نسبيا للكسب غير المشروع في جميع الاتجاهات.

تحدد هذه الورقة بروتوكولا لزرع عضويات الكلى المشتقة من hiPSC في التجويف السيلومي لأجنة الدجاج في اليوم 4. هذه الطريقة تحفز الأوعية الدموية وتعزيز نضوج المواد العضوية في غضون 8 أيام. يتيح حقن عدسة كوليناريس أغلوتينين (LCA) ذات العلامات الفلورية قبل التضحية بالأجنة تصور الأوعية الدموية المثقوبة داخل المواد العضوية من خلال الفحص المجهري متحد البؤر.

Protocol

وفقا للقانون الهولندي ، لم تكن موافقة لجنة رعاية الحيوان مطلوبة لهذا البحث.

1. تحضير عضويات الكلى المشتقة من hiPSC للزراعة

  1. قم بتمييز hiPSCs إلى عضويات الكلى باستخدام البروتوكول الذي طوره Takasato et al.4،18،31. استزراع الكائنات العضوية التي تتبع هذا البروتوكول على إدراج زراعة خلايا البوليستر مع مسام 0.4 ميكرومتر (إدراج زراعة الخلية) حتى اليوم 7 + 12 من التمايز. سيحتوي كل إدراج لثقافة الخلية على ثلاثة عضويات.
  2. إزالة المواد العضوية من إدراج ثقافة الخلية.
    1. اصنع ثقبا في منتصف غشاء ثقافة الخلية مع زوج من ملقط التشريح. باستخدام مقص التشريح ، قم بإجراء ثلاث جروح في الغشاء من الفتحة الموجودة في المنتصف إلى حافة إدراج ثقافة الخلية ، مع القطع بين المواد العضوية. سيؤدي ذلك إلى ثلاث قطع من الغشاء ، لكل منها عضو عضوي واحد متصل ، والتي لا تزال متصلة بإدراج ثقافة الخلية عند حافتها الخارجية.
    2. أمسك بإحدى قطع الغشاء بالقرب من حافتها الخارجية بزوج من الملقط وقم بتمزيقها من إدخال مزرعة الخلية. ضع قطعة الغشاء مع العضو العضوي المرفق في طبق بتري. أضف بضع قطرات من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS-/-) إلى العضو العضوي لتجنب الجفاف. كرر للعضوين الآخرين.
  3. قم بتقسيم المواد العضوية عن طريق تثبيت غشاءها في مكانه بالملقط وتقطيعها إلى نصفين بشفرة حلاقة مزدوجة الحافة من الفولاذ المقاوم للصدأ (العضو العضوي بالكامل كبير جدا بحيث لا يمكن للسيلوم استيعابه في هذه المرحلة من التطور). ادفع النصفين العضويين برفق عن الغشاء باستخدام تشريح الجافية. تخلص من الغشاء واترك المواد العضوية في DPBS-/- حتى الزرع.
    ملاحظة: قم بإعداد ثلاثة عضويات كحد أقصى في وقت واحد للزرع لتجنب الإجهاد على الكائنات العضوية قبل الزرع. من الناحية المثالية ، يقوم شخص ما بإعداد المواد العضوية بينما يقوم شخص آخر بإجراء عملية الزرع.

2. تحضير أجنة الدجاج للزراعة

  1. احتضان بيض ليغورن الأبيض المخصب. ابدأ حضانة البويضات في يوم تمايز أعضاء الكلى 7 + 8 لضمان التوقيت الصحيح للزرع.
    1. ضع بيض قرن الساق الأبيض المخصب (Gallus domesticus) أفقيا على حامل (الشكل 1 أ ؛ اليوم 0) ، بمناسبة منتصف الجانب المواجه لأعلى بقلم رصاص.
      ملاحظة: يمكن استخدام حوامل بلاستيكية مصنوعة حسب الطلب أو كرتون بيض كحوامل لاحتضان البيض.
    2. ضع الحامل مع البيض في حاضنة مرطبة عند 38 ± 1 درجة مئوية (الشكل 1 أ ؛ اليوم 0).
    3. احتضان البيض لمدة 3 أيام ، والحفاظ على حوض الماء في الحاضنة مملوءة.
  2. إنشاء نافذة في قشر البيض في يوم 3 من الحضانة.
    1. في اليوم 3 من الحضانة ، ضع قطعة صغيرة (~ 1 سم × 0.5 سم) من الشريط الشفاف على الطرف المدبب للبيضة (نهاية صغيرة). اصنع ثقبا صغيرا في قشر البيض في منتصف الشريط الشفاف عن طريق النقر عليه بنهاية حادة لزوج من مقص التشريح.
    2. أدخل إبرة 19 جم على حقنة سعة 5 مل في الحفرة بزاوية 45 درجة ، وتجنب تلف كيس الصفار ، ونضح 2-3 مل من الزلال من البويضة لخفض الجنين داخل البويضة. أغلق الفتحة بقطعة ثانية (~ 1 سم × 0.5 سم) من الشريط الشفاف.
    3. ضع قطعة كبيرة (~ 5 سم × 5 سم) من الشريط الشفاف على الجانب المواجه لأعلى من البيضة المحدد بالقلم الرصاص. اصنع ثقبا في قشر البيض في منتصف الشريط الشفاف عن طريق النقر عليه بالطرف الحاد لزوج من مقص التشريح (الشكل 1 أ ؛ اليوم 3).
    4. بدءا من هذه الحفرة ، قم بقص نافذة دائرية صغيرة في قشر البيض باستخدام مقص تشريح منحني. انظر من خلال هذه النافذة لتحديد موقع الجنين ، ثم قم بتكبير النافذة لتحسين الوصول إلى الجنين (الشكل 1 أ ؛ اليوم 3).
    5. قم بإزالة أي قطع كبيرة من قشر البيض قد تكون سقطت فوق الجنين باستخدام ملقط. قم بإزالة القطع الصغيرة عن طريق وضع بضع قطرات من DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS +/+) على الجنين باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، ثم استنشاق DPBS +/+ مع قشر البيض في الماصة.
    6. أضف ثلاث قطرات من DPBS +/+ مع 0.5٪ بنسلين / ستربتومايسين إلى البويضة باستخدام ماصة نقل بلاستيكية.
    7. أغلق النافذة بعناية بقطعة كبيرة (~ 5 سم × 5 سم) من الشريط الشفاف قبل إعادة البويضة إلى الحاضنة حتى اليوم الرابع من الحضانة ، عندما يكون الجنين في مرحلة هامبرغر هاميلتون 23-24 (HH 23-24) 32.
      ملاحظة: إغلاق النافذة مهم جدا لتجنب الجفاف وموت الجنين.
    8. افحص الأجنة يوميا للتأكد من صلاحيتها من خلال النظر إليها من خلال الشريط (لا تقم بإزالة الشريط لتجنب الجفاف). خلال هذه الأيام الأولى من الحضانة ، يتغير لون صفار البيض من الأصفر الفاتح إلى الأصفر غير اللامع عند موت الجنين. تخلص من الأجنة المتوفاة.
    9. الحفاظ على حوض الماء في الحاضنة مملوءة.

3. زرع Inenterlomic في اليوم 4 من الحضانة

  1. الوصول إلى التجويف السيلومي
    1. قطع الشريط من النافذة مع مقص تشريح منحني.
    2. ضع البيضة تحت مجهر تشريح على حامل مطاطي أو كرتون بيض.
    3. جنين الدجاج الآن في HH 23-24 وملقى على جانبه الأيسر ، وجانبه الأيمن يواجه المشاهد (الشكل 1 أ ؛ اليوم 4). حدد موقع الجناح الأيمن وبرعم الساق للجنين ، حيث سيتم الوصول إلى السيلوم بين هذين البرعمين الطرفين. في المنطقة الواقعة بين الجناح الأيمن وبرعم الساق ، قم بإنشاء فتحة متتالية في غشاء vitelline ، والمشيم ، والسلى ، عن طريق إمساكها بزوجين من ملقط التشريح وسحبها برفق في اتجاهين متعاكسين.
      ملاحظة: غشاء vitelline هو الغشاء الأول الذي تتم مواجهته بعد فتح البويضة ، وفي بعض الحالات ، يكون تالفا بالفعل بعد صنع النافذة في اليوم 3. إذا كان الجنين يدور ، مستلقيا على جانبه الأيمن مع مواجهة جانبه الأيسر للمشاهد (الشكل 1 أ ؛ اليوم 4) ، من الضروري قلبه لتمكين الزرع. للقيام بذلك ، قم بعمل فتحة كبيرة في غشاء vitelline والغشاء المشيمي ، ثم أدر الجنين بعناية باستخدام ملقط.
    4. تحقق مما إذا كان هناك وصول دون عائق إلى التجويف السيلومي: أمسك برفق بحافة جدار الجسم بين الجناح وبرعم الطرف بزوج من ملقط التشريح واسحبه قليلا نحو المشاهد. يجب أن يكون التجويف السيلومي مرئيا بوضوح. أدخل بعناية أداة حادة ولكن رفيعة (على سبيل المثال ، سلك تنغستن حاد في حامل مشرط دقيق) في التجويف السيلومي.
      ملاحظة: إذا كان إدخال الأداة الحادة في التجويف السيلومي غير ممكن ، فهذا يعني أن واحدا أو أكثر من الأغشية لم يتم فتحه بشكل صحيح.
  2. زرع
    1. ضع نصف عضوي داخل البيضة فوق الألانتوا باستخدام تشريح الجافية.
    2. باستخدام ملقط تشريح ، أمسك بعناية بحافة جدار الجسم واسحبها قليلا نحو المشاهد لجعل فتحة السيلوم مرئية.
      ملاحظة: تجنب إتلاف الأوعية الدموية في جدار الجسم.
    3. حرك العضو العضوي برفق نحو ومن خلال الفتحة الموجودة في جدار الجسم إلى السيلوم باستخدام سلك تنغستن حاد في حامل مشرط دقيق. ادفع العضو العضوي قليلا إلى الجمجمة لوضعه داخل السيلوم. يمكن رؤيته الآن خلف برعم الجناح مباشرة (الشكل 1 أ ؛ اليوم 4).
    4. أضف ثلاث قطرات من DPBS +/+ إلى البيضة باستخدام ماصة نقل بلاستيكية.
    5. أغلق النافذة بعناية بقطعة كبيرة (~ 5 سم × 5 سم) من الشريط الشفاف قبل وضع البويضة مرة أخرى في الحاضنة حتى اليوم 12 من الحضانة (8 أيام بعد الزرع).
    6. استمر في فحص الأجنة يوميا للتأكد من صلاحيتها من خلال النظر إليها من خلال الشريط (لا تقم بإزالة الشريط لتجنب الجفاف). تخلص من الأجنة المتوفاة.
      ملاحظة: مع نمو الأجنة وأغشيتها المشيمية ، تصبح مرئية بشكل أكثر وضوحا من خلال الشريط. قلة حركة الجنين والأوعية الدموية المنهارة أو المتناثرة هي علامة على موت الجنين.
    7. تحقق من حوض الماء في الحاضنة يوميا واحتفظ به ممتلئا.

4. حقن الليكتين المسمى بالفلورسنت

  1. التحضير للحقن
    1. اصنع إبر الحقن المجهري الزجاجي عن طريق سحب الشعيرات الزجاجية الدقيقة في مجتذب ماصة بالإعدادات التالية: الحرارة 533 ، السحب 60 ، السرعة 150 ، الوقت 200. أثناء النظر من خلال مجهر التشريح ، قم بقطع النصائح بعناية عن إبر الحقن المجهري باستخدام ملقط تشريح لإنشاء فتحة.
      ملاحظة: قد تختلف الإعدادات المطلوبة لمجتذب الماصة الدقيقة وفقا للماكينة.
    2. تجميع نظام الحقن. خذ قطعتين من أنابيب السيليكون 38 سم وقم بتوصيلهما ببعضهما البعض عن طريق وضع مرشح 0.2 ميكرومتر بينهما. أدخل قطعة فم في نهاية الأنبوب المتصل بمخرج المرشح (أنبوب السيليكون 1) ، وموصل بنهاية الأنبوب المتصل بمدخل المرشح (أنبوب السيليكون 2). أخيرا ، أدخل إبرة الحقن المجهري في الموصل (الشكل 1 ب).
    3. تمييع عدسة كوليناريس agglutinin المسمى بالفلورسنت (LCA) مع DPBS-/- إلى تركيز 2.5 ملغ مل -1 في أنبوب 0.5 مل وتدور لأسفل لمدة ~ 30 ثانية في جهاز طرد مركزي دقيق لنقل الركام إلى أسفل الأنبوب.
    4. ماصة 20 ميكرولتر من LCA على قطعة من البارافيلم.
    5. نضح 20 ميكرولتر من LCA من parafilm إلى إبرة الشعيرات الدموية الدقيقة لنظام الحقن المجمع.
  2. حقن
    1. قطع الشريط من النافذة مع مقص تشريح منحني. ضع البيضة تحت مجهر تشريح في حامل مطاطي.
    2. تقييم الأوعية الدموية وتحديد الأوردة ، والتي يمكن تمييزها عن الشرايين بلونها الأحمر الأكثر إشراقا قليلا (الشكل 1 أ ؛ اليوم 12). لتحسين الوصول إلى الأوعية الدموية ، قم بتكبير النافذة بعناية عن طريق القطع بمقص تشريح منحني. حدد الوريد للحقن بناء على إمكانية الوصول والحجم.
    3. أدخل طرف إبرة الشعيرات الدموية الدقيقة في الوريد المحدد بزاوية 0 درجة -20 درجة. تأكد من وجود الإبرة في الوريد عن طريق تحريك الطرف برفق من جانب إلى آخر. نفخ بلطف وثبات في نظام الحقن لحقن LCA (الشكل 1A ؛ اليوم 12).
      ملاحظة: إذا كانت الإبرة في الوريد في الموضع الصحيح ، فيجب أن تبقى داخل حدود الوريد.
    4. ضع البيضة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 10 دقائق للسماح ل LCA بالدوران.
      ملاحظة: ليس من الضروري إغلاق البيضة بشريط خلال هذا الوقت.

5. جمع المواد العضوية المزروعة في اليوم 12 من الحضانة

  1. التضحية بجنين الدجاج
    1. ضع البيضة في حامل مطاطي على المقعد. قطع الشريط من النافذة مع مقص تشريح منحني. ثم ، قطع الأغشية المحيطة بالجنين بمقص تشريح منحني.
      ملاحظة: لا يلزم وجود مجهر تشريح لهذه الخطوة.
    2. اغرف الجنين من البيضة بملعقة مثقبة وقطع رأس الجنين على الفور باستخدام المقص. ضع جسم الجنين في طبق بتري تحت مجهر التشريح.
  2. تحديد وجمع المواد العضوية
    1. ضع الجنين على ظهره في طبق بتري وانشر أطرافه.
    2. افتح بعناية جدار البطن للجنين على طول المحور الطولي باستخدام ملقط.
    3. حدد موقع العضو العضوي داخل الجنين. غالبا ما يتم ربط العضو العضوي بفص الكبد الأيمن ، إما عند الطرف الذيلي أو أسفل القفص الصدري مباشرة (الشكل 1 أ ؛ اليوم 12). لذلك يوصى بالبدء بالبحث في هذه المواقع.
    4. بمجرد تحديد موقع العضو العضوي ، قم بإزالته من الجنين عن طريق قطعه بمقص صغير. ضع العضو العضوي وأنسجة الدجاج المرتبطة به حتما في طبق بتري تحت مجهر التشريح. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من مناديل الدجاج باستخدام شفرة حلاقة مزدوجة الحواف من الفولاذ المقاوم للصدأ.
    5. معالجة العضو العضوي اعتمادا على التحليل المطلوب.

6. تلطيخ مناعي كامل التركيب

  1. ضع العضو العضوي المزروع في صفيحة من 24 بئرا وقم بتثبيته في 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة. اغسل 3x باستخدام DPBS-/-.
  2. تتخلل وتمنع العضو العضوي في 300 ميكرولتر من محلول الحجب (0.3٪ Triton-X في DPBS- / - يحتوي على 10٪ مصل حمار) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحضير مزيج الأجسام المضادة الأولية: لواحد عضوي ، تمييع الأجسام المضادة الأولية NPHS1 (الأغنام α الإنسان ، تخفيف 1: 100) ، CD31 (الفأر α الإنسان ، تخفيف 1: 100) ، و LTL (البيوتين المترافق ، تخفيف 1: 300) في 300 ميكرولتر من محلول الحظر. أضف مزيج الأجسام المضادة إلى العضو العضوي واحتضانه لمدة 72 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل 3x مع 0.3٪ TritonX في DPBS-/-.
  5. تحضير مزيج الأجسام المضادة الثانوية: لواحد عضوي ، تمييع الأجسام المضادة الثانوية حمار α الأغنام Alexa Fluor 647 (تخفيف 1: 500) ، حمار α فأر Alexa Fluor 488 (تخفيف 1: 500) ، و streptavidin Alexa Fluor 405 (تخفيف 1: 200) في 300 ميكرولتر من محلول الحظر. أضف مزيج الأجسام المضادة الثانوي إلى العضو العضوي واحتضانه لمدة 2-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. قم بتغطيتها بورق الألمنيوم لتجنب تعرض الأجسام المضادة الثانوية للضوء.
  6. اغسل 3x باستخدام DPBS-/-.
  7. قم بتضمين العضو العضوي في ~ 30 ميكرولتر من وسط التركيب في طبق سفلي زجاجي 35 مم واتركه يجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة ، مغطى بورق الألمنيوم. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  8. صورة باستخدام مجهر متحد البؤر.

النتائج

تم تلخيص الطريقة والجدول الزمني لتمايز hiPSCs إلى عضويات الكلى ، وحضانة بيض الدجاج المخصب ، وزرع عضويات الكلى ، وحقن LCA ، وجمع المواد العضوية في الشكل 1 أ. من المهم تنسيق توقيت التمايز العضوي وحضانة بيض الدجاج ، بدءا من التمايز قبل 15 يوما من الحضانة. يتم توضيح الإجراءات في اليو?...

Discussion

في هذه المخطوطة ، تم عرض بروتوكول للزرع داخل المخ لعضويات الكلى المشتقة من hiPSC في أجنة الدجاج. عند الزرع ، يتم الأوعية الدموية العضوية بواسطة الأوعية الدموية المثقوبة التي تتكون من مزيج من ECs المشتقة من الأعضاء البشرية والمشتقة من الدجاج. تنتشر هذه في جميع أنحاء العضوية وتغزو الهياكل الكبي...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

نشكر جورج غالاريس (LUMC ، ليدن ، هولندا) على مساعدته في حقن أجنة الدجاج. نحن نعترف بدعم ساسكيا فان دير وال ماس (قسم التشريح وعلم الأجنة ، LUMC ، ليدن ، هولندا) ، كوني فان مونستيرين (قسم التشريح وعلم الأجنة ، LUMC ، ليدن ، هولندا) ، مانون زورموند (LUMC ، ليدن ، هولندا) ، وآن ماري دي غراف (LUMC ، ليدن ، هولندا). M. Koning مدعوم من قبل 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل صندوق جامعة ليدن "صندوق البروفيسور ياب دي جراف لينجلينج ويادهانرما" GWF2019-02. يتم دعم هذا العمل من قبل شركاء الطب التجديدي عبر الحدود (RegMedXB) و Health Holland ، أعلى قطاع علوم الحياة والصحة. يتم دعم C.W. van den Berg و T.J. Rabelink من قبل مركز مؤسسة نوفو نورديسك لطب الخلايا الجذعية (reNEW) ، ويتم دعم مركز مؤسسة نوفو نورديسك لطب الخلايا الجذعية من خلال منح مؤسسة نوفو نورديسك (NNF21CC0073729).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µmWhatman10462200
35 mm glass bottom dishes MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettesSigma-AldrichA5177-5EAContains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope LeicaTCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tipsHammacher KarlHAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tipsHammacher KarlHAMMHTC090-11
Dissecting microscope Wild Heerbrugg355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharpHammacher KarlHAMMHSB391-10
Donkey serumSigma-AldrichD9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-212-02dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA-21448dilution 1:500
Double edged stainless steel razor bladesElectron Microsopy Sciences72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)ThermoFisher Scientific14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)ThermoFisher Scientific14190094
Egg cartons or custom made egg holders NANA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) Drost Loosdrecht B.V.NA
IncubatorElbanton BVET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) BiotinylatedVector LaboratoriesB-1325dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mmHammacher KarlHAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filamentWorld Precision InstrumentsTW150F-3
Micropipette pullerSutter Instrument CompanyModel P-97We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.EuronexiaL-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant ThermoFisher ScientificP36930
Olivecrona dura dissector 18 cm Reda41146-18
Parafilm Heathrow ScientificHS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mLThermoFisher Scientific15070063
Perforated spoon EuronexiaS-20-P
Petri dish 60 x 15 mm CELLSTAR628160
Plastic transfer pipettes ThermoFisher ScientificPP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibodyBD Biosciences555444dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)Vector LaboratoriesRL-1042This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibodyR&D systemsAF4269dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 GBD microlance301500
Streptavidin Alexa Fluor 405ThermoFisher ScientificS32351dilution 1:200
Syringe 5 mLBD Emerald307731
Transparent tape Tesa4124Available at most hardware stores
Triton XSigma-AldrichT9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia ThermoFisher Scientific010404.H2

References

  1. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  2. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  3. Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
  4. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  5. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167 (2018).
  6. Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943 (2022).
  7. Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
  8. Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
  9. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
  10. Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
  11. Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772 (2022).
  12. Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866 (2022).
  13. Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
  14. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  15. Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
  16. Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
  17. Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
  18. vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
  19. Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
  20. Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
  21. vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
  22. Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
  23. Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
  24. Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
  25. Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
  26. Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
  27. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
  28. Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40 (2022).
  29. Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
  30. Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
  31. Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
  32. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  33. Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
  34. . ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 192

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved