通过鸡胚胎的腹内移植对肾脏类器官进行有效的血管化

摘要

在这里，我们提出了在鸡胚胎的天体腔中移植肾脏类器官的详细方案。该方法在8天内诱导类器官的血管形成和增强成熟，可用于以有效的方式研究这些过程。

摘要

源自人类诱导的多能干细胞的肾脏类器官含有肾单位样结构，在一定程度上类似于成人肾脏中的结构。不幸的是，由于缺乏功能性脉管系统，因此体 外成熟有限，它们的临床适用性受到阻碍。在鸡胚胎的天体腔中移植肾脏类器官通过灌注血管诱导血管形成，包括肾小球毛细血管的形成，并增强其成熟。这种技术非常有效，可以移植和分析大量的类器官。本文描述了鸡胚胎中肾类器官的细胞内移植的详细方案，然后注射荧光标记的凝集素以染色灌注的脉管系统，并收集移植的类器官进行成像分析。该方法可用于诱导和研究类器官血管化和成熟，以寻找在 体外 增强这些过程和改善疾病建模的线索。

引言

人类诱导的多能干细胞（hiPSC）来源的肾脏类器官已被证明具有^{发育研究的潜力}1，²，³，^4，毒性筛查5，⁶和疾病建模⁵，⁷，⁸，⁹，^10，11，^12，13.然而，由于缺乏血管网络，它们对这些和最终临床移植目的的适用性受到限制。在胚胎肾脏发育过程中，足细胞、系膜细胞和血管内皮细胞 （EC） 相互作用形成肾小球的复杂结构。没有这种相互作用，由足细胞、肾小球基底膜（GBM）和EC组成的肾小球滤过屏障就无法正常发育¹⁴，^15，16。尽管体外的肾脏类器官确实含有一些EC，但这些EC无法形成适当的血管网络并随着时间的推移而减少¹⁷。因此，类器官仍然不成熟也就不足为奇了。小鼠移植诱导肾脏类器官¹⁸，^19，20，21的血管化和成熟。不幸的是，这是一个劳动密集型过程，不适合分析大量类器官。

一个多世纪以来，鸡胚一直被用来研究血管形成和发育²²。它们易于接近，需要低维护，缺乏功能齐全的免疫系统，并且在打开蛋壳^{23，24，25，26}后可以正常发育。类器官在其脉络膜尿囊膜（CAM）上的移植已被证明可导致血管形成²⁷。然而，CAM上的移植持续时间以及移植物的成熟水平受到CAM形成的限制，CAM形成需要直到胚胎第7天才能完成。因此，最近开发了一种通过鸡胚胎中鞘内移植来有效血管化和成熟肾脏类器官的方法²⁸。自 1930 年代以来，众所周知，鸡胚胎的天体腔是胚胎组织分化的有利环境^29，30。它可以在胚胎发育的早期进入，并允许移植物在各个方向上相对无限地扩张。

本文概述了在第 4 天鸡胚胎的天体腔中移植 hiPSC 衍生的肾类器官的方案。该方法在8天内诱导类器官的血管形成和增强成熟。在牺牲胚胎之前注射荧光标记的晶状体凝集素（LCA），可以通过共聚焦显微镜可视化类器官内的灌注血管。

研究方案

根据荷兰法律，这项研究不需要动物福利委员会的批准。

1. 制备用于移植的hiPSC来源的肾类器官

1. 使用高里等人开发的协议将hiPSCs与肾脏类器官分化4，^18，31。按照该协议在具有0.4μm孔的聚酯细胞培养插入物（细胞培养插入物）上培养类器官，直到分化的第7 + 12天。每个细胞培养插入片段将包含三个类器官。
2. 从细胞培养插入物中取出类器官。
   1. 用一对解剖钳在细胞培养插入物的膜中间开一个孔。使用解剖剪刀，从中间的孔到细胞培养插入物的边缘在膜上切开三个切口，在类器官之间切割。这将产生三片膜，每片膜连接一个类器官，它们仍然连接到其外边缘的细胞培养插入物。
   2. 用一对镊子抓住靠近其外边缘的一块膜，并将其从细胞培养插入物上撕开。将带有附着类器官的膜片放入培养皿中。在类器官中加入几滴不含钙和镁（DPBS-^/-）的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS），以避免脱水。对其他两个类器官重复此操作。
3. 通过用镊子将其膜固定到位并用双刃不锈钢剃须刀片将它们切成两半（整个类器官太大，塞隆无法适应这个发育阶段），从而将类器官一分为二。用硬脑膜解剖器轻轻地将两个类器官的两半从膜上推开。丢弃膜并将类器官留在DPBS-^/- 中，直到移植。
   注意:一次最多准备三个类器官进行移植，以避免移植前对类器官的压力。理想情况下，一个人准备类器官，而另一个人进行移植。

2. 准备移植鸡胚

1. 孵化受精白腿角卵。在第7 + 8天开始在肾脏类器官分化时孵化卵子，以确保移植的正确时间。
   1. 将受精的白腿角卵（家畜瘿） 水平放置在支架上（图1A; 第 0 天），用铅笔标记朝上一侧的中间。
      注意:定制的塑料支架或鸡蛋盒都可以用作支架来孵化鸡蛋。
   2. 将装有鸡蛋的支架置于38±1ºC的加湿培养箱中（图1A; 第 0 天）。
   3. 将种蛋孵化 3 天，保持孵化器中的水盆充满。
2. 在孵化的第3天在蛋壳中创建一个窗口。
   1. 在孵化的第3天，将一小块（~1厘米x 0.5厘米）透明胶带放在鸡蛋的尖头（小端）。用一把解剖剪刀的锋利末端敲击透明胶带中间的蛋壳，在蛋壳上打一个小孔。
   2. 将 5 mL 注射器上的 19 G 针头以 45° 角插入孔中，避免损坏卵黄囊，并从卵子中吸出 2-3 mL 蛋白以降低卵子内的胚胎。用第二块（~1 cm x 0.5 cm）透明胶带密封孔。
   3. 将一大块（~5 厘米 x 5 厘米）透明胶带放在鸡蛋的铅笔标记的朝上一侧。用一把解剖剪刀的尖端敲击透明胶带中间的蛋壳，在蛋壳上打一个洞（图1A; 第3天）。
   4. 从这个洞开始，用弯曲的解剖剪刀在蛋壳上剪一个小圆形窗口。通过此窗口查看以找到胚胎，然后放大窗口以优化对胚胎的访问（图1A; 第3天）。
   5. 用镊子去除任何可能落在胚胎顶部的大块蛋壳。用塑料移液管将几滴含有钙和镁的DPBS滴在胚胎上（DPBS+/+），然后用蛋壳将DPBS^+/+吸入移液器中，以取出较小的碎片。
   6. 使用塑料移液管将三滴补充有 0.5% 青霉素/链霉素的 DPBS^+/+ 添加到鸡蛋中。
   7. 用一大块（~5 cm x 5 cm）透明胶带小心地密封窗口，然后将鸡蛋放回培养箱中，直到孵化的第 4 天，此时胚胎处于汉堡-汉密尔顿阶段 23-24 （HH 23-24）³²。
      注意:密封窗口对于避免胚胎脱水和死亡非常重要。
   8. 每天通过胶带观察胚胎的生存能力（不要取下胶带以避免脱水）。在孵化的最初几天，胚胎死亡后蛋黄颜色从明亮变为哑光黄色。丢弃已故胚胎。
   9. 保持培养箱中的水盆充满。

3.孵育第4天的腹内移植

1. 进入天体腔
   1. 用弯曲的解剖剪刀从窗户上剪下胶带。
   2. 将鸡蛋放在橡胶架或鸡蛋盒上的解剖显微镜下。
   3. 鸡胚现在处于 HH 23-24 中，位于左侧，右侧面向观察者（图 1A; 第4天）。找到胚胎的右翼和腿芽，因为塞隆将在这两个肢芽之间进入。在右翼和腿芽之间的区域，用两对解剖镊子握住它们并轻轻地将它们拉向相反的方向，在卵黄膜、绒毛膜和羊膜上连续开一个开口。
      注意:卵黄膜是打开鸡蛋后遇到的第一个膜，在某些情况下，在第 3 天开窗后已经损坏。如果胚胎旋转，则躺在其右侧，左侧面向观察者（图1A; 第4天），有必要将其转过来以使移植成为可能。为此，在卵黄和绒毛膜上开一个大口，然后用镊子小心地转动胚胎。
   4. 检查是否有畅通无阻的进入天体腔:用一对解剖镊子轻轻抓住翅膀和肢芽之间的体壁边缘，并将其稍微拉向观察者。天体腔必须清晰可见。小心地将钝而纤细的器械（例如，微型手术刀支架中的钝钨丝）插入天体腔。
      注意:如果无法将钝器插入天体腔，则表示一个或多个膜未正确打开。
2. 移植
   1. 使用硬脑膜解剖器将半个类器官放在蛋内尿囊顶部。
   2. 使用解剖镊子，小心地抓住体壁的边缘，并将其稍微拉向观察者，以使塞隆的开口可见。
      注意:避免损坏体壁中的血管。
   3. 用微手术刀支架中的钝钨丝轻轻地将类器官移向并通过体壁的开口进入赛隆。稍微颅推类器官，使其卡在塞隆内。现在在翼芽后面可以看到它（图1A; 第4天）。
   4. 使用塑料移液管将三滴DPBS^+/+ 添加到鸡蛋中。
   5. 用一大块（~5 cm x 5 cm）透明胶带小心地密封窗口，然后将鸡蛋放回孵化器中，直到孵化第 12 天（移植后 8 天）。
   6. 每天通过胶带观察胚胎的生存能力（不要取下胶带以避免脱水）。丢弃已故胚胎。
      注意:随着胚胎及其脉络膜尿囊膜的生长，它们通过胶带变得更加清晰可见。胚胎缺乏运动和血管塌陷或稀疏是胚胎死亡的标志。
   7. 每天检查培养箱中的水盆并保持充满。

4.注射荧光标记的凝集素

1. 准备注射
   1. 通过在微量移液器拉拔器中拉动玻璃微毛细管来制作玻璃显微注射针，设置如下: 加热533，拉60，速度150，时间200。通过解剖显微镜观察时，使用解剖镊子小心地将尖端从显微注射针上折断以形成一个开口。
      注意:微量移液器拉拔器所需的设置可能因机器而异。
   2. 组装注射系统。取两根 38 厘米硅胶管，通过在它们之间放置一个 0.2 μm 过滤器将它们相互连接。将吹嘴插入与过滤器出口连接的管端（硅胶管 1），并将连接器插入与过滤器入口连接的管端（硅胶管 2）。最后，将显微注射针插入连接器（图1B）。
   3. 用DPBS-^/- 将荧光标记的晶状体凝集素（LCA）稀释至0.5 mL管中的2.5 mg ^mL-1 浓度，并在微量离心机中向下旋转~30 s，将聚集体移动到管底部。
   4. 将 20 μL LCA 移液到一块封口膜上。
   5. 将 20 μL LCA 从封口膜中吸入组装好的进样系统的微毛细管针中。
2. 注射
   1. 用弯曲的解剖剪刀从窗户上剪下胶带。将鸡蛋放在橡胶架中的解剖显微镜下。
   2. 评估脉管系统并定位静脉，静脉可以通过其略亮的红色与动脉区分开来（图1A; 第12天）。为了改善对脉管系统的访问，请用弯曲的解剖剪刀切割来小心地扩大窗口。根据可及性和大小选择要注射的静脉。
   3. 将微毛细管针尖以0°-20º角插入所选静脉。通过轻轻地将尖端从一侧移动到另一侧来确保针头在静脉中。轻轻稳定地吹入注射系统以注入LCA（图1A; 第12天）。
      注意:如果静脉中的针头处于正确的位置，则应保持在静脉边界内。
   4. 将鸡蛋放回培养箱中10分钟，让LCA循环。
      注意:在此期间，无需用胶带密封鸡蛋。

5. 在孵育的第 12 天收集移植的类器官

1. 牺牲鸡胚
   1. 将鸡蛋放入长凳上的橡胶架中。用弯曲的解剖剪刀从窗户上剪下胶带。然后，用弯曲的解剖剪刀切开胚胎周围的膜。
      注意:此步骤不需要解剖显微镜。
   2. 用穿孔的勺子从鸡蛋中舀出胚胎，并立即用剪刀将胚胎斩首。将胚胎的身体放在解剖显微镜下的培养皿中。
2. 定位和收集类器官
   1. 将胚胎仰卧在培养皿中并展开四肢。
   2. 使用镊子沿纵轴小心地打开胚胎的腹壁。
   3. 在胚胎内找到类器官。类器官最常附着在右肝叶上，无论是在尾端还是在肋骨正下方的颅骨上（图1A; 第12天）。因此，建议从查看这些位置开始。
   4. 找到类器官后，用微型剪刀将其从胚胎中取出。将类器官和不可避免地附着在其上的鸡组织放在解剖显微镜下的培养皿中。用双刃不锈钢剃须刀片尽可能多地去除鸡肉组织。
   5. 根据所需的分析处理类器官。

6. 全接口免疫荧光染色

1. 将移植的类器官置于24孔板中，并在4°C下固定在500μL4%多聚甲醛（PFA）中24小时。用^DPBS清洗3次。
2. 在室温下将类器官在300μL封闭溶液^（含有 10%驴血清的DPBS中的0.3%Triton-X）中透化并封闭2小时。
3. 制备一抗混合物:对于一个类器官，在 300 μL 封闭溶液中稀释一抗 NPHS1（绵羊α人，稀释度为 1:100）、CD31（小鼠α人，稀释度为 1:100）和 LTL（生物素偶联，稀释度为 1:300）。将抗体混合物添加到类器官中，并在4°C下孵育72小时。
4. 用 0.3% TritonX 在 ^{DPBS 中}洗涤 3 倍。
5. 制备二抗混合物:对于一种类器官，在 300 μL 封闭溶液中稀释驴α羊 Alexa Fluor 647（稀释度为 1:500）、驴α小鼠 Alexa Fluor 488（稀释度为 1:500）和链霉亲和素 Alexa Fluor 405（稀释度为 1:200）。将二抗混合物添加到类器官中，并在室温下孵育2-4小时。用铝箔覆盖，以避免二抗暴露在光线下。
6. 用^DPBS清洗3次。
7. 将类器官嵌入 35 mm 玻璃底培养皿中的 ~30 μL 封片剂中，并在室温下干燥过夜，并用铝箔覆盖。储存在4°C。
8. 使用共聚焦显微镜成像。

结果

图1A总结了hiPSCs分化为肾类器官、受精鸡蛋孵化、肾类器官移植、LCA注射和类器官收集的方法和时间表。协调类器官分化和鸡蛋孵化的时间很重要，在孵化前 15 天开始分化。孵化第 0、3、4 和 12 天的操作由时间线下方的照片说明。类器官在分化的第7 + 12天移植到第4天（HH 23-24）鸡胚中。移植后8天将LCA注射到胚胎的静脉系统中，以染色灌注的脉管系统，然后牺牲胚胎并取回类...

讨论

在这份手稿中，展示了鸡胚胎中hiPSC衍生的肾类器官的细胞内移植方案。移植后，类器官通过灌注的血管进行血管化，这些血管由人类器官来源和鸡来源的EC的组合组成。它们遍布整个类器官并侵入肾小球结构，使EC和足细胞之间的相互作用成为可能。先前表明，这导致类器官肾小球和管状结构的成熟增强²⁸。移植非常有效，每个胚胎需要~5分钟，胚胎唯一需要的维护是定期补充培...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm	Whatman	10462200
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma-Aldrich	A5177-5EA	Contains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope	Leica	TCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips	Hammacher Karl	HAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips	Hammacher Karl	HAMMHTC090-11
Dissecting microscope	Wild Heerbrugg	355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp	Hammacher Karl	HAMMHSB391-10
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-212-02	dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-21448	dilution 1:500
Double edged stainless steel razor blades	Electron Microsopy Sciences	72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)	ThermoFisher Scientific	14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)	ThermoFisher Scientific	14190094
Egg cartons or custom made egg holders	NA	NA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)	Drost Loosdrecht B.V.	NA
Incubator	Elbanton BV	ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated	Vector Laboratories	B-1325	dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm	Hammacher Karl	HAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament	World Precision Instruments	TW150F-3
Micropipette puller	Sutter Instrument Company	Model P-97	We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.	Euronexia	L-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36930
Olivecrona dura dissector 18 cm	Reda	41146-18
Parafilm	Heathrow Scientific	HS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL	ThermoFisher Scientific	15070063
Perforated spoon	Euronexia	S-20-P
Petri dish 60 x 15 mm	CELLSTAR	628160
Plastic transfer pipettes	ThermoFisher Scientific	PP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibody	BD Biosciences	555444	dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)	Vector Laboratories	RL-1042	This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibody	R&D systems	AF4269	dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 G	BD microlance	301500
Streptavidin Alexa Fluor 405	ThermoFisher Scientific	S32351	dilution 1:200
Syringe 5 mL	BD Emerald	307731
Transparent tape	Tesa	4124	Available at most hardware stores
Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia	ThermoFisher Scientific	010404.H2